Name: direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

אנו מודים אוולין וואנג והייד גרגורי (מכון וייטהד, Cambridge, MA) על שיבוט, הארווי Lodish (מכון וייטהד) למתן רבים פלסמידים משמש ליצירת ספריית retroviral. אנו מודים Kavitha Siva, סופי Singbrant (המחלקה לרפואה מולקולרית, ריפוי גנטי, אוניברסיטת לונד), גוראן קרלסון, סאנג'י שמיט (המחלקה להמטולוגיה מולקולארית, אוניברסיטת לונד) על תפקידיהם בתיאור של ייצור iEP. אנחנו רוצים גם להכיר ולהודות ג'וליאן Pulecio (מרכז של רפואה רגנרטיבית, ברצלונה פארק מחקר ביו-רפואית), ויולטה זהורית-אסטרדה (רוקפלר אוניברסיטה, ניו יורק), קארל Walkley (המכון למחקר רפואי סנט וינסנט, מחלקת רפואה, בית החולים סנט וינסנט, אוניברסיטת מלבורן), רעיה אנחל (קטלאנית במוסד לחולי ומחקר ללימודים מתקדמים, ברצלונה), ענבר G. עמי הולצמן (מכון רחבה של מכון מסצ'וסטס של טכנולוגיה, הרווארד, קיימברידג ) על תרומתם קודמת לעבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי קרן Söderberg רגנר (כדי ג'יי); מחקר שוודי המועצה (כדי ג'יי); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (כדי ג'יי); העמותה השבדית לחקר אסטרטגי (כדי ג'יי); הקרן של אקא Wiberg (כדי ג'יי); מענק אינטגרציה מארי קירי (כדי ג'יי).

1. הקמה ותחזוקה של זנב העכבר הראשי עצה פיברובלסט תרבויות
<ol><li>להכין מאכלים מצופים ג'לטין (ממליץ על צלחת 10 ס מ עבור אחד זנב) על ידי ציפוי המשטח 0.1% ג'לטין המקננת המנות למשך כ 20 דקות ב 37 º C. האחות הפתרון ג'לטין מתוך קערה ולאפשר לו להתייבש במשך שעתיים לפחות.</li>
	<li>המתת חסד העכברים מאת נקע בצוואר הרח...

<ol>
	<li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+We+Really+Vastly+Outnumbered?+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans.">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li><li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+multilineage+blood+progenitors.">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li><li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li><li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors.">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li><li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors.">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li><li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversions:+unnatural+but+useful.">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li><li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox.">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li><li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion.">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li><li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+reprogramming:+a+two-way+street.">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li><li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+couples+erythropoiesis,+B-lymphopoiesis,+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment.">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li><li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage.">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways.">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).</li><li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors.">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li><li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells.">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).</li></ol>

ביטוי של קוקטייל ארבע-factor, GATA1, TAL1, LMO2, ו- c-MYC (GTLM), מספיקה לתכנת fibroblasts מאתר ואנושי ישירות אל iEPs10. התאים היו erythroid דמה מאוד בונה פיד ה אבות erythroid במונחים של מורפולוגיה, פנוטיפ, ביטוי גנים ויכולת המושבה יוצרי. ממצא זה אם יא...

