Name: direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

Wij danken Evelyn Wang en Gregory Hyde (Instituut Whitehead, Cambridge, MA) voor klonen en Harvey Lodish (Instituut Whitehead) voor het verstrekken van veel van de plasmiden gebruikt voor het genereren van de retrovirale bibliotheek. Wij danken Kavitha Siva en Sofie Singbrant (afdeling van moleculaire geneeskunde en Gene Therapy, Lund University), Göran Karlsson en Shamit Soneji (departement voor moleculaire hematologie, Lund University) voor hun rollen in beschrijving van iEP productie. Wij willen ook te erkennen en dank Julian Pulecio (centrum voor regeneratieve geneeskunde, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent's Instituut voor medisch onderzoek en Vakgroep Geneeskunde, St Vincent's Hospital, Universiteit van Melbourne), Ángel Raya (Catalaanse instelling voor onderzoek en geavanceerde Studies, Barcelona) en Vijay G. Sankaran (Broad Instituut van het Massachusetts Institute of Technology en Harvard, Cambridge ) voor hun vorige bijdrage aan dit werk. Dit werk werd gesteund door de Ragnar Söderberg Stichting (JF); het Zweedse onderzoek Raad (aan J.F.); Stichting Olle Engkvist Byggmästare (aan J.F.); de Zweedse Stichting voor strategisch onderzoek (JF); Åke Wiberg van Stichting (JF); een toekenning van de integratie Marie Curie (aan J.F.).

1. oprichting en onderhoud van primaire muis staart Tip Fibroblast culturen
<ol><li>Bereid gelatine beklede gerechten (adviseren een 10 cm schotel voor één staart) door die betrekking hebben op het oppervlak met 0,1% gelatine en het broeden van de gerechten gedurende ongeveer 20 minuten bij 37 ° C. Gecombineerd de oplossing van de gelatine van de schotel en laat ze drogen voor ten minste 2 uur.</li>
	<li>De muizen door cervicale dislocatie euthanaseren. Verwijder de staart met een schaar, snijden aan de voet van de ...

<ol>
	<li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+We+Really+Vastly+Outnumbered?+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans.">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li><li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+multilineage+blood+progenitors.">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li><li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li><li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors.">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li><li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors.">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li><li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversions:+unnatural+but+useful.">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li><li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox.">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li><li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion.">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li><li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+reprogramming:+a+two-way+street.">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li><li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+couples+erythropoiesis,+B-lymphopoiesis,+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment.">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li><li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage.">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways.">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).</li><li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors.">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li><li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells.">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).</li></ol>

Overexpressie van een vier-factor-cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, en c-MYC (GTLM), is voldoende om te herprogrammeren lymfkliertest en humane fibroblasten rechtstreeks naar iEPs10. De cellen geherprogrammeerde erythroid leek sterk op bona fide erythroid progenitoren in termen van morfologie, fenotype, genuitdrukking en kolonievormend vermogen. Deze bevinding bevestigt de grondgedachte van...

