Name: direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

ونشكر وانغ إيفلين وهايد غريغوري (معهد وايتهيد، كامبريدج، ماجستير) للاستنساخ وهارفي لوديش (معهد وايتهيد) لتوفير العديد من البلازميدات المستخدمة لإنشاء مكتبة للفيروسات الرجعية. ونحن نشكر مجاهد سيفا وصوفي سينجبرانت (قسم الطب الجزيئي والعلاج الجيني، وجامعة لوند) وكارلسون غوران سونيجي شامية (قسم أمراض الدم الجزيئية، جامعة لوند) لأدوارها في وصف لإنتاج iEP. ونود أيضا تقر وأن تشكر بوليسيو جوليان (مركز الطب التجديدي، ومجمع البحوث الطبية الحيوية برشلونة)، فيوليتا رايون-استرادا (روكفلر جامعة نيويورك)، وكارل والكليي (معهد "البحوث الطبية في" سانت فنسنت و قسم للطب، مستشفى سانت فنسنت، جامعة ملبورن)، أنخل الراية (المؤسسة الكتلانية للبحوث والدراسات المتقدمة، برشلونة)، وفيجاي غ. سانكاران (معهد واسع من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا وجامعة هارفارد، كمبردج ) لمساهماتها السابقة في هذا العمل. هذا العمل كان يدعمها راغنار سودربيرغ المؤسسة (J.F.)؛ البحوث السويدية مجلس (J.F.)؛ هيروكي ستيفتيلسين انجكفيست Byggmästare (إلى J.F.)؛ المؤسسة السويدية للبحوث الاستراتيجية (ل J.F.)؛ المؤسسة أك ويبيرج (J.F.)؛ ماري كوري تكامل منحة (J.F.).

1-إنشاء وصيانة ذيل الماوس الأساسي تلميح الثقافات تنتجها الخلايا الليفية
<ol><li>إعداد أطباق الجيلاتين المغلفة (يوصي طبق 10 سم للذيل واحد) التي تغطي السطح مع الجيلاتين 0.1% وحضانة الأطباق لمدة 20 دقيقة تقريبا في 37 درجة مئوية. نضح الحل الجيلاتين من الطبق والسماح لها الجاف ح 2 على الأقل.</li>
	<li>Euthanize ا?...

<ol>
	<li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+We+Really+Vastly+Outnumbered?+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans.">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li><li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+multilineage+blood+progenitors.">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li><li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li><li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors.">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li><li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors.">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li><li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversions:+unnatural+but+useful.">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li><li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox.">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li><li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion.">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li><li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+reprogramming:+a+two-way+street.">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li><li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+couples+erythropoiesis,+B-lymphopoiesis,+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment.">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li><li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage.">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways.">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).</li><li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors.">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li><li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells.">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).</li></ol>

Overexpression كوكتيل أربعة معامل، GATA1، TAL1، LMO2، و ج-حركة (جتلم)، غير كافية لإعادة برمجة الخلايا الليفية مورين والبشرية مباشرة إلى المقدمة10. الخلايا محمر أعيدت برمجتها تشبه إلى حد كبير حسن النية محمر موروث من حيث مورفولوجي...

خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) ضرورية في جميع الفقاريات ويشكلون نسبة 84 في المائة من كافة الخلايا من الهيئات البشرية1. من الجنينية إلى حياة الكبار، صحتنا تعتمد اعتماداً كبيرا على التنظيم الدقيق للتوازن ربك. من المعروف استمرار الإنتاج لكرات الدم الحمراء الناضجة في جميع أنحاء التنمية في مرحلة البلوغ تكون الكريات الحمر. تحديا رئيسيا في تكون الكريات الحمر للبحث هو تحديد الجهات التنظيمية الرئيسية التي تنسق التنمية ربك والتبديل بين البدائية ونهائية تكون الكريات الحمر. النسب المباشر إعادة برمجة المتكفل محمر فرصة لزيادة فهم التنمية محمر في فيفو.
النسب المباشر برمجة (DLR)، المعروفة أيضا باسم ترانسديفيرينتييشن، هو عملية إعادة برمجة واحدة من نوع الخلية مباشرة إلى آخر، تجاوز pluripotent ومراحل السلف مولتيبوتينت. وقد استخدمت حتى الآن DLR لإنتاج العديد من أنواع الخلايا بما في ذلك العصبية2و المكونة للدم3،،من45، والكبد6 والكلوية7، خلايا السلف. لعلماء الأحياء التنموي، أصبح DLR أداة هامة لاستجواب جوانب الالتزام بالنسب والتمايز المحطة الطرفية عمليات8،9. يمكن تكمل DLR واستبدال جزئيا في فيفو دراسات لفهم آليات لمصير الخلية العوامل المحددة أثناء التطوير. وينص البروتوكول DLR لإعادة برمجة لموروث محمر المبينة في هذه الورقة الحقل طريقة مجانية للدراسات التنموية لتكون الكريات الحمر.
وقد أثبتنا سابقا أن overexpression كوكتيل أربعة معامل، GATA1، TAL1، LMO2، و ج-حركة (جتلم)، كافية لإعادة برمجة الليفية مورين والبشرية على السواء مباشرة إلى فروعه محمر المستحث (المقدمة) 10-الخلايا محمر "جتلم" برمجة يشابه إلى حد كبير حسن النية محمر البدائية موروث من حيث التعبير مورفولوجيا والنمط الظاهري والجيني10. وهكذا المقدمة قد حدت من قدرة الانتشار وناضجة للكريات الحمراء المنواه مماثلة لتلك التي تنتجها عابر في الجنين المبكر قبل بداية نهائي تكون الكريات الحمر. عن طريق إجراء تغييرات في شروط إعادة برمجة (مثل الطفرات في إعادة برمجة العوامل أو إضافة عوامل أخرى)، يمكننا أن نفهم كيف يؤدي ذلك إلى تغييرات في التنمية محمر والتمايز. ونحن على سبيل المثال أظهرت أن Klf1 أو Myb بالإضافة إلى كوكتيل جتلم تغيير نمط التعبير جلوبين من الدرجة الأولى الجنينية (البدائية) للكبار أساسا (نهائي). وهذا الاستنتاج يؤكد صلاحية استخدام DLR كأداة لتحديد العوامل التنموية في تكون الكريات الحمر.
هنا، فإننا مخطط عملية توليد المقدمة من ذيل الماوس نصيحة الليفية (الصناديق الاستئمانية). في نتائج تمثيلية، أجرينا إعادة برمجة في الخلايا الليفية من الفئران تتبع النسب محمر (ابور-لجنة المساواة العرقية R26-ايفب) الذي يعرب عن البروتين نيون أصفر (ايفب) من محور Rosa26 في جميع الخلايا التي أعرب عن مستقبلات ارثروبويتين، السماح للتصور من السهل الالتزام بنسب محمر. باستخدام هذا الأسلوب، يفب الإيجابية (+ ابور) خلايا موجودة لها في أقرب وقت بعد توصيل خمسة أيام. ويوفر هذا البروتوكول، ولذلك، تقنية سريعة وقوية لتوليد محمر فروعه في المختبر.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1141px;" width="1142">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM without sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:505px;">Culturing media for PhGP cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM with sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30243.01</td>
			<td>Culturing media for tail tip fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)</td>
			<td style="width:167px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:123px;">9650</td>
			<td>Reprogramming media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum HyClone</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30071.03HI</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td>Antiboiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Non-Essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">11140050</td>
			<td>SNL media is suppplemented with this</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Trypsin HyClone (1x)</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30042.01</td>
			<td>Cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Murine Stem Cell Factor (mSCF)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">250-03</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Recombinant Murine Il-3</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">213-13</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">human recombinant erythropoietin (hrEPO)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-64</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">50-02-2&#160;&#160;</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">9000-70-8&#160;</td>
			<td>Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Blasticidin S hydrochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">3/9/3513</td>
			<td>Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30850.03</td>
			<td>Used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>Infection / Transfection&#160; Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:167px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td>Transfection Reagent for PhGP cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">BD Emerald Hypodermic Syringe</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">SKU: 307736</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm Culture Dish</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">10799541</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Jeweler Forceps #5</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">66-7642</td>
			<td>Used for handling small tail fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Sklarlite Iris Scissors</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">23-1149</td>
			<td>Used for cutting the tail into small pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:123px;">130-090-858</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">CD117 MicroBeads, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PheonixGP cells</td>
			<td style="width:167px;">ATCC</td>
			<td>CRL-3215</td>
			<td>retroviral packaging cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">EcoPAC vector (pCL-Eco)&#160;</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-29540</td>
			<td>retroviral helper vector containing gag and pol genes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Gata1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Tal1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Lmo2</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-cMyc</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellSens Standard 1.6 software&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Cytospin analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors

الالتزام خلية محمر والتمايز المضي قدما من خلال تفعيل شبكة النسخي مقيدة بالنسب مدبرة من قبل مجموعة من مصير الخلية تحديد ونضج العوامل. ونحن المبينة سابقا لتحديد الحد الأدنى لعدد من العوامل اللازمة لإرشاد وتطوير خلايا الدم الحمراء باستخدام النسب المباشر إعادة برمجة الخلايا الليفية في محمر المستحث المتكفل/السلائف (المقدمة). لقد أظهرنا أن overexpression من Gata1، Tal1، Lmo2، و جيم-حركة (جتلم) يمكن سرعة تحويل موريني والبشرية الليفية مباشرة إلى المقدمة التي تشبه الخلايا محمر حسن النية من حيث التشكل، النمط الظاهري، والتعبير الجيني. ونحن نعتزم أن المقدمة ستوفر أداة لا تقدر بثمن لدراسة اللائحة مصير تكون الكريات الحمر والخلية. هنا يصف لنا عملية تدريجية لتحويل ذيل موريني نصيحة الليفية في المقدمة عن طريق النسخ يحركها عامل مباشرة نسب إعادة برمجة (DLR). في هذا المثال، نقوم بإعادة برمجة في الخلايا الليفية من الفئران محمر تتبع النسب التي تعبر عن البروتين نيون أصفر (يفب) تحت سيطرة المروج الجينات (ابور) مستقبلات ارثروبويتين، تمكين التصور خلية محمر مصير الحث على إعادة برمجة. وفي أعقاب هذا البروتوكول، يمكن أن تعاد برمجتها الليفية في المقدمة في غضون خمسة إلى ثمانية أيام.
بينما لا يزال يمكن إدخال تحسينات على العملية، ونحن تبين أن جتلم بوساطة إعادة برمجة عملية سريعة ومباشرة، مما أسفر عن الخلايا التي تحتوي على خصائص من حسن النية الخلايا السلف والسلائف محمر.

وهنا يقدم بروتوكول استنساخه لإنتاج المقدمة من الكبار الليفية استخدام النسخ DLR يحركها عامل. نقوم بتقييم الخلية إعادة برمجة استخدام التدفق الخلوي وتشكيل مستعمرة فحوصات والجينات تحليل التعبير. وللمساعدة في تصور التحويل إلى مصير الخلية محمر، أجرينا إعادة برمجة في الخلايا ?...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

توجيه نسب إعادة برمجة الماوس الكبار تنتجها الخلايا الليفية لموروث محمر

هنا نقدم لدينا بروتوكول لإنتاج فعل المباشر المتكفل محمر (المقدمة) من الماوس الليفية الكبار استخدام النسخ التي يحركها عامل النسب إعادة برمجة (DLR).