תאי דם אדומים (RBCs) חיוניים כל החולייתנים ותשלימו 84% של כל התאים של הגוף האנושי1 מעובריים לחיים הבוגרים, הבריאות שלנו תלויה מאוד מדויק ההסדרה של RBC הומאוסטזיס. ייצור שוטף של בוגר RBCs במהלך פיתוח לבגרות מכונה אריתרופויזה. האתגר העיקרי במחקר אריתרופויזה הוא להגדיר הרגולטורים מאסטר זה שננהל את התפתחות RBC והבורר בין אריתרופויזה פרימיטיביים ומוחלטת. השושלת ישירה התכנות של אבות erythroid מהווה הזדמנות להבין עוד יותר erythroid פיתוח בתוך vivo.
השושלת ישירה התכנות (DLR), הידוע גם בשם transdifferentiation, הוא התהליך של התכנות סוג תא אחד ישירות לתוך אחר, תוך עקיפת pluripotent ושלבים קדמון multipotent. DLR שימש עד כה כדי לייצר סוגי תאים רבים כולל עצבית2,4,hematopoietic3,5, הכבד6 נפרוטית7, ובתאים. עבור ביולוגים התפתחותיים, DLR הפך כלי חשוב חוקר היבטים של שושלת היוחסין ומחויבות התמיינות סופנית תהליכים8,9. DLR ניתן להשלים ולהחליף חלקית ויוו ללימודי הבנה מנגנונים של גורל לקביעת גורמים במהלך הפיתוח. פרוטוקול DLR עבור התכנות אבות erythroid המתואר במאמר זה מספק השדה שיטה ללא תשלום עבור מחקרים התפתחותיים של אריתרופויזה.
בעבר הראו כי ביטוי קוקטייל ארבע-factor, GATA1, TAL1, LMO2, ו- c-MYC (GTLM), מספיקה לתכנת fibroblasts מאתר והן אנושיים ישירות אל erythroid המושרה אבות (iEPs) 10. erythroid היו GTLM תאים דומים במידה רבה bona פיד ה אבות erythroid פרימיטיבית במובן של ביטוי של מורפולוגיה, פנוטיפ, ג'ין-10. לפיכך iEPs מוגבלת יכולת התפשטות, התבגרת. דומים לאלו transiently מיוצר העובר מוקדם לפני התחלתה של אריתרופויזה סופית nucleated אריתרוציטים. על-ידי ביצוע שינויים בתנאים התיכנות (למשל, נקודת מוטציות בגן התכנות גורמים או גורמים אחרים), אפשר להבין איך זה יוביל לשינויים erythroid פיתוח ובידול. אנחנו למשל הראו כי תוספת של Klf1 או Myb GTLM במסיבת הקוקטייל משתנה התבנית ביטוי גלובין בעיקר עובריים (פרימיטיבי) כדי בעיקר למבוגרים (סופית). ממצא זה מאשר את החוקיות של השימוש DLR ככלי להגדרת גורמים התפתחותיים ב אריתרופויזה.
כאן, אנחנו חלוקה לרמות את התהליך של יצירת iEPs של עכבר זנב עצה fibroblasts (TTF). התוצאות נציג שלנו, ביצענו את התכנות על fibroblasts מן העכברים שושלת היוחסין-עקיבה erythroid (Epor- Cre R26- eYFP) אשר אקספרס החלבון הניאון צהוב (eYFP) של לוקוס Rosa26 כל התאים את זה הביעו את הקולטן אריתרופויאטין, המאפשר ויזואליזציה קל של מחויבות השושלת erythroid. באמצעות שיטה זו, YFP חיובי (EpoR +) תאים נוכחים מוקדם ככל חמישה ימים לאחר התמרה חושית. פרוטוקול זה, מציע לכן, טכניקה חזקה ומהירה לדור של erythroid אבות במבחנה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1141px;" width="1142">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM without sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:505px;">Culturing media for PhGP cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM with sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30243.01</td>
			<td>Culturing media for tail tip fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)</td>
			<td style="width:167px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:123px;">9650</td>
			<td>Reprogramming media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum HyClone</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30071.03HI</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td>Antiboiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Non-Essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">11140050</td>
			<td>SNL media is suppplemented with this</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Trypsin HyClone (1x)</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30042.01</td>
			<td>Cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Murine Stem Cell Factor (mSCF)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">250-03</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Recombinant Murine Il-3</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">213-13</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">human recombinant erythropoietin (hrEPO)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-64</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">50-02-2&#160;&#160;</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">9000-70-8&#160;</td>
			<td>Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Blasticidin S hydrochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">3/9/3513</td>
			<td>Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30850.03</td>
			<td>Used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>Infection / Transfection&#160; Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:167px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td>Transfection Reagent for PhGP cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">BD Emerald Hypodermic Syringe</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">SKU: 307736</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm Culture Dish</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">10799541</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Jeweler Forceps #5</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">66-7642</td>
			<td>Used for handling small tail fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Sklarlite Iris Scissors</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">23-1149</td>
			<td>Used for cutting the tail into small pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:123px;">130-090-858</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">CD117 MicroBeads, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PheonixGP cells</td>
			<td style="width:167px;">ATCC</td>
			<td>CRL-3215</td>
			<td>retroviral packaging cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">EcoPAC vector (pCL-Eco)&#160;</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-29540</td>
			<td>retroviral helper vector containing gag and pol genes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Gata1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Tal1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Lmo2</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-cMyc</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellSens Standard 1.6 software&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Cytospin analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors

Erythroid תא מחויבות ובידול המשך ההפעלה של שושלת היוחסין מוגבלת לרשת תעתיק בניצוחו של קבוצה של גורל קביעת והתבגרותו גורמים. קודם לכן יצאנו כדי להגדיר את ערכת מינימלי של הגורמים הדרושים להדרכת התפתחות תאי הדם האדומים באמצעות ישיר לשושלת התכנות של fibroblasts לתוך erythroid המושרה אבות/מבשרי (iEPs). הראנו את ביטוי של Gata1, Tal1, Lmo2ו- c-Myc (GTLM) יכול במהירות להמיר מאתר ואנושי fibroblasts ישירות אל iEPs הדומים פיד ה בונה תאים erythroid במונחים של מורפולוגיה, פנוטיפ, ביטוי גנים. בכוונתנו כי iEPs יספק כלי יקר ערך ללמוד אריתרופויזה ותא תקנה הגורל. כאן נתאר את תהליך stepwise המרת fibroblasts קצה הזנב מאתר iEPs דרך שעתוק מונחה גורם ישיר לשושלת התכנות (DLR). בדוגמה זו, אנו מבצעים את התכנות ב fibroblasts מן השושלת-עקיבה erythroid עכברים המבטאים החלבון הניאון צהוב (YFP) תחת השליטה של אריתרופויאטין קולטן ג'ין (EpoR) המקדם, המאפשר ויזואליזציה של תא erythroid אינדוקציה הגורל על התכנות. בעקבות פרוטוקול זה, שניתן לתכנת fibroblasts לתוך iEPs בתוך חמש עד שמונה ימים.
אמנם עדיין ניתן לבצע שיפורים לתהליך, אנו מראים כי בתיווך GTLM התכנות הוא תהליך מהיר וישיר, מניב תאים בעלי מאפיינים של פיד ה bona קדמון erythroid ותאי מבשר.

כאן אנו מציגים עבור הייצור של iEPs מ fibroblasts למבוגרים באמצעות שעתוק מקדם מונחה-DLR פרוטוקול לשחזור. נוכל להעריך את התא התכנות באמצעות cytometry זרימה, המושבה יוצרי מבחני ג'ין ביטוי ניתוח. על מנת לסייע החזיית ההמרה לגורל erythroid, ביצענו את התכנות על fibroblasts מן העכברים שושלת היוחסין-עקיב...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות

כאן אנו מציגים שלנו פרוטוקול עבור הפקת המושרה אבות erythroid (iEPs) מן העכבר fibroblasts למבוגרים באמצעות מונחי-פקטור שעתוק ישיר לשושלת התכנות (DLR).