Rode bloedcellen (RBC) zijn essentieel in alle gewervelden en make-up 84% van alle cellen van het menselijk lichaam1. Van embryonale tot volwassen leven is onze gezondheid sterk afhankelijk van de exacte regeling van RBC homeostase. De voortdurende productie van rijpe RBC in de gehele ontwikkeling naar volwassenheid staat bekend als de Erytropoëse. Een belangrijke uitdaging in de Erytropoëse onderzoek is vast te stellen van de master toezichthouders dat ontwikkeling van de RBC en de switch tussen primitieve en definitieve Erytropoëse orkestreren. Directe bloedlijn herprogrammering van erythroid voorlopercellen biedt een kans om verder te begrijpen erythroid ontwikkeling in vivo.
Directe bloedlijn herprogrammering (DLR), ook bekend als transdifferentiatie, is het proces van herprogrammering één celtype rechtstreeks naar de andere, het omzeilen van pluripotente en multipotente voorlopercellen stadia. DLR heeft tot nu toe is gebruikt voor de productie van vele celtypes, met inbegrip van neurale2, hematopoietische3,4,5, hepatische6 en nefrotisch7, voorlopercellen. Voor ontwikkelingsstoornissen biologen, DLR uitgegroeid tot een belangrijk instrument voor Larive aspecten van lineage inzet en terminal differentiatie processen8,9. DLR kan aanvullen en gedeeltelijk vervangen in vivo studies voor het begrijpen van mechanismen van het lot van de cel bepalende factoren tijdens de ontwikkeling. De DLR-protocol voor de herprogrammering te erythroid progenitoren beschreven in dit document levert het veld een gratis methode voor bestudering van de ontwikkelings van de Erytropoëse.
Wij hebben eerder aangetoond dat overexpressie van een vier-factor-cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, en c-MYC (GTLM), voldoende om te herprogrammeren van zowel menselijke als lymfkliertest fibroblasten rechtstreeks naar geïnduceerde erythroid voorlopercellen (iEPs) 10. the GTLM-geherprogrammeerd erythroid cellen lijken sterk op bona fide primitieve erythroid progenitoren in termen van morfologie, fenotype en gen expressie10. Dus iEPs hebben beperkte capaciteit van de proliferatie en vervallen en genucleëerde vergelijkbaar zijn met die Transient geproduceerd in het vroege embryo vóór aanvang van de definitieve Erytropoëse erythrocyten. Door wijzigingen in de herprogrammering voorwaarden (bijvoorbeeld puntmutaties in herprogrammering factoren of toevoeging van andere factoren), kan men begrijpen hoe dit leidt tot veranderingen in de erythroid ontwikkeling en differentiatie. We hebben bijvoorbeeld aangetoond dat toevoeging van Klf1 of Myb aan de cocktail GTLM het globine-expressiepatroon van overwegend embryonale (primitieve verandert) vooral volwassen (definitieve). Deze bevinding bevestigt de geldigheid van het gebruik van DLR als een instrument voor het definiëren van ontwikkelingsstoornissen factoren in de Erytropoëse.
We schetsen hier, het proces van het genereren van iEPs van muis staart tip fibroblasten (TTF). In onze representatieve resultaten, we uitgevoerd de herprogrammering op fibroblasten van de erythroid afstamming-tracing muizen (Epor- Cre R26- eYFP) die express de gele fluorescerende proteïne (eYFP) van de Rosa26 locus in alle cellen die geuit de Erytropoëtine-receptor, waardoor eenvoudige visualisatie van betrokkenheid bij de erythroid afkomst. Met behulp van deze methode, zijn positieve YFP (EpoR +) cellen aanwezig zo spoedig vijf dagen na transductie. Dit protocol, daarom biedt een snelle en robuuste techniek voor de generatie van erythroid voorlopercellen in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1141px;" width="1142">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM without sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:505px;">Culturing media for PhGP cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM with sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30243.01</td>
			<td>Culturing media for tail tip fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)</td>
			<td style="width:167px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:123px;">9650</td>
			<td>Reprogramming media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum HyClone</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30071.03HI</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td>Antiboiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Non-Essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">11140050</td>
			<td>SNL media is suppplemented with this</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Trypsin HyClone (1x)</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30042.01</td>
			<td>Cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Murine Stem Cell Factor (mSCF)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">250-03</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Recombinant Murine Il-3</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">213-13</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">human recombinant erythropoietin (hrEPO)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-64</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">50-02-2&#160;&#160;</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">9000-70-8&#160;</td>
			<td>Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Blasticidin S hydrochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">3/9/3513</td>
			<td>Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30850.03</td>
			<td>Used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>Infection / Transfection&#160; Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:167px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td>Transfection Reagent for PhGP cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">BD Emerald Hypodermic Syringe</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">SKU: 307736</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm Culture Dish</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">10799541</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Jeweler Forceps #5</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">66-7642</td>
			<td>Used for handling small tail fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Sklarlite Iris Scissors</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">23-1149</td>
			<td>Used for cutting the tail into small pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:123px;">130-090-858</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">CD117 MicroBeads, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PheonixGP cells</td>
			<td style="width:167px;">ATCC</td>
			<td>CRL-3215</td>
			<td>retroviral packaging cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">EcoPAC vector (pCL-Eco)&#160;</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-29540</td>
			<td>retroviral helper vector containing gag and pol genes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Gata1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Tal1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Lmo2</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-cMyc</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellSens Standard 1.6 software&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Cytospin analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors

Erythroid cel inzet en differentiatie doorlopen activering van een bloedlijn-beperkte transcriptionele netwerk georkestreerd door een groep van het lot van de cel bepalen en factoren rijpen. We eerder uiteengezet te definiëren de minimale benodigde factoren voor het instrueren van de rode bloedcellen ontwikkelen met behulp van directe bloedlijn herprogrammering van fibroblasten in geïnduceerde erythroid progenitoren/precursoren (iEPs). We toonden dat overexpressie van Gata1, Tal1, Lmo2en c-Myc (GTLM) kunnen snel converteren lymfkliertest en humane fibroblasten rechtstreeks aan iEPs die lijken op de bona fide erythroid cellen in termen van morfologie, fenotype, en genexpressie. Wij zijn van plan dat iEPs een instrument van onschatbare waarde om te studeren Erytropoëse en cel lot verordening zal bieden. Hier beschrijven we de stapsgewijze proces van het omzetten van lymfkliertest staart tip fibroblasten in iEPs via transcriptie factor-gedreven directe bloedlijn herprogrammering (DLR). In dit voorbeeld voeren wij de herprogrammering in fibroblasten van erythroid afkomst-tracing muizen die uitdrukking geven aan de gele fluorescerende proteïne (YFP) onder de controle van de Erytropoëtine receptor gen (EpoR) promotor, visualisatie van erythroid cel inschakelen lot inductie op herprogrammering. Naar aanleiding van dit protocol, fibroblasten kunnen worden geherprogrammeerd in iEPs binnen vijf tot acht dagen.
Terwijl verbeteringen kunnen nog steeds worden gemaakt aan het proces, laten we zien dat GTLM-gemedieerde herprogrammering is een snelle en directe proces, opbrengst van cellen met eigenschappen van bona fide erythroid voorlopercellen en voorloper cellen.

Hier presenteren we een reproduceerbare protocol voor de productie van iEPs van volwassen fibroblasten met behulp van transcriptie factor gestuurde DLR. We evalueren de cel herprogrammering met stroom cytometry, kolonie-vormende testen en gen expressie analyse. Om te helpen bij de visualisatie van de conversie naar erythroid cel lot, we uitgevoerd de herprogrammering op fibroblasten van de erythroid afstamming-tracing muizen (Epor- Cre R26- eYFP) die express de gele fluo...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Directe bloedlijn herprogrammering van volwassen muis Fibroblast te Erythroid voorlopercellen

Hier presenteren wij ons protocol voor produceren geïnduceerde erythroid progenitoren (iEPs) van volwassen fibroblasten muis met behulp van transcriptie factor-gedreven directe bloedlijn herprogrammering (DLR).

