Name: direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00
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レトロ ウイルス ライブラリを生成するために使用するプラスミドの多くを提供するクローニングとハーヴェイ Lodish (ホワイト ヘッド研究所)、イブ王とグレゴリー ・ ハイド (ホワイト ヘッド研究所、ケンブリッジ、MA) に感謝します。IEP 生産の説明での役割、Kavitha シヴァとソフィー Singbrant (分子医学、遺伝子治療、ルンド大学)、ヨーラン カールソンと Shamit Soneji (分子血液学の部門、ルンド大学) に感謝します。認め、ジュリアン ・ Pulecio (再生医療センター、バルセロナ医研究公園)、ビオレッタ レーヨン エストラーダ (ロックフェラー大学、ニューヨーク)、カール ・ スタッフ ・感謝も申し上げます (セント ・ ヴィンセント ・医学研究所とセントヴィンセントの病院、メルボルン大学の部門)、スペイン ・ ラヤ (研究や高度な研究、バルセロナのカタロニア語機関) とビジェイ G. Sankaran (ブロード研究所の技術とハーバード、ケンブリッジのマサチューセッツ大学) この作品へ以前の貢献。この作品は、(j. f.); にラグナル協会財団によって支えられました。スウェーデン研究評議会 (に j. f.)。Stiftelsen オルレ Engkvist Byggmästare (に j. f.)。スウェーデン (j. f.); に戦略的研究財団Åke ウヰーベルグ財団 (に j. f.)。(j. f.) に助成金統合マリー キュリー。

1. 確立及び維持プライマリ マウス尾先端培養線維芽細胞
<ol><li>0.1% ゼラチンで表面をカバーし、37 ° C で約 20 分の料理をインキュベート (1 尾 10 cm 皿をお勧めします) ゼラチン コーティングの料理を準備します。お皿からゼラチン溶液を吸引、少なくとも 2 時間乾燥するようにし、なさい。</li>
	<li>頚部転位によってマウスを安楽死させます。尾の根元切断ハサミ尾を削除します。ダルベッ?...

<ol>
	<li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+We+Really+Vastly+Outnumbered?+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans.">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li><li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+multilineage+blood+progenitors.">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li><li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li><li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors.">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li><li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors.">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li><li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversions:+unnatural+but+useful.">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li><li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox.">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li><li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion.">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li><li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+reprogramming:+a+two-way+street.">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li><li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+couples+erythropoiesis,+B-lymphopoiesis,+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment.">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li><li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage.">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways.">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).</li><li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors.">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li><li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells.">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).</li></ol>

4 因子カクテルの過剰発現、 GATA1、 TAL1、 LMO2、 C-MYC (GTLM)、組合10に直接マウスおよびひと線維芽細胞をプログラムし直すための十分なです。プログラムし直された赤芽球系細胞には、 bona fide赤血球前駆細胞の形態、表現型、遺伝子発現及びコロニー形成能の面で大きく類似していた。こ?...