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

תכנות מחדש של שושלת היוחסין מתאי פיברובלסט לתאי אב אריתרויד. זוהי שיטה חדשה שפיתחנו במעבדה שלנו כדי לחקור טוב יותר את התהליכים של ויסות שעתוק הקובע גורל תא אריתרופיד. היתרון העיקרי בשימוש בתכנות מחדש של שושלת ישרה כדי ללמוד פיתוח הוא שזו טכניקה פשוטה מאוד.אז בהשוואה, למשל, אובדן של מחקרים פונקציה בתוך עכברים נוקאאוט, כאן אנחנו יכולים בקלות רבה לתפעל את הגורם, לבטא אותו יתר על כן בנקודת זמן מסוימת, ולאחר מכן בקלות לקבל מספיק חומר כדי ללמוד השפעות במורד הזרם כגון שינויים כרומטין או שינויים ביטוי גנים. בעוד שיטה זו מתמקדת בתכנות מחדש של פיברובלסטים קצה הזנב של העכבר לאבות אריתרואידים, ניתן להחיל אותה גם על סוגי תאים פיברובלסטים אחרים, ועל אורגניזמים אחרים כולל בני אדם. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לכיוון רפואת עירוי גם כי זה סולל את הדרך לייצור של תאי דם אדומים במבחנה.הדגמת ההליך תהיה אלבן ג'והנסון מקיום המחקר שלי. התחל על ידי כיסוי פני השטח של הכלים עם 0.1% ג'לטין. דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ 20 דקות.שאף את תוסף הג'לטין ואפשר למנות להתייבש. השתמש במספריים כדי לחתוך בבסיס הזנב של עכבר המתת סנפיר כדי להסיר אותו. הנח את הזנב ב- DPBS עם 2%FBS עד שהוא מוכן לשימוש.במכסה המנוע של תרמת הרקמה בתנאים סטריליים, הכינו פתרון טריפסין מדולל של 0.02% טריפסין EDTA ב-DPBS והוסיפו 5 מיליליטר לצלחת לא צותתה של 10 ס"מ. במכסה המנוע של תרבות הרקמות, לשטוף את הזנב מספיק 70%אתנול בצינור 15 מיליליטר כדי לכסות אותו ולאחר מכן ב DPBS. מניחים את הזנב שטוח בצלחת ולהשתמש מדפים להחזיק אותו במקום.השתמש באזמל כדי לבצע חתך על הזנב לאורך ציר האורך שלו מהבסיס לקצה. השתמש בזוג מעצורים כדי לתפוס את הזנב ולהחזיק אותו אנכית ולהשתמש בזוג שני כדי לאחוז בעור ליד החתך בבסיס הזנב ולקלף אותו בחזרה. בצע זאת משני צידי החתך עד שניתן יהיה לקלף את העור על ידי משיכת כלפי מטה לכיוון קצה הזנב.החזק את הזנב קלוף עם מדפים מעל המנה המכילה את פתרון טריפסין. השתמש מספריים ניתוח לחתוך את הזנב לחתיכות קטנות. השתמש מספריים כדי לפצל את החלקים האלה בתווית טריפסין לחתיכות קטנות עוד יותר ולאחר מכן דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.כדי להתרווה טריפסין, להוסיף שני כרכים של מדיום FEX, DMEM עם תוספי מזון ואנטיביוטיקה. לאסוף את כל התוכן של המנה לתוך צינור 50 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 350 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.שאף את העל-טבעי והוסף מחדש את גלולת המכילה את שברי הזנב ב-10 מיליליטר של מדיום FEX טרי. מעבירים את ההשעיה לתבשיל מצופה ג'לטין. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני ו 4% חמצן, הוספת מדיום FEX טרי כל יומיים.שימו לב לתרבות לאחר חמישה עד שבעה ימים, שבהם שברי הזנב מחוברים בתחתית המנה, ופיברובלסטים מתרחקים מהם. לאחר אשכולות של fibroblasts גלויים, בעדינות לנער את המנה כדי לנתק חתיכות הזנב. שאפו את המדיום עם כל שברי העצם, והשאירו את הפיברובלסטים מחוברים לצלחת.הוסף 10 מיליליטר של מדיום FEX טרי ותרבות fibroblasts עד confluent. כדי להבטיח כי אין זיהום על ידי אבי hematopoietic בתרבות fibroblast, לנתק את התאים מהצלחת באמצעות טריפסין EDTA כמתואר בכתב היד. מוסיפים מדיום ואוסף את התאים ומוסיפים חרוזים מגנטיים עם נוגדנים.השתמש במערכת הפרדה מגנטית כדי להסיר תאים המבטאים סמנים hematopoietic. הכללת שלב זה היא חיונית לחלוטין משום שהיא מבטלת את כל HSPCs שעשויים להיות נוכחים בתרבות ולכן הסבירות של כל חיובי כוזב ביום הניתוח FACS. תאי אריזה רטרו-ויראליים של זרעים בערך 25,000 תאים לס"מ מרובע על צלחת שטופלה בתרבות הרקמה.הדגירה את התאים DMEM גלוקוז גבוה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני לילה. בבוקר שלמחרת, הסר את המדיה והוסף מחצית מאמצעי האחסון המשמש לתרבות בן לילה של DMEM ללא תוספים. אחר הצהריים, לבדוק את התאים עבור 70 עד 80% confluency הנדרש עבור transfection.התחילו את ההטעה על-ידי הכנת תערובת של 2 ל-1 של שישה מיקרוגרם של ה-PMX של וקטור הביטוי ושלושה מיקרוגרם של וקטור המסייע המכיל גנים של Gag, Pol ומעטפה עבור כל גורם תכנות מחדש. לאחר מכן, עבור כל גורם תכנות מחדש, הוסף 300 מיקרוליטרים של DMEM בטמפרטורת החדר בצינור פוליסטירן סטרילי. לאחר מכן הוסיפו בזהירות 27 מיקרוליטרים של רהט מסחרי בטמפרטורת החדר ישירות לתוך המדיום כדי למנוע מגע עם קיר הצינור.