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Directe afstamming herprogrammering van fibroblasten tot erythroïde voorvadercellen. Het is een nieuwe methode die we hebben ontwikkeld in ons lab om de processen van transcriptieregelgeving die het lot van de erythroïde cel bepalen beter te bestuderen. Het belangrijkste voordeel met het gebruik van directe aflijning herprogrammering om ontwikkeling te bestuderen is dat het een zeer eenvoudige techniek.Dus in vergelijking met bijvoorbeeld het verlies van functiestudies binnen knock-outmuizen, kunnen we hier heel gemakkelijk de factor manipuleren, het op het bepaalde tijdstip over-uitdrukken, en dan gemakkelijk genoeg materiaal krijgen om downstream-effecten zoals chromatine-modificaties of veranderingen in genexpressie te bestuderen. Terwijl deze methode zich richt op de herprogrammering van muis staart-tip fibroblasten aan erythroïde voorlopers, het kan ook worden toegepast op andere fibroblast celtypes, en op andere organismen, waaronder de mens. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot transfusiegeneeskunde in die zin dat het de weg vrijmaakt naar de productie van rode bloedcellen in vitro.Het aantonen van de procedure zal Alban Johansson van mijn onderzoeksgroep zijn. Begin met het bedekken van het oppervlak van de gerechten met 0,1% gelatine. Broed ze in op 37 graden Celsius gedurende ongeveer 20 minuten.Aspirate de gelatine oplossing en laat de gerechten te drogen. Gebruik een schaar om te snijden aan de basis van de staart van een geëuthanaseerde muis om het te verwijderen. Plaats de staart in DPBS met 2%FBS tot klaar voor gebruik.Bereid in een weefselkweekkap onder steriele omstandigheden een verdunde trypsineoplossing van 0,02% trypsin EDTA in DPBS en voeg 5 milliliter toe in een ongecoate schotel van 10 centimeter. In een weefselkweekkap, was de staart in genoeg 70%-ethanol in een 15-milliliter buis om het te bedekken en vervolgens in DPBS. Plaats de staart plat in een schotel en gebruik tangen om het op zijn plaats te houden.Gebruik een scalpel om een incisie op de staart langs de lengteas van de basis naar de punt te maken. Gebruik een paar tangen om de staart te grijpen en verticaal te houden en gebruik een tweede paar om de huid grip naast de incisie aan de basis van de staart en schil het terug. Voer dit aan beide zijden van de incisie uit totdat de huid kan worden afgepeld door naar beneden naar het puntje van de staart te trekken.Houd de geschilde staart met tangen over de schotel met de trypsineoplossing. Gebruik dissectie schaar om de staart te snijden in kleine stukjes. Gebruik een schaar om deze stukken in de trypsineoplossing in nog kleinere stukken te fragmenteren en vervolgens 10 minuten lang in te broeden op 37 graden Celsius.Om de trypsine te doven, voeg twee volumes FEX medium, DMEM met supplementen en antibiotica. Verzamel de volledige inhoud van de schotel in een 50-milliliter buis. Centrifuge de buis op 350 keer G gedurende vijf minuten op vier graden Celsius.Aspirate de supernatant en resuspend de pellet met de staart fragmenten in 10 milliliter van verse FEX medium. Breng deze vering over op een schotel met gelatinecoating. Incubeer bij 37 graden Celsius in 5% kooldioxide en 4% zuurstof, het toevoegen van verse FEX medium om de twee dagen.Observeer de cultuur na vijf tot zeven dagen, waarin de staartfragmenten aan de onderkant van het gerecht zijn bevestigd en fibroblasten zich ervan aftrekken. Zodra clusters van fibroblasten zichtbaar zijn, schud de schotel voorzichtig om staartstukken los te maken. Aspirate het medium met alle botfragmenten, waardoor de fibroblasten aan de plaat.Voeg 10 milliliter vers FEX medium toe en kweek de fibroblasten tot confluent. Om ervoor te zorgen dat er geen besmetting is door hematopoietische voorouders in de fibroblastcultuur, scheidt u de cellen van de plaat met behulp van trypsine EDTA zoals beschreven in het manuscript. Voeg medium toe en verzamel de cellen en voeg magnetische kralen toe met antilichamen.Gebruik een magnetisch scheidingssysteem om cellen te verwijderen die hematopoietische markers uitdrukken. Het opnemen van deze stap is absoluut noodzakelijk omdat het alle HSPCs elimineert die aanwezig kunnen zijn in de cultuur en dus de waarschijnlijkheid van valse positieven op de dag van de FACS-analyse. Zaad retrovirale verpakkingscellen op ongeveer 25.000 cellen per vierkante centimeter op een weefsel cultuur behandeld schotel.Incubeer de cellen in high-glucose DMEM bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide 's nachts. Op de volgende ochtend, verwijder het medium en voeg de helft van het volume gebruikt om cultuur 's nachts van DMEM zonder additieven. Controleer 's middags de cellen op 70 tot 80%-samenvloeiing die nodig is voor transfectie.Begin met de transfectie door een twee-op-één mengsel van zes microgrammen van de expressievector PMX en drie microgram van de helpervector met Gag,Pol en envelopgenen voor elke herprogrammeringsfactor voor te bereiden. Voeg vervolgens voor elke herprogrammeringsfactor 300 microliters met kamertemperatuur DMEM toe in een steriele polystyreenbuis. Voeg vervolgens voorzichtig 27 microliter van commerciële transfectiereageageagens op kamertemperatuur direct in het medium om contact met de buiswand te voorkomen.Voeg het plasmide mengsel toe aan het transfectiereagensmiddel met buis. Vortex kort en incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Vortex het transfectie reagens DNA mengsel weer.Voeg het dropwise toe aan de retrovirale verpakkingscellen, zodat het gelijkmatig over de cultuur wordt verspreid en bij 37 graden Celsius wordt uitbroed. 