Name: direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

Vi takker Evelyn Wang og Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) for kloning og Harvey Lodish (Whitehead Institute) for å gi mange av plasmider brukes til å generere retroviral biblioteket. Vi takker Kavitha Siva og Sofie Singbrant (Institutt for molekylær medisin og Gene Therapy, Lund universitet), Göran Karlsson og Shamit Soneji (Institutt for molekylær hematologi, Lund universitet) for sine roller i Beskrivelse av IOP produksjon. Vi ønsker også å erkjenne og takke Julian Pulecio (sentrum av regenerativ medisin, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent's Institute for Medical Research og Institutt for medisin, St. Vincent sykehuset, University of Melbourne), Ángel Raya (katalansk institusjon for forskning og studier, Barcelona) og Vijay G. Sankaran (bred Institute av Massachusetts Institute of Technology og Harvard, Cambridge ) for sine tidligere bidrag til dette arbeidet. Dette arbeidet ble støttet av Ragnar Söderberg Foundation (til J.F.); Svenske Forskningsrådet (til J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (å J.F.); Svenske stiftelsen til strategisk forskning (til J.F.); Åke Wiberg Foundation (til J.F.); Marie Curie integrering stipend (til J.F.).

1. etableringen og vedlikeholdet av hovedknappen på musen halen tips Fibroblast kulturer
<ol><li>Forbered gelatin-belagt retter (anbefaler en 10 cm rett for en hale) ved dekker overflaten med 0,1% gelatin og rugende retter for ca 20 min på 37 ° C. Sug opp gelatin løsningen fra retten og la det tørke i minst 2 timer.</li>
	<li>Euthanize musene av cervical forvridning. Fjerne halen med saks, kutte ved foten av halen. Sett halen i Dulbeccos fosfat-bufret saltvann (DPBS) med 2% fosterets bovin serum (FBS) til klar til...

<ol>
	<li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+We+Really+Vastly+Outnumbered?+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans.">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li><li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+multilineage+blood+progenitors.">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li><li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li><li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors.">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li><li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors.">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li><li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversions:+unnatural+but+useful.">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li><li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox.">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li><li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion.">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li><li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+reprogramming:+a+two-way+street.">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li><li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+couples+erythropoiesis,+B-lymphopoiesis,+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment.">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li><li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage.">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways.">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).</li><li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors.">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li><li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells.">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).</li></ol>

Overuttrykte en fire-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, og c-MYC (GTLM), er nok å omprogrammere murine og menneskelig fibroblaster direkte til iEPs10. Omprogrammeres erythroid cellene sterkt lignet bona fide erythroid progenitors morfologi, fenotype, genuttrykk og colony-forming evne. Dette funnet bekrefter begrunnelsen av benytter direkte omprogrammering som et verktøy for å defin...