מוסיפים את תערובת הפלסמיד לתוך רגנט transfection המכיל צינור. מערבולת לזמן קצר להחגירה את התערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מערבולת תערובת הדנ"א של רגנט הטרנזיקציה שוב.מוסיפים אותו dropwise לתאי האריזה רטרו-ויראלי, כך שהוא מתפשט באופן שווה על פני התרבות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס. 24 שעות לאחר ההמרה, הסר את המדיום והוסף DMEM עם 20%FBS ו- 100 יחידות למיליליטר פניצילין סטרפטומיצין. 48 שעות לאחר ההמרה, לאסוף את supernatant ולסנן אותו דרך מסנן מזרק בגודל נקבובית 0.22 מיקרומטר.התחל את ההעתקה על ידי זריעת fibroblasts קצה הזנב ב 10, 000 תאים לסנטימטר מרובע על 0.1% ג'לטין מצופה מראש כלים במדיום FEX. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. בעת ביצוע שלב זה, חשוב להוסיף את ארבעת העל-טבעיים הרטרו-ויראליים ביחס שווה כדי להבטיח שכל ארבעת הטרנסג'נים יתרמו באופן שווה לתהליך התכנות מחדש.ביום שלמחרת, להכין תערובת transduction על ידי הוספת תחילה נפח אחד של על טבעי ויראלי עבור כל גורם תכנות מחדש בתוספת ארבעה מיקרוגרם למיליליטר של reagent זיהום רטרו-ויראלי לשישה כרכים של מדיום FEX. לאחר מכן, שאפו את מדיום ה-FEX מתרבות הפיברובלסט והוסיפו את תערובת ההעתקה. דגירה תגובת ההמרה במשך ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים היפוקסיים ב 5%פחמן דו חמצני ו 4% חמצן.לאחר ארבע שעות, שאפו את תערובת ההתמרה והוסיפו מדיום תכנות טרי. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בתנאים היפוקסיים במשך שמונה ימים, הוספת בינוני תכנות טרי כל יומיים. שימו לב לתכנות מחדש מוצלח עם אשכולות תאים שהניבו מנותקים מהלרשת.כדי לקצור תאים מתוכנתים מחדש מהצלחת לניתוח נוסף, בעדינות pipette אותם למעלה ולמטה ולאחר מכן לאסוף את התאים. לאחר תכנות מוצלח של iEPs, תאים חיוביים YFP ניתנים לצפייה כבר חמישה ימים לאחר ההתמרה. הם הופכים עגולים, להרים מפני השטח של הלוח, להתחיל להרכיב אשכולות, ולהציג מורפולוגיה דמוית מבשר אריתרואיד.המוגלוביניזציה של תאים מסוימים ניכרת על ידי כתמי בנצידין חיוביים. שבר קטן מבטא את סמן פני השטח הספציפי לאניתרויד TER-119. ביום השמיני, ניתן לראות אשכולות גדולים וחיוביים ל-YFP.יום שמונה iEPs יש פנוטיפ אריתרויד מובחן יותר מאשר יום חמש iEPs. הם קטנים משמעותית, צברו יותר המוגלובין, ומרגנים ביטוי מוגבר של TER-119. ניתוח ביטוי גנים על ידי qPCR של iEPs שנאספו ביום שמונה מראה כי הם כמעט לסגור את הביטוי של גנים fibroblast יש upregulated גנים אריתרואידים רבים.לאחר ביצוע בדיקות BFU-e להרכבת מושבה על התאים המתוכנתים מחדש, יום שמונה iEPs יוצרים שני סוגים של מושבות, אדום מובהק ולא אדום בעליל. בעוד תאים מהמושבות האדומות הציגו מורפולוגיה אריתרובלסט, תאים מהמושבות הלא אדומות לא. בערך אחד מכל 1,000 יום חמישה iEPs יצרו מושבות אדומות בעוד רק אחד מכל 10, 000 מושבות נוצרו מהיום שמונה iEPs.יעילות תכנות מחדש של fibroblasts קצה הזנב או TTFs מושפע מספר המעבר. TTFs שעברו תשע פעמים הראו ירידה דרמטית ביכולת לייצר אשכולות של iEPs בהשוואה לתאים שעברו שלושה פעמים. יתר על כן, תנאי תרבות שונים יכולים להשפיע על היעילות של תכנות מחדש.TTFs מתומרים בתרבות נורמוקסיה הם הרבה יותר איטי לתכנת מחדש אשכולות IEP נצפו לאחר 10 ימים במקום חמישה עד שמונה ימים. לאחר הליך זה, ניתן להחיל שיטות כגון בדיקה יוצרת מושבה, ניתוח qPCR ו- FACS כדי לקבוע את מצב ההידול בין התאים. מאז התפתחותה, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום אריתרופויז בהבנת המעבר בין תאים אריתרואידיים פרימיטיביים ומוחלטים בעכבר ובאדם.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

עכברי Dermal פיברובלסטים בידוד על ידי FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

תרבויות יצירה ראשיות פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב עכבר

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

דיכוי של Pro-fibrotic איתות Potentiates בתיווך גורם התכנות של העכבר מתחלקים Fibroblasts לתוך Cardiomyocytes המושרה

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

שיטה ישירה ופשוטה להערכת דרוזופילה מלאנוגסטרהכדאיות מעובר למבוגר

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

יציקת כלי דם של ריאות עכבר מבוגר ומוקדם לאחר הלידה עבור הדמיית מיקרו-CT

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...