Name: direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

Vi takke Evelyn Wang og Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) til kloning og Harvey Lodish (Whitehead Institute) for at give mange af de plasmider, bruges til at generere retroviral biblioteket. Vi takke Benny Siva og Sofie Singbrant (Institut for Molekylær medicin og Gene Therapy, Lunds Universitet), Göran Karlsson og Shamit Soneji (Institut for Molekylær hæmatologi, Lunds Universitet) for deres roller i beskrivelse af iEP produktion. Vi vil også gerne anerkende og takke Julian Pulecio (Center for regenerativ medicin, Barcelona biomedicinsk forskning Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent's Institut for medicinalforskning og Institut for medicin, St. Vincent's Hospital, University of Melbourne), Ángel Raya (catalansk Institution for forskning og videregående studier, Barcelona), og Jesper G. Ina (Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology og Harvard, Cambridge ) for deres tidligere bidrag til dette arbejde. Dette arbejde blev støttet af Ragnar Söderberg Foundation (til J.F.); Svenske forskning Rådet (til J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (til J.F.); den svenske Foundation for strategisk forskning (til J.F.); Åke Wiberg Foundation (til J.F.); Marie Curie integration tilskud (til J.F.).

1. etablering og vedligeholdelse af primære mus Hale spids Fibroblast kulturer
<ol><li>Forberede gelatine-belagt retter (anbefale en 10 cm parabol for en hale) ved at dække overfladen med 0,1% gelatine og inkubere retter i ca 20 min. ved 37 ° C. Opsug den gelatine løsning fra skålen og lad det tørre i mindst 2 timer.</li>
	<li>Aflive mus af cervikal dislokation. Fjerne halen med en saks, klippe i bunden af halen. Sætte hale i Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) med 2% føtal bovint serum (FBS) indtil ...

<ol>
	<li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+We+Really+Vastly+Outnumbered?+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans.">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li><li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+multilineage+blood+progenitors.">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li><li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li><li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors.">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li><li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors.">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li><li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversions:+unnatural+but+useful.">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li><li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox.">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li><li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion.">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li><li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+reprogramming:+a+two-way+street.">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li><li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+couples+erythropoiesis,+B-lymphopoiesis,+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment.">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li><li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage.">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways.">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).</li><li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors.">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li><li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells.">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).</li></ol>

Overekspression af en fire-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, og c-MYC (GTLM), er tilstrækkelige til at omprogrammere murine og humane fibroblaster direkte til iEPs10. Omprogrammerede erythroid celler meget lignede Bonafide erythroid progenitorceller morfologi, fænotype, genekspression og kolonidannende evne. Dette resultat bekræfter rationale for at bruge direkte omprogrammering s...