24 uur na de transfectie, verwijder het medium en voeg DMEM met 20%FBS en 100 eenheden per milliliter penicilline streptomycine. 48 uur na de transfectie, verzamel de supernatant en filter het door een 0,22 micrometer porie grootte spuitfilter.Begin met de transductie door het zaaien van de staart tip fibroblasten op 10,000 cellen per vierkante centimeter op 0,1% gelatine voorgecoate gerechten in FEX medium. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Bij het uitvoeren van deze stap is het belangrijk om de vier retrovirale supernatants op gelijke voet toe te voegen om ervoor te zorgen dat alle vier de transgenes in gelijke mate bijdragen aan het herprogrammeringsproces.Bereid op de volgende dag een transductiemengsel door eerst één volume virale supernatant toe te voegen voor elke herprogrammeringsfactor aangevuld met vier microgram per milliliter retrovirale infectiereagensagemiddel tot zes volumes FEX-medium. Daarna het FEX-medium uit de fibroblastcultuur aangezogen en het transductiemengsel toevoegen. Incubeer de transductiereactie gedurende vier uur bij 37 graden Celsius bij hypoxische omstandigheden bij 5%kooldioxide en 4% zuurstof.Na vier uur, aspirate het transductiemengsel en voeg verse herprogrammering medium. Incubeer bij 37 graden Celsius in hypoxische omstandigheden gedurende acht dagen, het toevoegen van verse herprogrammering medium om de twee dagen. Observeer succesvolle herprogrammering met opgetrokken clusters van cellen die loskomen van de plaat.Om geherprogrammeerde cellen uit de schotel te oogsten voor verdere analyse, ze voorzichtig op en neer te pipetten en vervolgens de cellen te verzamelen. Na een succesvolle herprogrammering van iEPs zijn YFP-positieve cellen al vijf dagen na transductie waarneembaar. Ze worden rond, liften van het oppervlak van de plaat, beginnen clusters te vormen en vertonen een erythroid voorloper-achtige morfologie.Hemoglobinisatie van sommige cellen is duidelijk door positieve benzidine kleuring. Een kleine fractie drukt de erythroid-specifieke oppervlaktemarkering TER-119 uit. Op dag acht zijn grote YFP-positieve clusters te zien.Dag acht iEPs hebben een meer gedifferentieerder lier fenotype dan dag vijf iEPs. Ze zijn aanzienlijk kleiner, hebben meer hemoglobine verzameld en tonen een verhoogde expressie van TER-119. Genexpressie analyse door qPCR van iEPs verzameld op dag acht blijkt dat ze bijna stilgelegd expressie van fibroblast genen en hebben upregulated veel erythroid genen.Na het uitvoeren van BFU-e kolonievormende testen op de geherprogrammeerde cellen, vormen dag acht iEPs twee soorten kolonies, duidelijk rood en niet zichtbaar rood. Terwijl cellen uit rode kolonies erythroblast morfologie vertoonden, deden cellen uit niet-rode kolonies dat niet. Ongeveer één op de 1.000 dag vijf iEPs vormden rode kolonies, terwijl slechts ongeveer één op de 10.000 kolonies gevormd is vanaf dag acht iEPs.Herprogrammering efficiëntie van staart-tip fibroblasten of TTF's wordt beïnvloed door het passagenummer. TTF's die negen keer waren doorgenomen, vertoonden een dramatische vermindering van het vermogen om clusters van iEP's te produceren in vergelijking met de cellen die drie keer waren doorgenomen. Bovendien kunnen verschillende cultuuromstandigheden van invloed zijn op de efficiëntie van het herprogrammeren.Getransduceerde TTF's gekweekt in normoxia zijn veel langzamer te herprogrammeren en IEP clusters worden waargenomen na 10 dagen in plaats van vijf tot acht dagen. Na deze procedure kunnen methoden zoals kolonievormende testen, qPCR- en FACS-analyse worden toegepast om de celdifferentiatiestatus te bepalen. Sinds de ontwikkeling maakt deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van erythropoiesis in het begrijpen van de switch tussen primitieve en definitieve erythroid cellen in muis en mens.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Muizen Dermaal Fibroblast Isolation door FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Genererende Primaire fibroblastculturen van Mouse Oor en de Staart Tissues

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Het beoordelen van Cardiomyocyte Subtypen Na transcriptie Factor-gemedieerde herprogrammeren van muis embryonale fibroblasten

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Onderdrukking van Pro-fibrotische signalering Potentiates Factor-gemedieerde herprogrammering van muis embryonale fibroblasten in geïnduceerde Cardiomyocytes

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Een directe en eenvoudige methode om de levensvatbaarheid van Drosophila melanogasterte beoordelen van embryo tot volwassene

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Vasculaire casting van volwassen en vroege postnatale muislongen voor micro-CT-beeldvorming

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...