Røde blodlegemer (RBCs) er viktig i Alle virveldyr og utgjør 84% av alle celler i menneskelige organer1. Fra embryonale til voksne liv er vår helse svært avhengig av nøyaktig regulering av RBC homeostase. Kontinuerlig produksjon av modne RBCs gjennom utvikling i voksen alder er kjent som erythropoiesis. En stor utfordring i erythropoiesis forskning er å definere master regulatorer som arrangerer RBC utvikling og Bytt mellom primitive og endelig erythropoiesis. Direkte avstamning omprogrammering av erythroid progenitors gir en mulighet til videre forstå erythroid utvikling i vivo.
Direkte avstamning omprogrammering (DLR), også kjent som transdifferentiation, er prosessen med reprogramming en celle type direkte til en annen, omgåelsen pluripotent og multipotent stamfar stadier. DLR har så langt blitt brukt til å produsere mange celletyper inkludert nevrale2, blodkreft3,4,5, hepatic6 og nephrotic7, stamfar celler. For utviklingsmessige biologer, har DLR blitt et viktig verktøy for avhør aspekter av slekten engasjement og terminal differensiering prosesser8,9. DLR kan utfylle og delvis erstatte i vivo studier for forståelse mekanismer for cellen skjebnen bestemme faktorer under utvikling. DLR protokollen omprogrammere til erythroid progenitors beskrevet i dette dokumentet inneholder feltet en gratis metode for utviklingsmessige studier av erythropoiesis.
Vi har tidligere vist at overuttrykte en fire-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, og c-MYC (GTLM), er tilstrekkelig til å omprogrammere både murine og menneskelig fibroblaster direkte til indusert erythroid progenitors (iEPs) 10. den GTLM-omprogrammeres erythroid celler ligner sterkt bona fide primitive erythroid progenitors i morfologi, fenotype og gene expression10. Dermed iEPs har begrenset spredning kapasitet og modne til kjerne erytrocytter lik de transiently produsert i tidlig embryo før utbruddet av endelig erythropoiesis. Ved å gjøre endringer i reprogramming forhold (f.eks punkt mutasjoner i omprogrammering faktorer eller tillegg av andre faktorer), kan man forstå hvordan dette fører til endringer i erythroid utvikling og differensiering. Vi har for eksempel vist at tillegg av Klf1 eller Myb til GTLM cocktail endres globin uttrykk mønsteret fra hovedsakelig embryonale (primitive) til hovedsakelig voksen (endelig). Dette funnet bekrefter gyldigheten av å bruke DLR som et verktøy for å definere utviklingsmessige faktorer i erythropoiesis.
Her skissere vi prosessen med å generere iEPs fra musen halen tips fibroblaster (TTF). I vår representant resultater, vi utført omprogrammering på fibroblaster fra erythroid avstamning-sporing mus (Epor- grobunn R26- eYFP) som express gule fluorescerende protein (eYFP) fra Rosa26 locus i alle celler som uttrykt erytropoietin reseptoren, tillater lett visualisering av forpliktelse til den erythroid avstamning. Bruker denne metoden, finnes YFP positive (EpoR +) celler allerede fem dager etter signaltransduksjon. Denne protokollen, derfor gir en rask og robust teknikk for generering av erythroid progenitors i vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1141px;" width="1142">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM without sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:505px;">Culturing media for PhGP cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM with sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30243.01</td>
			<td>Culturing media for tail tip fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)</td>
			<td style="width:167px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:123px;">9650</td>
			<td>Reprogramming media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum HyClone</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30071.03HI</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td>Antiboiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Non-Essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">11140050</td>
			<td>SNL media is suppplemented with this</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Trypsin HyClone (1x)</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30042.01</td>
			<td>Cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Murine Stem Cell Factor (mSCF)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">250-03</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Recombinant Murine Il-3</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">213-13</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">human recombinant erythropoietin (hrEPO)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-64</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">50-02-2&#160;&#160;</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">9000-70-8&#160;</td>
			<td>Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Blasticidin S hydrochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">3/9/3513</td>
			<td>Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30850.03</td>
			<td>Used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>Infection / Transfection&#160; Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:167px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td>Transfection Reagent for PhGP cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">BD Emerald Hypodermic Syringe</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">SKU: 307736</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm Culture Dish</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">10799541</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Jeweler Forceps #5</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">66-7642</td>
			<td>Used for handling small tail fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Sklarlite Iris Scissors</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">23-1149</td>
			<td>Used for cutting the tail into small pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:123px;">130-090-858</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">CD117 MicroBeads, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PheonixGP cells</td>
			<td style="width:167px;">ATCC</td>
			<td>CRL-3215</td>
			<td>retroviral packaging cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">EcoPAC vector (pCL-Eco)&#160;</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-29540</td>
			<td>retroviral helper vector containing gag and pol genes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Gata1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Tal1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Lmo2</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-cMyc</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellSens Standard 1.6 software&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Cytospin analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors

Erythroid celle engasjement og differensiering fortsette gjennom aktivering av avstamning begrenset transcriptional nettverk orkestrert av en gruppe celle skjebnen bestemme og modning faktorer. Vi tidligere satt ut for å definere et minimumssett med faktorene på krevd for instruere røde blodlegemer utvikling med direkte avstamning omprogrammering av fibroblaster til indusert erythroid progenitors/prekursorer (iEPs). Vi viste at overuttrykte Gata1, Tal1, Lmo2og c-Myc (GTLM) kan raskt konvertere murine og menneskelig fibroblaster direkte til iEPs som ligner bona fide erythroid celler i morfologi, fenotype, og genuttrykk. Ønsker vi at iEPs vil gi et uvurderlig verktøy for å studere erythropoiesis og celle skjebne regulering. Her beskriver vi gradvis prosessen med å konvertere murine hale tips fibroblaster til iEPs via transkripsjon faktor-drevet direkte avstamning omprogrammering (DLR). I dette eksemplet utfører vi omprogrammere i fibroblaster fra erythroid avstamning-sporing mus som uttrykker gule fluorescerende protein (YFP) under kontroll av erytropoietin reseptor genet (EpoR) selskapet, aktivere visualisering av erythroid celle skjebne induksjon på reprogramming. Etter denne protokollen, fibroblaster kan omprogrammeres til iEPs innen fem til åtte dager.
Mens forbedringer kan fortsatt gjøres til prosessen, viser vi at GTLM-mediert omprogrammering er en rask og direkte prosess, gir celler med egenskapene for bona fide erythroid stamfar og forløper celler.

Her presenterer vi en reproduserbar protokoll for produksjon av iEPs fra voksen fibroblaster med transkripsjon faktor-drevet DLR. Vi evaluerer celle omprogrammering med flowcytometri colony-forming analyser og gene expression analyse. For å bistå i visualisering av konverteringen til erythroid celle skjebne, vi utført omprogrammering på fibroblaster fra erythroid avstamning-sporing mus (Epor- grobunn R26- eYFP) som express gule fluorescerende protein (eYFP) fra R...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Direkte avstamning omprogrammering av voksen mus Fibroblast å Erythroid Progenitors

Her presenterer vi våre protokollen for produsere indusert erythroid progenitors (iEPs) fra musen voksen fibroblaster med transkripsjon faktor-drevet direkte avstamning omprogrammering (DLR).