Røde blodlegemer (RBC) er afgørende i alle hvirveldyr og udgør 84% af alle celler af menneskelige organer1. Fra embryonale til voksne liv er vores sundhed meget afhængig af præcis regulering af RBC homøostase. Den løbende produktion af modne røde blodlegemer i hele udvikling ind i voksenalderen er kendt som erythropoiesen. En stor udfordring i erythropoiesen forskning er at definere de master regulatorer, der dirigerer RBC udvikling og skifte mellem primitive og endelige erythropoiesen. Direkte afstamning omprogrammering af erythroid progenitorceller præsenterer en lejlighed til yderligere at forstå erythroid udvikling in vivo.
Direkte afstamning omprogrammering (DLR), også kendt som transdifferentiation, er processen med omprogrammering én celletype direkte ind i en anden, omgåelse pluripotente og Multipotente stamceller faser. DLR er hidtil blevet brugt til at producere mange celletyper, herunder neurale2, hæmatopoietisk3,4,5, hepatisk6 og nefrotisk7, stamceller. For udviklingsmæssige biologer, er DLR blevet et vigtigt redskab for afhører aspekter af afstamning engagement og terminal differentiering processer8,9. DLR kan supplere og delvist erstatte i vivo undersøgelser for forståelse mekanismer af celle skæbne afgørende faktorer under udviklingen. DLR protokol for omprogrammering til erythroid progenitorceller beskrevet i denne hvidbog indeholder feltet en gratis metode til udviklingsmæssige undersøgelser af erythropoiesen.
Vi har tidligere vist, at overekspression af en fire-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, og c-MYC (GTLM), er tilstrækkelige til at omprogrammere murine og humane fibroblaster direkte til induceret erythroid ophav (iEPs) 10. the GTLM omprogrammerede erythroid celler meget ligner Bonafide primitive erythroid ophav i form af morfologi og fænotype gen expression10. Dermed iEPs har begrænset spredning kapacitet og moden til nukleeret erytrocytter svarende til dem, der forbigående produceres i den tidlige embryon før starten af endelige erythropoiesen. Ved at foretage ændringer i de omprogrammering betingelser (fx punktmutationer i omprogrammering faktorer eller tilsætning af andre faktorer), kan man forstå, hvordan dette fører til ændringer i erythroid udvikling og differentiering. Vi har for eksempel vist at tilføjelsen af Klf1 eller Myb til GTLM cocktail ændrer globin udtryk mønster fra overvejende embryonale (primitiv) til fortrinsvis voksne (endelige). Dette resultat bekræfter gyldigheden af ved hjælp af DLR som et redskab til at definere udviklingsmæssige faktorer i erythropoiesen.
Her, skitsere vi processen til oprettelse af iEPs fra mus Hale spids fibroblaster (TTF). I vores repræsentative resultater, vi udførte omprogrammering på fibroblaster fra erythroid afstamning sporingen mus (Epor- Cre R26- eYFP) som express gul fluorescerende proteiner (eYFP) fra Rosa26 locus i alle celler, har udtrykt erythropoietin receptor, giver mulighed for nem visualisering af engagement i erythroid slægt. Du bruger denne metode, er YFP positive (EpoR +) celler til stede så tidligt som i fem dage efter transduktion. Denne protokol tilbyder derfor en hurtig og robust teknik for generation af erythroid ophav i vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1141px;" width="1142">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM without sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:505px;">Culturing media for PhGP cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM with sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30243.01</td>
			<td>Culturing media for tail tip fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)</td>
			<td style="width:167px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:123px;">9650</td>
			<td>Reprogramming media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum HyClone</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30071.03HI</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td>Antiboiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Non-Essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">11140050</td>
			<td>SNL media is suppplemented with this</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Trypsin HyClone (1x)</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30042.01</td>
			<td>Cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Murine Stem Cell Factor (mSCF)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">250-03</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Recombinant Murine Il-3</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">213-13</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">human recombinant erythropoietin (hrEPO)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-64</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">50-02-2&#160;&#160;</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">9000-70-8&#160;</td>
			<td>Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Blasticidin S hydrochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">3/9/3513</td>
			<td>Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30850.03</td>
			<td>Used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>Infection / Transfection&#160; Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:167px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td>Transfection Reagent for PhGP cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">BD Emerald Hypodermic Syringe</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">SKU: 307736</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm Culture Dish</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">10799541</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Jeweler Forceps #5</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">66-7642</td>
			<td>Used for handling small tail fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Sklarlite Iris Scissors</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">23-1149</td>
			<td>Used for cutting the tail into small pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:123px;">130-090-858</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">CD117 MicroBeads, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PheonixGP cells</td>
			<td style="width:167px;">ATCC</td>
			<td>CRL-3215</td>
			<td>retroviral packaging cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">EcoPAC vector (pCL-Eco)&#160;</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-29540</td>
			<td>retroviral helper vector containing gag and pol genes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Gata1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Tal1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Lmo2</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-cMyc</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellSens Standard 1.6 software&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Cytospin analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors

Erythroid celle engagement og differentiering fortsætte gennem aktivering af en slægt-begrænset transcriptional netværk orkestreret af en gruppe af celle skæbne bestemmelse og modning faktorer. Vi tidligere fastsat til at definere den minimalt sæt af nødvendige for instruere rød blod celle udvikling ved hjælp af direkte afstamning omprogrammering af fibroblaster til induceret erythroid progenitorceller/prækursorer (iEPs) faktorer. Vi viste at overekspression af Gata1, Tal1, Lmo2og c-Myc (GTLM) kan hurtigt konvertere murine og humane fibroblaster direkte til iEPs, der ligner Bonafide erythroid celler i morfologi, fænotype, og genekspression. Vi har til hensigt at iEPs vil give et uvurderligt værktøj for at studere erythropoiesen og celle skæbne forordning. Her beskriver vi de trinvis proces med at konvertere murine Hale spids fibroblaster til iEPs via transskription faktor-drevet direkte afstamning omprogrammering (DLR). I dette eksempel udføre vi omprogrammering i fibroblaster fra erythroid afstamning sporingen mus, der udtrykker den gul fluorescerende proteiner (YFP) under kontrol af erythropoietin receptor genet (EpoR) promotor, gør det muligt for visualisering af erythroid celle skæbne induktion ved omprogrammering. Efter denne protokol, kan fibroblaster omprogrammeres til iEPs inden for fem til otte dage.
Mens kan stadig forbedres til processen, viser vi, at GTLM-medieret omprogrammering er en hurtig og direkte proces, giver celler med egenskaberne for Bonafide erythroid Stamform og forløber celler.

Her præsenterer vi en reproducerbar protokol til produktion af iEPs fra voksen fibroblaster transskription faktor-drevet DLR. Vi evaluerer celle omprogrammering bruger flowcytometri, kolonidannende assays og gen expression analyse. For at hjælpe med visualisering af konvertering til erythroid celle skæbne, vi udførte omprogrammering på fibroblaster fra erythroid afstamning sporingen mus (Epor- Cre R26- eYFP) som udtryk for den gule fluorescerende proteiner (eYFP) fr...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Direkte afstamning omprogrammering af voksne mus Fibroblast til Erythroid ophav

Her præsenterer vi vores protokol for producerer induceret erythroid ophav (iEPs) fra mus voksen fibroblaster transskription faktor-drevet direkte afstamning omprogrammering (DLR).

