Name: direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00
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Wir danken Evelyn Wang und Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) für das Klonen und Harvey Lodish (Whitehead Institut) für die Bereitstellung vieler der Plasmide, die für die Generierung der retroviralen Bibliothek verwendet. Wir danken Kavitha Siva und Sofie Singbrant (Abteilung für Molekularmedizin und Gene Therapy, Lund University), Göran Karlsson und Shamit Soneji (Abteilung für molekulare Hämatologie, Universität Lund) für ihre Rolle bei der Beschreibung des iEP Produktion. Wir würden auch gerne anerkennen und danke Julian Pulecio (Zentrum für Regenerationsmedizin, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent Institute of Medical Research und Departement für Medizin, St. Vincent Hospital, University of Melbourne), Ángel Raya (katalanische Institution für Forschung und Weiterbildung, Barcelona) und Vijay G. Sankaran (Broad Institute des Massachusetts Institute of Technology und Harvard, Cambridge ) für ihre bisherigen Beiträge zu dieser Arbeit. Diese Arbeit wurde unterstützt von der Ragnar Söderberg Stiftung (j.f.); die Swedish Research Council (, j.f.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (, j.f.); die schwedische Stiftung für strategische Forschung (, j.f.); Åke Wiberg Stiftung (j.f.); ein Marie Curie Integration Stipendium (j.f.).

1. Aufbau und die Pflege der primäre Maustaste Tail Tip Fibroblast Kulturen
<ol><li>Bereiten Sie Gelatine beschichtet Gerichte (empfehlen einen 10 cm Teller für ein Tail) durch Abdecken der Oberfläche mit 0,1 % Gelatine und Inkubation der Gerichte für ca. 20 min bei 37 ° C. Aspirieren Sie die Gelatine-Lösung aus der Schale und mindestens 2 Stunden trocknen lassen.</li>
	<li>Die Mäuse durch zervikale Dislokation einschläfern. Entfernen Sie die Rute mit einer Schere, Schnitt an der Unterseite der Rute. Setzen Sie...

<ol>
	<li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+We+Really+Vastly+Outnumbered?+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans.">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li><li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+multilineage+blood+progenitors.">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li><li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li><li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors.">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li><li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors.">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li><li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversions:+unnatural+but+useful.">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li><li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox.">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li><li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion.">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li><li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+reprogramming:+a+two-way+street.">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li><li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+couples+erythropoiesis,+B-lymphopoiesis,+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment.">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li><li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage.">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways.">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).</li><li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors.">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li><li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells.">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).</li></ol>

Überexpression eines vier-Faktoren-Cocktails, GATA1, TAL1, LMO2, und c-MYC (GTLM), ist ausreichend, um murinen und menschlichen Fibroblasten direkt an iEPs10neu zu programmieren. Die umprogrammierten erythroiden Zellen ähnelte stark Bona Fide erythroiden Vorläuferzellen hinsichtlich Morphologie, Phänotyp, Genexpression und koloniebildenden Fähigkeit. Dieser Befund bestätigt die B...