赤い血球 (赤血球) はすべての脊椎動物に欠かせない、人間の体の1のすべてのセルの 84% を占めています。胚は大人の生活に、私たちの健康は RBC の恒常性の厳密な規則に依存です。大人になって開発全体を通して成熟した赤血球の継続的な生産は、赤血球と呼ばれます。赤血球の研究の主要な課題は、RBC 開発とプリミティブと決定的な赤血球間のスイッチの組み合わせによって、マスターのレギュレータを定義することです。直接系統の赤芽球系前駆細胞のリプログラミング赤芽球開発の生体をさらに理解する機会を示します。
直接系統のリプログラミング、分化転換としても知られている (DLR) は、リプログラミング多能性細胞と多能性前駆段階をバイパスして、別に直接 1 つの細胞型のプロセスです。DLR はこれまで神経2、造血3,4、5、肝6ネフローゼ7、前駆細胞など様々 な細胞タイプを生成する使用されています。発達生物学者の DLR の分化系列決定と分化プロセス8,9尋問側面の重要なツールとなっています。DLR を補完して生体内で研究開発中の要因を決定する細胞の運命のメカニズムの理解を部分的に交換できます。このペーパーで説明した赤芽球前駆細胞をリプログラミングの DLR プロトコルは、赤血球の発達的研究の無料メソッド フィールドを提供します。
我々 は以前 4 因子カクテルの過剰発現、 GATA1、 TAL1、 LMO2、 C-MYC (GTLM)、誘導の赤芽球系前駆細胞に直接マウスおよびひと線維芽細胞をプログラムし直すため十分であることを示しています。(投資事業組合)10.、GTLM 書き換え赤芽球系細胞大きく似ているbona fide原始赤血球前駆細胞の形態、表現型、遺伝子の表現のための10の面で。こうして組合は増殖能力を限定し、有核赤血球無核赤血球造血の発症前に初期胚における一過性作り出されるそれらのように成熟しました。リプログラミングの条件 (例えば、点突然変異の要因やその他の要因の追加をプログラムし直す) に変更して、どのようにこれは赤芽球発生と分化の変化につながる理解できます。たとえば示しました GTLM カクテルKlf1またはMybの添加が主に胚 (プリミティブ) からグロビン表現パターンを変更主に大人に (明確な)。この発見は、赤血球産生の発達的要因を定義するためのツールとして DLR を使用の妥当性を裏付けます。
ここでは、我々 は、マウス尾先端繊維芽細胞 (TTF) から組合を生成するプロセスを概説します。赤血球系統トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを行った代表的な実績 (EporCre R26- eYFP) すべてのRosa26軌跡から黄色い蛍光蛋白質 (eYFP) を表現するセル赤血球系統へのコミットメントを簡単に表示できるように、エリスロポエチンの受容体を表明しています。このメソッドを使用して、YFP 正 (EpoR +) 細胞が存在、早ければ 5 日伝達後です。このプロトコルは、したがって、赤芽球系前駆細胞の in vitroの世代の迅速かつ信頼性の高い技術を提供しています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1141px;" width="1142">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM without sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:505px;">Culturing media for PhGP cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM with sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30243.01</td>
			<td>Culturing media for tail tip fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)</td>
			<td style="width:167px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:123px;">9650</td>
			<td>Reprogramming media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum HyClone</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30071.03HI</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td>Antiboiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Non-Essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">11140050</td>
			<td>SNL media is suppplemented with this</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Trypsin HyClone (1x)</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30042.01</td>
			<td>Cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Murine Stem Cell Factor (mSCF)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">250-03</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Recombinant Murine Il-3</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">213-13</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">human recombinant erythropoietin (hrEPO)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-64</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">50-02-2&#160;&#160;</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">9000-70-8&#160;</td>
			<td>Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Blasticidin S hydrochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">3/9/3513</td>
			<td>Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30850.03</td>
			<td>Used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>Infection / Transfection&#160; Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:167px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td>Transfection Reagent for PhGP cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">BD Emerald Hypodermic Syringe</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">SKU: 307736</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm Culture Dish</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">10799541</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Jeweler Forceps #5</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">66-7642</td>
			<td>Used for handling small tail fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Sklarlite Iris Scissors</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">23-1149</td>
			<td>Used for cutting the tail into small pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:123px;">130-090-858</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">CD117 MicroBeads, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PheonixGP cells</td>
			<td style="width:167px;">ATCC</td>
			<td>CRL-3215</td>
			<td>retroviral packaging cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">EcoPAC vector (pCL-Eco)&#160;</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-29540</td>
			<td>retroviral helper vector containing gag and pol genes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Gata1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Tal1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Lmo2</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-cMyc</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellSens Standard 1.6 software&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Cytospin analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors

赤芽球系細胞と分化細胞の運命を決定する、要因の成熟のグループによって仕組まれた血統制限の転写ネットワークの活性化を続行します。以前誘導赤芽球前駆細胞/前駆体 (投資事業組合) に線維芽細胞のプログラムし直す直接系統を使用した赤血球の開発を指示するために必要な要因の最小限のセットを定義に着手しました。Gata1、過剰発現を示したTal1、 Lmo2、およびC-myc (GTLM) が急速に変換マウスおよびひと線維芽細胞直接投資事業組合形態の観点から善意の赤芽球系細胞のように表現型、遺伝子発現。組合が赤血球や細胞の運命制御を研究する非常に貴重なツールを提供する予定です。ここで我々 は投資事業組合経由で転写因子駆動直接系統 (DLR) のリプログラミングにマウス尾先端線維芽細胞を変換する段階的なプロセスをについて説明します。この例では赤芽球系細胞の可視化を有効にする、エリスロポエチン受容体遺伝子 (EpoR) プロモーターの制御下の黄色い蛍光蛋白質 (YFP) を表す赤血球系統トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを行う運命誘導リプログラミングに。このプロトコルでは、次は、この線維芽細胞を 5 ~ 8 日以内投資事業組合に書き換えることができます。
改善はプロセスにまだ行うことができます、ことを示すリプログラミング GTLM を介した迅速かつ直接プロセスbona fideのプロパティを持つセルの赤芽球系前駆細胞および前駆細胞を降伏します。

大人の線維芽細胞の転写因子ドリブン DLR を使用してから組合の生産のための再現可能なプロトコルをご紹介します。フローサイトメトリー、コロニー形成の試金、および遺伝子を使用して細胞のリプログラミングを評価する発現解析。赤芽球系細胞の運命への転換の可視化を支援するために赤芽球系の系譜トレース マウス線維芽細胞のリプログラミングを行った (<e...