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

إعادة برمجة النسب المباشر من الخلايا الليفية إلى خلايا السلفة الاريثيرويدية. انها طريقة جديدة قمنا بتطويرها في مختبرنا من أجل دراسة أفضل لعمليات التنظيم النسخي تحديد مصير الخلايا الاريثرويد. الميزة الرئيسية مع استخدام إعادة برمجة النسب المباشر لدراسة التنمية هو أنه تقنية واضحة جدا.لذلك بالمقارنة مع، على سبيل المثال، فقدان دراسات الدالة داخل الفئران خروج المغلوب، وهنا يمكننا بسهولة جدا التعامل مع عامل، الإفراط في التعبير عنه في نقطة زمنية معينة، ومن ثم الحصول بسهولة على ما يكفي من المواد لدراسة آثار المصب مثل التعديلات الكروماتين أو التغيرات التعبير الجيني. في حين أن هذه الطريقة تركز على إعادة برمجة الخلايا الليفية ذيل طرف الماوس إلى النسل erythroid، ويمكن أيضا أن تطبق على أنواع الخلايا الليفية الأخرى، وعلى الكائنات الحية الأخرى بما في ذلك البشر. الآثار المترتبة على هذه التقنية تمتد نحو نقل الدم في أنه يمهد الطريق نحو إنتاج خلايا الدم الحمراء في المختبر.إثبات الإجراء سيكون (ألبان يوهانسون) من مجموعتي البحثية تبدأ من خلال تغطية سطح الأطباق مع 0.1٪ الجيلاتين. احتضانهم في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا.التعرق الحل الجيلاتين والسماح للأطباق لتجف. استخدام مقص لقطع في قاعدة ذيل الماوس القتل الرحيم لإزالته. ضع الذيل في DPBS مع 2٪ FBS حتى تصبح جاهزة للاستخدام.في غطاء لثقافة الأنسجة في ظروف معقمة ، أعد محلول التربسين المخفف بنسبة 0.02٪ التربسين EDTA في DPBS وأضف 5 ملليلترات في طبق غير مصقول طوله 10 سنتيمترات. في غطاء محرك السيارة ثقافة الأنسجة، وغسل الذيل في ما يكفي من الإيثانول 70٪في أنبوب 15 ملليلتر لتغطية ذلك ومن ثم في DPBS. وضع شقة الذيل في طبق واستخدام ملقط لعقد ذلك في مكانه.استخدام مشرط لإجراء شق على الذيل على طول محور طولي من القاعدة إلى الطرف. استخدام زوج من ملقط لفهم الذيل وعقد عموديا واستخدام الزوج الثاني لقبضة الجلد بجانب شق في قاعدة الذيل وقشر مرة أخرى. قم بإجراء هذا على جانبي الشق حتى يمكن تقشير الجلد عن طريق السحب إلى الأسفل نحو طرف الذيل.عقد ذيل مقشر مع ملقط على الطبق التي تحتوي على حل التربسين. استخدام مقص تشريح لقطع الذيل إلى قطع صغيرة. استخدام مقص لتفتيت هذه القطع في حل التربسين إلى قطع أصغر حجما ثم احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.لإخماد التربسين، إضافة مجلدين من FEX المتوسطة، DMEM مع المكملات الغذائية والمضادات الحيوية. جمع محتويات كاملة من الطبق في أنبوب 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 350 مرة G لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.تعرق و resuspend بيليه التي تحتوي على شظايا الذيل في 10 ملليلتر من FEX المتوسطة الطازجة. نقل هذا التعليق إلى طبق مغلفة الجيلاتين. احتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 4٪ الأكسجين، إضافة الطازجة FEX المتوسطة كل يومين.مراقبة الثقافة بعد خمسة إلى سبعة أيام، والتي قد تعلق شظايا الذيل في الجزء السفلي من الطبق، والالخلايا الليفية تتحرك بعيدا عنهم. مرة واحدة مجموعات من الخلايا الليفية مرئية، يهز بلطف الطبق لطرد القطع الذيل. استلهم الوسط مع جميع شظايا العظام ، وترك الخلايا الليفية تعلق على لوحة.