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Direkte afstamning omprogrammering fra fibroblaster til erythroid progenitor celler. Det er en ny metode, vi har udviklet i vores laboratorium for bedre at kunne studere processerne i transskriptionel regulering, der bestemmer erythroid celle skæbne. Den største fordel ved at bruge direkte afstamning omprogrammering til at studere udvikling er, at det er en meget ligetil teknik.Så i forhold til for eksempel tab af funktionsundersøgelser inden for knockout mus, her kan vi meget nemt manipulere faktoren, over-udtrykke det på det bestemte tidspunkt, og derefter nemt få nok materiale til at studere downstream effekter såsom kromatin modifikationer eller genekspression ændringer. Mens denne metode fokuserer på omprogrammering af mus hale-tip fibroblaster til erythroid stamfader, det kan også anvendes på andre fibroblast celletyper, og til andre organismer, herunder mennesker. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig i retning af transfusion medicin i, at det baner vejen for produktion af røde blodlegemer in vitro.Demonstration af proceduren vil være Alban Johansson fra min forskningsgruppe. Begynd med at dække overfladen af retterne med 0,1% gelatine. Inkuber dem ved 37 grader Celsius i ca. 20 minutter.Aspirere gelatineopløsningen og lad opvasken tørre. Brug saks til at skære i bunden af halen af en aflivet mus til at fjerne den. Placer halen i DPBS med 2% FBS, indtil den er klar til brug.I en vævskultur hætte under sterile forhold, forberede en fortyndet trypsin opløsning af 0,02% trypsin EDTA i DPBS og tilsæt 5 milliliter i en ubestrøget 10-centimeter skål. I en vævskulturhætte skal du vaske halen i nok 70% ethanol i et 15-milliliterrør til at dække det og derefter i DPBS. Placer halen fladt i en skål og bruge anroterne til at holde den på plads.Brug en skalpel til at lave et snit på halen langs sin langsgående akse fra bunden til spidsen. Brug et par kraftafces til at gribe halen og holde den lodret og bruge et andet par til at gribe huden ved siden af snittet i bunden af halen og skrælle den tilbage. Udfør dette på begge sider af snittet, indtil huden kan skrælles af ved at trække nedad mod spidsen af halen.Hold den skrællede hale med fakt over skålen, der indeholder trypsinopløsningen. Brug dissektion saks til at skære halen i små stykker. Brug en saks til at fragmentere disse stykker i trypsin opløsning i endnu mindre stykker og derefter inkubere ved 37 grader Celsius i 10 minutter.At slukke trypsin, tilføje to mængder af FEX medium, DMEM med kosttilskud og antibiotika. Opsaml hele indholdet af skålen i et 50-milliliterrør. Centrifuge røret ved 350 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius.Inspirer supernatanten og opsbrug pelletet indeholdende halefragmenterne i 10 milliliter frisk FEX-medium. Overfør denne suspension til en gelatinebelagt skål. Inkubere ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid og 4% ilt, tilføje frisk FEX medium hver anden dag.Overhold kulturen efter fem til syv dage, hvor halefragmenterne har fastgjort i bunden af skålen, og fibroblaster bevæger sig væk fra dem. Når klynger af fibroblaster er synlige, forsigtigt ryste skålen for at løsne hale stykker. Aspirere mediet med alle knoglefragmenterne, så fibroblasterne er fastgjort til pladen.Tilsæt 10 milliliter frisk FEX medium og kultur fibroblaster indtil sammenløbet. For at sikre, at der ikke er forurening med hæmatopoietiske progenitorer i fibroblastkulturen, skal cellerne adskilles fra pladen ved hjælp af trypsin EDTA som beskrevet i manuskriptet. Tilføj medium og indsamle cellerne, og tilsæt magnetiske perler med antistoffer.Brug et magnetisk separationssystem til at fjerne celler, der udtrykker hæmatopoietiske markører. Det er helt afgørende at medtage dette trin, fordi det fjerner alle HSPC'er, der måtte være til stede i kulturen, og dermed sandsynligheden for falske positiver på dagen for FACS-analysen. Frø retroviral emballage celler på ca 25, 000 celler per kvadratcentimeter på et væv kultur behandlet fad.Inkuber cellerne i højglukose DMEM ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid natten over. Den følgende morgen fjernes mediet og tilsættes halvdelen af den mængde, der bruges til at dyrke DMEM natten over uden tilsætningsstoffer. Om eftermiddagen skal cellerne kontrolleres for 70 til 80%sammenløbet, der kræves til transfektion.Begynd transinfektionen ved at forberede en to til en blanding af seks mikrogram af ekstktoren PMX og tre mikrogram af hjælpevektoren, der indeholder Gag, Pol og konvolutgener for hver omprogrammeringsfaktor. Dernæst tilsættes for hver omprogrammeringsfaktor 300 mikroliter DMEM ved stuetemperatur i et sterilt polystyrenrør. Derefter tilsættes forsigtigt 27 mikroliter rumtemperatur kommercielle transinfektion reagens direkte ind i mediet for at undgå kontakt med røret væggen.Plasmidblandingen anbringes i transfektionsreagegen, der indeholder røret. Vortex kort og inkubere blandingen i 15 minutter ved stuetemperatur. Vortex transfektion reagens DNA blandingen igen.Tilføj det dropwise til retroviral emballage celler, så det er jævnt fordelt over kulturen og inkubere ved 37 grader Celsius. 