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Direkte avstamning omprogrammering fra fibroblaster til erythroid stamceller. Det er en ny metode vi har utviklet i laboratoriet vårt for å bedre studere prosessene med transkripsjonsregulering som bestemmer erythroid celle skjebne. Den største fordelen med å bruke direkte avstamning omprogrammering for å studere utvikling er at det er en veldig grei teknikk.Så sammenlignet med for eksempel tap av funksjonsstudier innen knockout mus, her kan vi veldig enkelt manipulere faktoren, over-uttrykke det på det bestemte tidspunktet, og deretter lett få nok materiale til å studere nedstrøms effekter som kromatin modifikasjoner eller genuttrykk endringer. Mens denne metoden fokuserer på omprogrammering av mus hale-tip fibroblaster til erythroid stamfar, det kan også brukes til andre fibroblast celletyper, og til andre organismer inkludert mennesker. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot transfusjonsmedisin ved at den baner vei mot produksjon av røde blodlegemer in vitro.Å demonstrere prosedyren vil være Alban Johansson fra forskningsgruppen min. Begynn med å dekke overflaten av oppvasken med 0,1% gelatin. Inkuber dem ved 37 grader Celsius i ca 20 minutter.Aspirer gelatinoppløsningen og la oppvasken tørke. Bruk saks til å kutte på bunnen av halen av en eutanisert mus for å fjerne den. Plasser halen i DPBS med 2% FBS til den er klar til bruk.I en vevskulturhette under sterile forhold, lag en fortynnet trypsinløsning på 0,02% trypsin EDTA i DPBS og tilsett 5 milliliter i en ubestrøket 10-centimeters tallerken. I en vevskulturhette, vask halen i nok 70% etanol i et 15-milliliter rør for å dekke den og deretter i DPBS. Plasser halen flatt i en tallerken og bruk tang til å holde den på plass.Bruk en skalpell for å gjøre et snitt på halen langs sin langsgående akse fra basen til spissen. Bruk et par tang til å gripe halen og hold den vertikalt og bruk et annet par til å gripe huden ved siden av snittet ved foten av halen og skrelle den tilbake. Utfør dette på begge sider av snittet til huden kan skrelles av ved å trekke nedover mot spissen av halen.Hold den skrelles halen med tang over parabolen som inneholder trypsinløsningen. Bruk disseksjon saks for å kutte halen i små biter. Bruk saks til å fragmentere disse bitene i trypsinløsningen i enda mindre biter og inkuber deretter ved 37 grader Celsius i 10 minutter.For å slukke trypsin, legg til to volumer av FEX medium, DMEM med kosttilskudd og antibiotika. Samle hele innholdet i parabolen i et 50-milliliter rør. Sentrifuger røret ved 350 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius.Aspirer den overnaturante og resuspend pellet som inneholder halefragmentene i 10 milliliter friskT FEX medium. Overfør denne suspensjonen til en gelatinbelagt tallerken. Inkuber ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid og 4% oksygen, og tilsetter frisk FEX medium annenhver dag.Observere kulturen etter fem til syv dager, der halefragmentene har festet på bunnen av parabolen, og fibroblaster beveger seg bort fra dem. Når klynger av fibroblaster er synlige, rist forsiktig parabolen for å løsne halebitene. Aspirer mediet med alle beinfragmentene, og la fibroblastene festes til platen.Tilsett 10 milliliter friskt FEX medium og kultur fibroblastene til samløpet. For å sikre at det ikke er kontaminering av hematopoetiske forfedre i fibroblastkulturen, dissosiere cellene fra platen ved hjelp av trypsin EDTA som beskrevet i manuskriptet. Tilsett medium og samle cellene, og legg til magnetiske perler med antistoffer.Bruk et magnetisk separasjonssystem for å fjerne celler som uttrykker hematopoetiske markører. Inkludert dette trinnet er helt avgjørende fordi det eliminerer eventuelle HSPCer som kan være tilstede i kulturen og derfor sannsynligheten for falske positiver på dagen for FACS-analysen. Frø retrovirale emballasjeceller på ca 25.000 celler per kvadratcentimeter på en vevskultur behandlet tallerken.Inkuber cellene i høyt glukose DMEM ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid over natten. Neste morgen fjerner du mediet og legger til halvparten av volumet som brukes til kultur over natten av DMEM uten tilsetningsstoffer. På ettermiddagen, sjekk cellene for 70 til 80% samløpet som kreves for transfeksjon.Begynn transfection ved å forberede en to til en blanding av seks mikrogram av uttrykket vektor PMX og tre mikrogram av hjelper vektoren som inneholder Gag, Pol, og konvolutt gener for hver omprogrammering faktor. Deretter, for hver omprogrammeringsfaktor, legg til 300 mikroliter romtemperatur DMEM i et sterilt polystyrenrør. Tilsett deretter forsiktig 27 mikroliter romtemperatur kommersiell transfection reagens direkte inn i mediet for å unngå kontakt med rørveggen.Tilsett plasmidblandingen i transfection reagensen som inneholder rør. Vortex kort og inkuber blandingen i 15 minutter ved romtemperatur. Vortex transfection reagens DNA-blandingen igjen.Legg det dropwise til retrovirale emballasjeceller slik at den er jevnt spredt over kulturen og inkubere ved 37 grader Celsius. 