إضافة 10 ملليلتر من FEX المتوسطة الطازجة والثقافة الخلايا الليفية حتى التقاء. لضمان عدم وجود تلوث من قبل البروتينات الارتباطية في ثقافة الخلايا الليفية، افصل الخلايا عن الصفيحة باستخدام التربسين EDTA كما هو موضح في المخطوطة. إضافة المتوسطة وجمع الخلايا، وإضافة الخرز المغناطيسي مع الأجسام المضادة.استخدام نظام فصل مغناطيسي لإزالة الخلايا التي تعبر عن علامات الدم. إن تضمين هذه الخطوة أمر حيوي للغاية لأنها تقضي على أي مراكز الممارسات المنسقة التي قد تكون موجودة في الثقافة وبالتالي احتمال وجود أي إيجابيات كاذبة في يوم تحليل FACS. بذور خلايا التعبئة والتغليف الفيروسية في حوالي 25،000 خلية لكل سنتيمتر مربع على طبق معالجة ثقافة الأنسجة.احتضان الخلايا في DMEM عالية الجلوكوز في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، قم بإزالة الوسيطة وإضافة نصف الحجم المستخدم لثقافة بين عشية وضحاها من DMEM مع عدم وجود إضافات. في فترة ما بعد الظهر، تحقق من الخلايا ل 70 إلى 80٪ التقاء اللازمة لtransfefection.ابدأ عملية النقل عن طريق إعداد خليط من اثنين إلى واحد من ستة ميكروغرامات من متجه التعبير PMX وثلاثة ميكروغرامات من متجه المساعد الذي يحتوي على Gag و Pol ومغلف للجينات لكل عامل إعادة برمجة. بعد ذلك ، لكل عامل إعادة برمجة ، أضف 300 ميكرولترات من DMEM درجة حرارة الغرفة في أنبوب البوليسترين العقيم. ثم قم بإضافة 27 ميكرولترات بعناية من كاشف النقل التجاري في درجة حرارة الغرفة مباشرة إلى الوسط لتجنب الاتصال بجدار الأنبوب.أضف مزيج البلازميد إلى كاشف نقل يحتوي على أنبوب. دوامة لفترة وجيزة واحتضان الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. دوامة مُكْوّدَةُ الـ DNA مجدداً.إضافته دروبا إلى خلايا التعبئة والتغليف الرجعية بحيث يتم توزيعها بالتساوي على الثقافة واحتضان في 37 درجة مئوية. 24 ساعة بعد transfection، وإزالة المتوسطة وإضافة DMEM مع 20٪ FBS و 100 وحدة لكل ملليلتر البنسلين الستريبتوميسين. بعد 48 ساعة من عملية الانتراق، اجمع المُندفع وتصفية ذلك من خلال مُرشاح مُحقن بحجم مُيكرومتر 0.22.بدء عملية النقل عن طريق البذر الذيل تلميح الخلايا الليفية في 10، 000 الخلايا لكل سنتيمتر مربع على 0.1٪ الجيلاتين قبل المغلفة الأطباق في FEX المتوسطة. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. وعند تنفيذ هذه الخطوة، من المهم إضافة الأربعة من كبرى الفيروسات الرجعية بنسبة متساوية لضمان أن تسهم جميع المواد المتحولة الأربع على قدم المساواة في عملية إعادة البرمجة.في اليوم التالي، أعد خليط تحويلي عن طريق إضافة أول حجم واحد من الفيروسية فائقة لكل عامل إعادة برمجة تكملها أربعة ميكروغرام لكل ملليلتر من مُكشف عدوى الفيروسات الرجعية إلى ستة مجلدات من FEX المتوسطة. بعد ذلك، التعرق المتوسطة FEX من ثقافة الخلايا الليفية وإضافة خليط transduction. احتضان تفاعل النقل لمدة أربع ساعات في 37 درجة مئوية في ظروف نقص الأكسجة في 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 4٪ الأكسجين.بعد أربع ساعات، يُطرّح خليط النقل وأضف طازجًا من إعادة البرمجة. احتضان في 37 درجة مئوية في ظروف نقص الأكسجة لمدة ثمانية أيام، مضيفا جديدة إعادة برمجة المتوسطة كل يومين. مراقبة إعادة برمجة ناجحة مع الكتل المنتجة من الخلايا المنفصلة عن اللوحة.لحصاد الخلايا المبرمجة من الطبق لمزيد من التحليل، ماص بلطف لهم صعودا وهبوطا ومن ثم جمع الخلايا. بعد إعادة برمجة ناجحة من iEPs، الخلايا الإيجابية YFP يمكن ملاحظتها في وقت مبكر قبل خمسة أيام بعد عملية النقل. تصبح مستديرة، وترفع من سطح اللوحة، وتبدأ في تشكيل مجموعات، وتعرض مورفولوجيا السلائف الشبيهة بالجرثرويد.