24 timer efter transfektion fjernes mediet, og DMEM med 20% FBS og 100 enheder pr. milliliter penicillin streptomycin. 48 timer efter transfektion, indsamle supernatant og filtrere det gennem en 0,22 mikrometer pore størrelse sprøjte filter.Begynd transduktionen ved at så halespidsen fibroblaster ved 10.000 celler pr. kvadratcentimeter på 0,1% gelatine forbelagte retter i FEX medium. Inkubere ved 37 grader Celsius i 24 timer. Ved udførelsen af dette trin er det vigtigt at tilføje de fire retrovirale supernatanter i et lige forhold for at sikre, at alle fire transgene bidrager ligeligt til omprogrammeringsprocessen.Den følgende dag klargøres en transduktionsblanding ved først at tilsætte et volumen viral supernatant for hver omprogrammeringsfaktor suppleret med fire mikrogram pr. milliliter retroviral infektionsreageser til seks bind FEX-medium. Derefter aspirere FEX-mediet fra fibroblastkulturen og tilsæt transduktionsblandingen. Inkuber transduktionsreaktionen i fire timer ved 37 grader Celsius under hypoxiske forhold ved 5 % kuldioxid og 4 % ilt.Efter fire timer, aspirere transduktion blandingen og tilsæt frisk omprogrammering medium. Inkubere ved 37 grader Celsius i hypoxiske forhold i otte dage, tilføje frisk omprogrammering medium hver anden dag. Overhold vellykket omprogrammering med udbyttede klynger af celler løsrevet fra pladen.At høste omprogrammerede celler fra skålen til yderligere analyse, forsigtigt pipette dem op og ned og derefter indsamle cellerne. Efter vellykket omprogrammering af iEPs observeres YFP-positive celler så tidligt som fem dage efter transduktion. De bliver runde, løft fra overfladen af pladen, begynder at danne klynger, og vise en erythroid forløber-lignende morfologi.Hæmoglobinization af nogle celler er tydeligt ved positiv benzidin farvning. En lille brøk udtrykker den erythroid-specifikke overflademarkør TER-119. På dag otte kan man se store YFP-positive klynger.Dag otte iEPs har en mere differentieret erythroid fænotype end dag fem iEPs. De er betydeligt mindre, har akkumuleret mere hæmoglobin, og viser øget udtryk for TER-119. Genekspression analyse af qPCR af iEP'er indsamlet på dag otte viser, at de næsten har lukket ekspression af fibroblast gener og har upregulated mange erythroid gener.Efter at have udført BFU-e kolonidannende analyser på de omprogrammerede celler, dag otte i EP'er danner to typer af kolonier, tydeligt rød og ikke synligt rød. Mens celler fra røde kolonier viste erythroblast morfologi, celler fra ikke-røde kolonier ikke. Ca. en ud af 1.000 dag fem iEPs dannede røde kolonier, mens kun ca. én ud af 10.000 kolonier dannet fra dag otte iEPs.Omprogrammering effektivitet hale-tip fibroblaster eller TTFs er påvirket af passage nummer. TTFs, der var blevet passaget ni gange viste en dramatisk reduktion i evnen til at producere klynger af iEPs i forhold til de celler, der var blevet passaget tre gange. Desuden kan forskellige kulturforhold påvirke effektiviteten af omprogrammeringen.Transduced TTFs dyrket i normoxia er meget langsommere til at omprogrammere og IEP klynger er observeret efter 10 dage i stedet for fem til otte dage. Efter denne procedure kan der anvendes metoder som kolonidannende analyser, qPCR- og FACS-analyse for at bestemme celledifferentieringsstatus. Siden sin udvikling, er denne teknik baner vejen for forskere inden for erythropoiesis i forståelsen af overgangen mellem primitive og endelige erythroid celler i mus og mennesker.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabil og effektiv genetisk modificering af celler i Voksen Mouse V-SVZ til analyse af neural stamcelle selvstyrende og ikke-selvstændige effekter

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Murine Dermal Fibroblast Isolation ved FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Generering Primær fibroblastkulturer fra museøre og hale Væv

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse af Protein Expression til Studieinformationen Lineage Specification i Mouse præimplantationsperioden Embryoner

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Omprogrammering mus embryonale fibroblaster med transkriptionsfaktorer at fremkalde en Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Vurdering cardiomyocyte undertyper Efter Transcription Factor-medieret Omprogrammering af Mouse Embryonale fibroblaster

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation af stillads-fri, tre-dimensionelle Insulin udtrykker Pancreatoids fra mus i bugspytkirtlen stamfaderen In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Undertrykkelse af Pro-fibrotisk signalering Potentiates faktor-medieret omprogrammering af musen embryonale fibroblaster til induceret Cardiomyocytes

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

En direkte og enkel metode til at vurdere Drosophila melanogasterslevedygtighed fra embryo til voksen

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Vaskulær støbning af voksne og tidlige postnatal mus lunger til Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...