24 timer etter transfection, fjerne mediet og legge DMEM med 20% FBS og 100 enheter per milliliter penicillin streptomycin. 48 timer etter transfeksjon, samle supernatant og filtrere den gjennom en 0,22 mikrometer pore størrelse sprøyte filter.Begynn transduksjonen ved å så halespissen fibroblaster på 10.000 celler per kvadratcentimeter på 0,1% gelatin forhåndsbelagte retter i FEX medium. Inkuber ved 37 grader Celsius i 24 timer. Når du utfører dette trinnet, er det viktig å legge til de fire retrovirale supernativa i samme forhold for å sikre at alle fire transgener bidrar likt til omprogrammeringsprosessen.På neste dag, forberede en transduksjon blanding ved først å legge til ett volum av viral supernatant for hver omprogrammering faktor supplert med fire mikrogram per milliliter retroviral infeksjon reagens til seks volumer av FEX medium. Deretter aspirerer FEX-mediet fra fibroblastkulturen og tilsett transduksjonsblandingen. Inkuber transduksjonsreaksjonen i fire timer ved 37 grader Celsius i hypoksiske forhold ved 5% karbondioksid og 4% oksygen.Etter fire timer, aspirer transduksjonsblandingen og tilsett fersk omprogrammeringsmedium. Inkuber ved 37 grader Celsius i hypoksiske forhold i åtte dager, og tilsetter nytt omprogrammeringsmedium annenhver dag. Observer vellykket omprogrammering med gitt klynger av celler løsrevet fra platen.For å høste omprogrammerte celler fra parabolen for videre analyse, pipett dem forsiktig opp og ned og samle deretter cellene. Etter vellykket omprogrammering av iEPer, er YFP-positive celler observerbare så tidlig som fem dager etter transduksjon. De blir runde, løfter fra overflaten av platen, begynner å danne klynger, og viser en erythroid forløper-lignende morfologi.Hemoglobinisering av noen celler er tydelig ved positiv benzidinfarging. En liten brøkdel uttrykker den erythroid-spesifikke overflatemarkøren TER-119. På dag åtte kan store YFP-positive klynger ses.Dag åtte iEPs har en mer differensiert erythroid fenotype enn dag fem iEPer. De er betydelig mindre, har akkumulert mer hemoglobin, og viser økt uttrykk for TER-119. Genuttrykksanalyse av qPCR av iEPer samlet på dag åtte viser at de nesten har stengt ned uttrykk for fibroblastgener og har oppregulert mange erythroide gener.Etter å ha utført BFU-e kolonidannende analyser på de omprogrammerte cellene, danner dag åtte iEPer to typer kolonier, tydelig rød og ikke synlig rød. Mens celler fra røde kolonier viste erytroblast morfologi, celler fra ikke-røde kolonier gjorde det ikke. Omtrent en av 1000 dag fem iEPer dannet røde kolonier mens bare omtrent en av 10,000 kolonier dannet fra dag åtte iEPer.Omprogrammering effektivitet av hale-tips fibroblaster eller TTFs påvirkes av passasjen nummer. TTFs som hadde blitt passasjer ni ganger viste en dramatisk reduksjon i evnen til å produsere klynger av iEPer sammenlignet med cellene som hadde blitt passasjer tre ganger. Videre kan ulike kulturforhold påvirke effektiviteten av omprogrammering.Transduserte TTFer kultivert i normoksi er mye tregere å omprogrammere og IEP klynger observeres etter 10 dager i stedet for fem til åtte dager. Etter denne prosedyren kan metoder som kolonidannende analyser, qPCR- og FACS-analyse brukes for å bestemme celledilateringsstatusen. Siden utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen erythropoiesis i å forstå overgangen mellom primitive og definitive erythroidceller i mus og menneske.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabil og effektiv genmodifisering av Celler i Adult Mouse V-SVZ for Analyse av Neural Stem Cell autonome og ikke-autonome Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Muse Dermal Fibroblast Isolering av FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Generering Primær fibroblastkulturer fra Muse øre og hale Vev

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse av Protein Expression å studere Lineage Spesifikasjon i Mouse Før implantasjon Embryoer

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Omprogrammering mus embryonale Fibroblaster med transkripsjonsfaktorer for å indusere en Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Vurdere kardiomyocytt Subtyper Etter transkripsjonsfaktor-mediert omprogrammering av mus embryonale Fibroblaster

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generasjon av stillaset-fri, tredimensjonale Insulin uttrykke Pancreatoids fra musen bukspyttkjertelen Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Undertrykkelse av Pro-fibrotiske signalering Potentiates faktor-mediert omprogrammering av mus embryonale fibroblaster til indusert Cardiomyocytes

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

En direkte og enkel metode for å vurdere Drosophila melanogaster' s levedyktighet fra embryo til Adult

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Vaskulær støping av voksne og tidlige postnatale muslunger for micro-CT-bildebehandling

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...