Rote Blutkörperchen (Erythrozyten) sind unverzichtbar bei allen Wirbeltieren und 84 % aller Zellen des menschlichen Körpers1ausmachen. Aus embryonalen ins Erwachsenenleben hängt unsere Gesundheit stark genaue Regelung der RBC Homöostase. Die laufende Produktion der Reifen Erythrozyten während der gesamten Entwicklung bis ins Erwachsenenalter wird als Erythropoese bezeichnet. Eine große Herausforderung in der Erythropoese Forschung ist die master Regler definieren, die RBC-Entwicklung und der Wechsel zwischen primitiven und endgültige Erythropoese zu orchestrieren. Direkte Linie Umprogrammierung der erythroiden Vorläuferzellen bietet die Möglichkeit, weitere erythroiden Entwicklung in Vivozu verstehen.
Direkte Linie Neuprogrammierung (DLR), auch bekannt als Transdifferenzierung, ist der Prozess der Umprogrammierung ein Zelltyp direkt ineinander pluripotenten und multipotenten Vorläuferzellen Phasen umgehen. DLR wurde bisher zur zahlreichen Zelltypen, einschließlich neural2, hämatopoetischen3,4,5, hepatische6 und nephrotisches7, Vorläuferzellen zu produzieren. Für Entwicklungs Biologen geworden DLR ein wichtiges Instrument zur abfragenden Aspekte der Linie Engagement und terminal Differenzierung Prozesse8,9. DLR ergänzen und teilweise ersetzen in Vivo Studien für Verständnis Mechanismen der Zelle Schicksal bestimmenden Faktoren bei der Entwicklung. Das DLR-Protokoll für die Umprogrammierung zu erythroiden Vorläuferzellen, die in diesem Dokument beschriebenen bietet Bereich eine kostenlose Methode für Studien der Erythropoese.
Wir haben bereits gezeigt, dass Überexpression eines vier-Faktoren-Cocktails, GATA1, TAL1, LMO2, und c-MYC (GTLM), ausreichend reprogram murine und menschlichen Fibroblasten direkt an induzierte erythroiden Vorläuferzellen (iEPs) 10. the GTLM umprogrammiert erythroiden Zellen ähneln stark Bona Fide primitive erythroiden Vorläuferzellen im Hinblick auf Morphologie, Phänotyp und gen Ausdruck10. So iEPs haben eine begrenzte Verbreitung Kapazität und Reifen zu kernhaltigen Erythrozyten ähnlich vorübergehend im frühen Embryo vor Beginn der endgültigen Erythropoese. Durch Änderungen in der Neuprogrammierung Bedingungen (z. B. Punktmutationen in Umprogrammierung Faktoren oder Zugabe von anderen Faktoren), kann man verstehen, wie dies zu Veränderungen in der erythroiden Entwicklung und Differenzierung führt. Wir haben zum Beispiel gezeigt, dass die Zugabe von Klf1 oder Myb GTLM Cocktail das Globin Expressionsmuster von überwiegend embryonalen (primitiv) verändert, vor allem Erwachsene (definitive). Dieser Befund bestätigt die Gültigkeit der mit DLR als Werkzeug zur Definition Entwicklungsfaktoren im Erythropoese.
Hier beschreiben wir den Prozess iEPs aus Maus Schweif Tipp Fibroblasten (TTF) zu erzeugen. In unseren repräsentativen Ergebnissen führten wir die Umprogrammierung auf Fibroblasten aus der erythroiden Abstammung-Ablaufverfolgung Mäuse (Epor- Cre R26- eYFP) Zellen, die das gelbe fluoreszierende Protein (eYFP) aus den Rosa26 Locus in allen Ausdrücken den Erythropoietin-Rezeptor, ermöglicht einfache Visualisierung des Engagements für die erythroiden Linie ausgedrückt haben. Mit dieser Methode sind bereits fünf Tage nach Transduktion YFP positivere (EpoR +) Zellen vorhanden. Dieses Protokoll bietet daher eine schnelle und robuste Technik für die Generation der erythroiden Vorläuferzellen in Vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1141px;" width="1142">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM without sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:505px;">Culturing media for PhGP cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM with sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30243.01</td>
			<td>Culturing media for tail tip fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)</td>
			<td style="width:167px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:123px;">9650</td>
			<td>Reprogramming media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum HyClone</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30071.03HI</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td>Antiboiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Non-Essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">11140050</td>
			<td>SNL media is suppplemented with this</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Trypsin HyClone (1x)</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30042.01</td>
			<td>Cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Murine Stem Cell Factor (mSCF)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">250-03</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Recombinant Murine Il-3</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">213-13</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">human recombinant erythropoietin (hrEPO)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-64</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">50-02-2&#160;&#160;</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">9000-70-8&#160;</td>
			<td>Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Blasticidin S hydrochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">3/9/3513</td>
			<td>Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30850.03</td>
			<td>Used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>Infection / Transfection&#160; Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:167px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td>Transfection Reagent for PhGP cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">BD Emerald Hypodermic Syringe</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">SKU: 307736</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm Culture Dish</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">10799541</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Jeweler Forceps #5</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">66-7642</td>
			<td>Used for handling small tail fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Sklarlite Iris Scissors</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">23-1149</td>
			<td>Used for cutting the tail into small pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:123px;">130-090-858</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">CD117 MicroBeads, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PheonixGP cells</td>
			<td style="width:167px;">ATCC</td>
			<td>CRL-3215</td>
			<td>retroviral packaging cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">EcoPAC vector (pCL-Eco)&#160;</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-29540</td>
			<td>retroviral helper vector containing gag and pol genes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Gata1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Tal1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Lmo2</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-cMyc</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellSens Standard 1.6 software&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Cytospin analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors

Erythroiden Zelle Engagement und Differenzierung fahren Sie durch Aktivierung eines Linie beschränkt transkriptionelle Netzwerks orchestriert von einer Gruppe von Zellen Schicksal bestimmen und Reifung Faktoren. Wir wollten früher minimalen Voraussetzungen für die Instruktion der roten Blutkörperchen Entwicklung mit direkten Abstammung Reprogrammierung von Fibroblasten in induzierte erythroiden Vorläuferzellen/Vorstufen (iEPs) definieren. Wir haben gezeigt, dass Überexpression des Gata1, Tal1, Lmo2und c-Myc (GTLM) können schnell konvertieren murinen und menschlichen Fibroblasten direkt zu iEPs, die Bona Fide erythroiden Zellen im Hinblick auf Morphologie, ähneln Phänotyp, und Genexpression. Wir beabsichtigen, dass iEPs ein wertvolles Instrument zur Regulierung der Erythropoese und Zelle Schicksal zu studieren liefern. Hier beschreiben wir den schrittweisen Prozess der Umwandlung murinen Schweif Tipp Fibroblasten in iEPs über Transkription Faktor-driven direkten Abstammung Neuprogrammierung (DLR). In diesem Beispiel führen wir die Umprogrammierung in Fibroblasten von erythroiden Abstammung-Ablaufverfolgung Mäuse, die das gelbe fluoreszierende Protein (YFP) unter der Kontrolle der Erythropoietin-Rezeptor gen (EpoR) Promotor, ermöglicht die Visualisierung der erythroiden Zelle ausdrücken Schicksal Induktion bei der Umprogrammierung. Nach diesem Protokoll können innerhalb von fünf bis acht Tagen Fibroblasten in iEPs umprogrammiert werden.
Während noch der Prozess verbessert werden kann, zeigen wir, dass Umprogrammierung GTLM vermittelt einen schnellen und direkten Prozess nachgeben Zellen mit Eigenschaften der Bona Fide erythroiden Vorläuferzellen und Vorläufer Zellen.

Hier präsentieren wir eine reproduzierbare Protokoll zur Herstellung von iEPs von Erwachsenen Fibroblasten mit Transkription Faktor-driven DLR. Wir bewerten die Zelle Neuprogrammierung mittels Durchflusszytometrie, koloniebildenden Assays und gen Expressionsanalyse. Um die Visualisierung der Konvertierung erythroiden Zelle Schicksal zu unterstützen, führten wir die Umprogrammierung auf Fibroblasten aus der erythroiden Abstammung-Ablaufverfolgung Mäuse (Epor- Cre R26-...

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Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Direkte Linie Reprogrammierung von adulten Maus-Fibroblasten zu erythroiden Vorläuferzellen

Hier stellen wir Ihnen unser Protokoll für Herstellung von induzierten erythroiden Vorläuferzellen (iEPs) von Maus Erwachsenen Fibroblasten mit Transkription Faktor-driven direkte Abstammung Neuprogrammierung (DLR).