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Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

リネージュの赤芽球系前駆細胞に成体マウス線維芽細胞のリプログラミングを直接します。

ここで紹介は私達のプロトコルによる生産の赤芽球系前駆細胞 (投資事業組合) 転写因子駆動を用いたマウス アダルト繊維芽細胞からダイレクトリプログラミング系統 (DLR)。

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

線維芽細胞からエリスロイド前駆細胞への直接系統リプログラミング。これは、エリスロイド細胞の運命を決定する転写調節のプロセスをよりよく研究するために、私たちの研究室で開発した新しい方法です。直接系統リプログラミングを使用して開発を研究する主な利点は、非常に簡単なテクニックであるということです。したがって、例えばノックアウトマウス内の機能研究の喪失と比較して、ここでは非常に簡単に因子を操作し、特定の時点でそれを過剰発現させ、クロマチン修飾や遺伝子発現変化などの下流の効果を研究するのに十分な材料を簡単に得ることができます。この方法は、エリスロイド前駆細胞へのマウスの尾先端線維芽細胞の再プログラミングに焦点を当てるが、それはまた、他の線維芽細胞タイプ、およびヒトを含む他の生物に適用することができる。この技術の意味は、輸血医学に向かって広がって、それはインビトロで赤血球の生産に向けて道を開く.この手順を実証することは、私の研究グループのアルバン・ヨハンソンです。0.1%ゼラチンで皿の表面を覆うことから始めます。摂氏37度で約20分間インキュベートします。ゼラチン溶液を吸引し、皿を乾燥させます。安楽死させたマウスの尻尾の付け根で切り取って取り除きます。2%FBS の DPBS に尾を置いて、すぐに使用できます。無菌状態の組織培養フードで、DPBSで0.02%トリプシンEDTAの希釈トリプシン溶液を調製し、コーティングされていない10センチメートル皿に5ミリリットルを加えます。組織培養フードでは、15ミリリットルのチューブで十分な70%エタノールで尾を洗浄し、DPBSで覆います。皿に尻尾を平らに置き、鉗子を使って所定の位置に保持します。メスを使用して、ベースから先端までの縦軸に沿って尾を切開します。一対の鉗子を使用して尾をつかんで垂直に保持し、2番目のペアを使用して尾部の根元の切開の横の皮膚をつかみ、それを剥がします。皮膚が尾の先端に向かって下方に引っ張ることによって剥がれるまで、切開の両側でこれを行います。トリプシン溶液を含む皿の上に鉗子で皮をむいた尾を保持します。解剖はさみを使用して尾を小さく切ります。はさみを使用してトリプシン溶液中のこれらの部分をさらに小さく断片化し、摂氏37度で10分間インキュベートします。トリプシンをクエンチするには、サプリメントと抗生物質とFEX培地、DMEMの2つのボリュームを追加します。50ミリリットルのチューブに皿の内容物全体を収集します。チューブを摂氏4度で5分間350倍Gで遠心分離する。上清を吸引し、新鮮なFEX培地の10ミリリットルに尾片を含むペレットを再懸濁する。この懸濁液をゼラチンコーティングされた皿に移します。5%の二酸化炭素と4%の酸素で摂氏37度でインキュベートし、2日ごとに新鮮なFEX培地を加えます。5~7日後、尾片が皿の底に付着し、線維芽細胞がそれらから離れて移動している培養を観察します。線維芽細胞のクラスターが見えたら、皿を軽く振って尾片を取り除きます。すべての骨片で培地を吸引し、線維芽細胞をプレートに取り付けたままにする。新鮮なFEX培地の10ミリリットルを加え、繊維芽細胞をコンフルエントになるまで培養する。線維芽細胞培養における造血前駆物質による汚染がないことを確実にするために、原稿に記載されているようにトリプシンEDTAを用いてプレートから細胞を解離する。培地を加え、細胞を収集し、抗体を用いて磁気ビーズを添加します。造血マーカーを発現する細胞を除去するために磁気分離システムを使用してください。このステップを含めると、培養に存在する可能性のある HSPCs が排除され、FACS 分析の日に誤検出が発生する可能性がなくなります。レトロウイルス包装細胞を約25,000細胞/平方センチメートルで組織培養処理皿にシードします。摂氏37度と5%の二酸化炭素で高グルコースDMEMで細胞を一晩インキュベートします。翌朝、培地を取り出し、添加物を含めずに一晩培養するために使用する体積の半分を加えます。午後には、トランスフェクションに必要な70〜80%の合流性について細胞を確認してください。トランスフェクションを開始するには、発現ベクター PMX の 6 マイクログラムと、各リプログラミングファクターに対して Gag、Pol、およびエンベロープ遺伝子を含むヘルパーベクターの 3 マイクログラムの 2 ~ 1 の混合物を準備します。次に、各リプログラミング因子について、滅菌ポリスチレンチューブに300マイクロリットルの室温DMEMを加えます。その後、慎重にチューブ壁との接触を避けるために、培地に直接室温の商業トランスフェクション試薬の27マイクロリットルを追加します。