الهيموغلوبينية لبعض الخلايا واضح من خلال تلطيخ البنزيدين الإيجابي. ويعبر جزء صغير عن علامة السطح الخاصة بالريثيرويد TER-119. وفي اليوم الثامن، يمكن رؤية مجموعات كبيرة إيجابية من YFP.اليوم الثامن iEPs لديها أكثر تميزا النمط الظاهري من iEPs اليوم الخامس. فهي أصغر بكثير، وقد تراكمت أكثر الهيموغلوبين، وتظهر زيادة التعبير عن TER-119. تحليل التعبير الجيني من قبل qPCR من iEPs التي تم جمعها في اليوم الثامن يظهر أنها قد أغلقت تقريبا التعبير عن الجينات الليفية و upregulated العديد من الجينات الإريثرويد.بعد إجراء مقايسات تشكيل مستعمرة BFU-e على الخلايا التي أعيد برمجتها، تشكل iEPs اليوم الثامن نوعين من المستعمرات، حمراء بشكل واضح وليست حمراء بشكل واضح. في حين أن الخلايا من المستعمرات الحمراء عرض مورفولوجيا اريثروبابلاست، لم خلايا من المستعمرات غير الحمراء. تقريبا واحدة في 1, 000 يوم خمسة شكّل مستعمرات حمراء بينما فقط تقريبا واحدة في 10,000 مستعمرات يشكّل من يوم ثمانية iEPs.وتتأثر كفاءة إعادة برمجة من الذيل طرف في الخلايا الليفية أو TTFs من رقم مرور. وأظهرت صناديق TTFs التي تم تمريرها تسع مرات انخفاضًا كبيرًا في القدرة على إنتاج مجموعات من الفئات IEPs مقارنة بالخلايا التي تم تمريرها ثلاث مرات. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تؤثر ظروف الثقافة المختلفة على كفاءة إعادة البرمجة.12- وتُزرع في نورموكسيا في 10 أيام أبطأ بكثير في إعادة البرمجة، كما أن مجموعات IEP تُلاحظ بعد 10 أيام بدلاً من خمسة إلى ثمانية أيام. بعد هذا الإجراء، يمكن تطبيق أساليب مثل مقايسات تشكيل مستعمرة، تحليل qPCR وFACS من أجل تحديد حالة تمايز الخلية. منذ تطورها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الإريثروبويس في فهم التبديل بين الخلايا الإريثرويدية البدائية والنهائية في الماوس والإنسان.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

مستقر وكفاءة التحوير الوراثي للخلايا في الكبار ماوس V-SVZ لتحليل العصبية الخلايا الجذعية الذاتية الحكم والآثار لغير المتمتعة بالحكم الذاتي

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

الفئران عن طريق الجلد الخلايا الليفية العزلة التي FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

الثقافات توليد الخلايا الليفية الأولية من ماوس الأذن والذيل الأنسجة

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عوامل النسخ للحث على برنامج مكون للدم

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

تقييم Cardiomyocyte الأنواع الفرعية بعد إعادة برمجة بوساطة عامل النسخ من الفأر الجنينية الخلايا الليفية

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

قمع الإشارات برو تليفية يقوي التي تعالج بوساطة معامل إعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية الماوس في Cardiomyocytes المستحث

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

طريقة مباشرة وبسيطة لتقييم قدرة دروسوفيلا ميلانوغاسترعلى البقاء من الجنين إلى الكبار

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

الصب الوعائي لرئتي فأرة ما بعد الولادة المبكرة للتصوير المقطعي المجهري

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...