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Direkte Lineage-Reprogrammierung von Fibroblasten zu Erythroid-Vorläuferzellen. Es ist eine neue Methode, die wir in unserem Labor entwickelt haben, um die Prozesse der Transkriptionsregulation, die das Erythroid-Zellschicksal bestimmt, besser zu untersuchen. Der Hauptvorteil bei der direkten Linienumprogrammierung, um die Entwicklung zu untersuchen, ist, dass es eine sehr einfache Technik ist.Im Vergleich zum Beispiel bei Funktionsverluststudien bei Knockout-Mäusen können wir hier sehr leicht den Faktor manipulieren, ihn zum bestimmten Zeitpunkt überausdrücken und dann leicht genug Material erhalten, um nachgelagerte Effekte wie Chromatin-Modifikationen oder Genexpressionsänderungen zu untersuchen. Während diese Methode konzentriert sich auf die Neuprogrammierung von Maus Schwanzspitze Fibroblasten zu Erythroid Vorläufer, Es kann auch auf andere Fibroblasten-Zelltypen angewendet werden, und auf andere Organismen einschließlich Menschen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Transfusionsmedizin, da sie den Weg zur Produktion roter Blutkörperchen in vitro ebnet.Das Verfahren wird Alban Johansson von meiner Forschungsgruppe demonstrieren. Beginnen Sie, indem Sie die Oberfläche der Gerichte mit 0,1% Gelatine bedecken. Inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für etwa 20 Minuten.Die Gelatinelösung ansaugen und das Geschirr trocknen lassen. Verwenden Sie eine Schere, um an der Basis des Schwanzes einer eingeschläferten Maus zu schneiden, um sie zu entfernen. Legen Sie den Schwanz in DPBS mit 2%FBS, bis sie einsatzbereit sind.In einer Gewebekulturhaube unter sterilen Bedingungen eine verdünnte Trypsinlösung von 0,02%Trypsin EDTA in DPBS zubereiten und 5 Milliliter in eine unbeschichtete 10-Zentimeter-Schale geben. In einer Gewebekulturhaube den Schwanz in ausreichend 70% Ethanol in einem 15-Milliliter-Rohr waschen, um ihn zu bedecken und dann in DPBS. Legen Sie den Schwanz flach in eine Schüssel und verwenden Sie Zangen, um es an Ort und Stelle zu halten.Verwenden Sie ein Skalpell, um einen Schnitt am Schwanz entlang seiner Längsachse von der Basis bis zur Spitze zu machen. Verwenden Sie ein Paar Zangen, um den Schwanz zu greifen und ihn vertikal zu halten und ein zweites Paar zu verwenden, um die Haut neben dem Schnitt an der Basis des Schwanzes zu greifen und ihn wieder zu schälen. Führen Sie dies an beiden Seiten des Einschnitts aus, bis die Haut abgeschält werden kann, indem Sie nach unten zur Schwanzspitze ziehen.Halten Sie den geschälten Schwanz mit Zange über die Schüssel, die die Trypsin-Lösung enthält. Verwenden Sie Eine Sezierschere, um den Schwanz in kleine Stücke zu schneiden. Verwenden Sie eine Schere, um diese Stücke in der Trypsin-Lösung in noch kleinere Stücke zu zersplittern und dann bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten zu brüten.Um das Trypsin zu löschen, fügen Sie zwei Bände FEX Medium, DMEM mit Ergänzungen und Antibiotika. Sammeln Sie den gesamten Inhalt der Schale in eine 50-Milliliter-Röhre. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 350 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Den Überstand ansaugen und das Pellet, das die Schwanzfragmente enthält, in 10 Milliliter frischem FEX-Medium wieder aufsetzen. Diese Suspension auf eine gelatinebeschichtete Schale übertragen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid und 4% Sauerstoff, hinzufügen frisches FEX Medium alle zwei Tage.Beobachten Sie die Kultur nach fünf bis sieben Tagen, in der die Schwanzfragmente am Boden der Schale befestigt sind und sich Fibroblasten von ihnen entfernen. Sobald Cluster von Fibroblasten sichtbar