プラスミドミックスをチューブを含むトランスフェクション試薬に加えます。渦を短時間、室温で15分間インキュベートする。トランスフェクション試薬DNA混合物を再びボルテックスする。レトロウイルス包装細胞に滴下して、培養物に均等に広がり、摂氏37度でインキュベートします。トランスフェクションの24時間後、培地を取り出し、20%FBSと1ミリリットルペニシリンストレプトマイシンあたり100単位でDMEMを追加します。トランスフェクションの48時間後、上清を収集し、0.22マイクロメーターの細孔サイズのシリンジフィルターを通してそれをフィルタリングします。FEX培地で0.1%ゼラチンプレコーティングされた皿に1平方センチメートルあたり10,000細胞で尾先端線維芽細胞を播種することによって、トランスダクションを開始します。摂氏37度で24時間インキュベートします。このステップを実施する際には、4つのレトロウイルス上清を等しい比率で添加し、4つの遺伝子すべてがリプログラミングプロセスに等しく寄与することを保証することが重要です。翌日、最初にレトロウイルス感染試薬のミリリットル当たり4マイクログラムを6回のFEX培地に添加した各リプログラミング因子に対して1回のウイルス上清を1回加えて、トランスダクション混合物を調製する。その後、FEX培地を線維芽細胞培養物から吸引し、その導入混合物を添加する。5%の二酸化炭素と4%の酸素で低酸素条件で摂氏37度で4時間のトランスダクション反応をインキュベートします。4時間後、トランスダクション混合物を吸引し、新鮮なリプログラミング培地を加える。低酸素状態で摂氏37度で8日間インキュベートし、2日ごとに新鮮なリプログラミング培地を追加します。プレートから切り離された細胞の導出されたクラスターで、成功したリプログラミングを観察します。さらなる分析のために皿から再プログラムされた細胞を収穫するには、それらを上下に穏やかにピペットし、細胞を収集します。iEPsのリプログラミングに成功した後、YFP陽性細胞は、伝達後5日で観察可能です。それらは丸くなり、プレートの表面から持ち上がり、クラスターを形成し始め、赤血球前駆体のような形態を示す。いくつかの細胞のヘモグロビン化は、陽性ベンジジン染色によって明らかである。小さい分率はエリスロイド特異的表面マーカーTER-119を表す。8日目までに、大きなYFP陽性クラスターが見られます。8日目のiEPsは、5日目のiEPsよりも分化したエリスロイド表現型を有する。それらは有意に小さく、より多くのヘモグロビンを蓄積しており、TER-119の発現の増加を示す。8日目に収集されたiEPsのqPCRによる遺伝子発現解析は、線維芽細胞遺伝子の発現をほぼ遮断し、多くのエリスロイド遺伝子をアップレギュレートしていることを示している。再プログラムされた細胞にBFU-eコロニー形成アッセイを行った後、8日目のiEPsは、明らかに赤色で目に見えない2種類のコロニーを形成する。赤いコロニーからの細胞は赤血球形態を示したが、非赤コロニーからの細胞は示さなかった。約1,000日目の5つのiEPsの約1つは赤いコロニーを形成し、8日目のiEPsから形成されたコロニーは約10,000コロニーに1つだけでした。尾先端線維芽細胞またはTTFの再プログラミング効率は、通過数の影響を受ける。9回通過したTTFは、3回通過した細胞と比較して、iEPsのクラスターを産生する能力が劇的に低下したことを示した。さらに、異なる培養条件は、リプログラミングの効率に影響を与える可能性があります。ノルモキシアで培養されたトランスデューセTTFは再プログラムが非常に遅く、IEPクラスターは5〜8日ではなく10日後に観察される。この手順に従って、コロニー形成アッセイ、qPCRおよびFACS分析などの方法を適用して、細胞分化状態を決定することができる。この技術は、その発展以来、マウスとヒトの原始細胞と決定的なエリスロイド細胞の切り替えを理解する上で、エリスロポエシスの分野の研究者に道を開いています。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

神経の分析のための成体マウスのV-SVZにおける細胞の安定的かつ効率的な遺伝子改変幹細胞自律と非自律効果

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

マウスの耳としっぽの組織から生成初代線維芽細胞培養

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

プロ線維性シグナル伝達の抑制を促進する誘導心筋細胞マウス胚性線維芽細胞のリプログラミング因子を介した

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

ショウジョウバエメラノガスターの胚から成人への生存率を評価する直接的かつ簡単な方法

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

マイクロCTイメージング用成人および早期産後マウス肺の血管鋳造

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...