sind, schütteln Sie die Schale sanft, um Schwanzstücke zu vertreiben. Saugen Sie das Medium mit allen Knochenfragmenten, so dass die Fibroblasten an der Platte befestigt.Fügen Sie 10 Milliliter frisches FEX-Medium hinzu und kultiieren Sie die Fibroblasten bis zum Konfluent. Um sicherzustellen, dass es keine Kontamination durch hämatopoetische Vorläufer in der Fibroblastenkultur gibt, dissoziieren Sie die Zellen von der Platte mit Trypsin EDTA, wie im Manuskript beschrieben. Fügen Sie Medium und sammeln Sie die Zellen, und fügen Sie magnetische Perlen mit Antikörpern.Verwenden Sie ein magnetisches Trennsystem, um Zellen zu entfernen, die hämatopoetische Marker exdrücken. Die Einbeziehung dieses Schritts ist absolut notwendig, da er alle HSPCs eliminiert, die in der Kultur vorhanden sein könnten, und daher die Wahrscheinlichkeit falscher Positivmeldungen am Tag der FACS-Analyse. Samen retrovirale Verpackungszellen mit etwa 25.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf einer gewebekulturbehandelten Schale.Inkubieren Sie die Zellen in hochglukoseDMEM bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid über Nacht. Entfernen Sie am nächsten Morgen das Medium und fügen Sie die Hälfte des Volumens hinzu, das dmEM über Nacht ohne Zusatzstoffe kultiviert hat. Am Nachmittag überprüfen Sie die Zellen auf 70 bis 80 %konfluency, die für die Transfektion erforderlich sind.Beginnen Sie die Transfektion, indem Sie für jeden Reprogrammierungsfaktor eine Mischung aus zwei bis eins des Expressionsvektors PMX und drei Mikrogramm des Hilfsvektors mit Gag-, Pol- und Hüllkurvengenen vorbereiten. Als nächstes fügen Sie für jeden Reprogrammierungsfaktor 300 Mikroliter Raumtemperatur DMEM in ein steriles Polystyrolrohr ein. Dann fügen Sie vorsichtig 27 Mikroliter Raumtemperatur kommerzielle transfektionreagenz direkt in das Medium, um den Kontakt mit der Rohrwand zu vermeiden.Fügen Sie die Plasmidmischung in das transfektionshaltige Reagenz, das tube enthält. Wirbel kurz und inkubieren Sie die Mischung für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Wirbel das Transfektionsreagenz DNA-Gemisch wieder.Fügen Sie es tropfenweise zu den retroviralen Verpackungszellen hinzu, so dass es gleichmäßig über die Kultur verteilt ist und bei 37 Grad Celsius brütet. 24 Stunden nach der Transfektion entfernen Sie das Medium und fügen Sie DMEM mit 20%FBS und 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin Streptomycin hinzu. 48 Stunden nach der Transfektion den Überstand sammeln und durch einen Spritzenfilter in Porengröße von 0,22 Mikrometer filtern.Beginnen Sie die Transduktion, indem Sie die Schwanzspitzen-Fibroblasten mit 10 000 Zellen pro Quadratzentimeter auf 0,1% gelatinebeschichteten Schalen in FEX-Medium säen. 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Bei der Durchführung dieses Schritts ist es wichtig, die vier retroviralen Überstoffe in einem gleichen Verhältnis hinzuzufügen, um sicherzustellen, dass alle vier Transgene gleichermaßen zum Reprogrammierungsprozess beitragen.Am nächsten Tag bereiten Sie eine Transduktionsmischung vor, indem Sie zunächst ein Volumen viralen Überstands für jeden Reprogrammierungsfaktor hinzufügen, der mit vier Mikrogramm pro Milliliter retroviralem Infektionsreagenz auf sechs Bände FEX-Medium ergänzt wird. Danach das FEX-Medium aus der Fibroblastenkultur ansaugen und die Transduktionsmischung hinzufügen. Inkubieren Sie die Transduktionsreaktion für vier Stunden bei 37 Grad Celsius unter hypoxischen Bedingungen bei 5% Kohlendioxid und 4% Sauerstoff.Nach vier Stunden die Transduktionsmischung ansaugen und frisches Reprogrammierungsmedium hinzufügen. Inkubieren Bei 37 Grad Celsius in hypoxischen Bedingungen für acht Tage, Hinzufügen von frischen Reprogrammierung Medium alle zwei Tage. Beobachten Sie eine erfolgreiche Neuprogrammierung mit nachgegebenen Zellclustern, die von der Platte gelöst sind.Um umprogrammierte Zellen aus der Schale für weitere Analysen zu ernten, pipette sie sanft nach oben und unten und sammeln Sie dann die Zellen. Nach erfolgreicher Neuprogrammierung von iEPs sind YFP-positive Zellen bereits fünf Tage nach der Transduktion beobachtbar. Sie werden rund, heben sich von der Oberfläche der Platte, beginnen, Cluster zu bilden, und zeigen eine erythroide Vorläufer-ähnliche Morphologie.Hämoglobinierung einiger Zellen wird durch positive Benzidinfärbung deutlich. Eine kleine Fraktion drückt den erythroidspezifischen Oberflächenmarker TER-119 aus. Am achten Tag sind große YFP-positive Cluster zu sehen.Tag acht iEPs haben einen differenzierteren Erythroid-Phänotyp als Tag fünf iEPs. Sie sind deutlich kleiner, haben mehr Hämoglobin angesammelt und zeigen eine erhöhte Expression von TER-119. Die Genexpressionsanalyse von qPCR von iEPs, die am achten Tag gesammelt wurden, zeigt, dass sie die Expression von Fibroblasten fast heruntergefahren und viele Erythroidgene hochreguliert haben.Nach der Durchführung von BFU-e koloniebildenden Assays auf den neu programmierten Zellen bilden Tag acht iEPs zwei Arten von Kolonien, deutlich rot und nicht sichtbar rot. Während Zellen aus roten Kolonien Erythroblast-Morphologie zeigten, waren es Zellen aus nicht-roten Kolonien nicht. Etwa jeder zehnte Tag bildete fünf iEPs rote Kolonien, während nur etwa eine von 10.000 Kolonien ab Tag acht iEPs gebildet wurde.Die Reprogrammierungder Effizienz von Schwanzspitzen-Fibroblasten oder TTFs wird durch die Durchgangsnummer beeinflusst. TTFs, die neunmal durchdrungen waren, zeigten eine dramatische Verringerung der Fähigkeit, IEPs-Cluster zu produzieren, im Vergleich zu den Zellen, die dreimal durchdrungen worden waren. Darüber hinaus können unterschiedliche Kulturbedingungen die Effizienz der Neuprogrammierung beeinträchtigen.Transduced TTFs, die in Normoxia kultiviert werden, sind viel langsamer zu reprogrammieren und IEP-Cluster werden nach 10 Tagen statt fünf bis acht Tagen beobachtet. Nach diesem Verfahren können Methoden wie koloniebildende Assays, qPCR- und FACS-Analysen angewendet werden, um den Zelldifferenzierungsstatus zu bestimmen. Seit ihrer Entwicklung ebnet diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Erythropoese beim Verständnis des Wechsels zwischen primitiven und definitiven Erythroidzellen in Maus und Mensch.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Maus Umprogrammieren Embryonale Fibroblasten mit Transkriptionsfaktoren ein Hemogenic Programm zu induzieren

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Die Beurteilung Cardiomyocyte Subtypes Nach Transcription Factor-vermittelte Reprogrammierung von embryonalen Maus-Fibroblasten

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

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Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Unterdrückung der Pro-fibrotische Signalisierung potenziert Faktor-vermittelten Reprogrammierung von Maus embryonalen Fibroblasten in induzierte Kardiomyozyten

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

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Eine direkte und einfache Methode zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von Drosophila melanogastervom Embryo zum Erwachsenen

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Vaskuläres Gießen von Erwachsenen und frühpostnatalen Mauslungen für Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...