Name: direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

Мы благодарим Эвелин Ван и Грегори Хайд (Институт Уайтхед, Кембридж, Массачусетс) для клонирования и Харви Lodish (Уайтхед институт) за предоставление многих плазмид, используется для генерации ретровирусной библиотеки. Мы благодарим Кавитха Шивы и Sofie Singbrant (Кафедра молекулярной медицины и генной терапии, Лундский университет), Гёран Карлссон и Shamit Soneji (Отдел молекулярной гематологии, Лундский университет) за их роль в описании iEP производства. Мы также хотели бы выразить признательность и поблагодарить Julian Пулесьо (Центр восстановительной медицины, Барселона биомедицинская научно-исследовательский парк), Виолета района-Эстрада (Рокфеллеровский университет, Нью-Йорк), Карл Walkley (Сент-Винсент институт медицинских исследований и Кафедра медицины, Сент-Винсент больницы, Университет Мельбурна), Анхель рая (каталонский Институт передовых исследований, Барселона) и Vijay G. Sankaran (широкой институт Массачусетского института технологии и Гарвардского университета, Кембридж ) для их предыдущий вклад в эту работу. Эта работа была поддержана Рагнар Söderberg фонда (J.F.); Шведские исследования Совета (к J.F.); Стифтельсен Олле Engkvist Byggmästare (к J.F.); Шведский фонд стратегических исследований (к J.F.); Åke Wiberg фонд (к J.F.); Мари Кюри интеграции Грант (J.F.).

1. Создание и поддержание хвост мыши Совет культуры фибробластов
<ol><li>Готовить блюда желатин покрытием (рекомендуем 10 см блюдо для одного хвоста), покрывая поверхность с 0,1% желатина и инкубации блюда для примерно 20 минут при 37 ° C. Аспирационная раствор желатина из блюдо и дайте ему высо?...

<ol>
	<li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+We+Really+Vastly+Outnumbered?+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans.">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li><li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+multilineage+blood+progenitors.">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li><li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li><li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors.">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li><li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors.">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li><li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversions:+unnatural+but+useful.">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li><li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox.">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li><li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion.">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li><li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+reprogramming:+a+two-way+street.">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li><li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+couples+erythropoiesis,+B-lymphopoiesis,+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment.">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li><li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage.">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways.">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).</li><li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors.">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li><li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells.">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).</li></ol>

Сверхэкспрессия коктейль четырех фактор, GATA1, TAL1, LMO2 и c-MYC (GTLM), достаточно для того перепрограммировать мышиных и человека фибробластов непосредственно к ПРП10. Перепрограммировать эритроидных клеток сильно напомина?...

Красные кровяные клетки (эритроциты) важны для всех позвоночных и составляют 84% от всех клеток тела человека1. Из эмбриональных к взрослой жизни наше здоровье сильно зависит от точной регуляции гомеостаза РБК. Текущего производства зрелых эритроцитов на протяжении развития в зрелом возрасте известен как эритропоэза. Серьезной проблемой в эритропоэза исследования заключается в определении главных регуляторов, которые оркестровать РБК развития и переключение между примитивными и окончательного эритропоэза. Прямой линии перепрограммирование эритроидные предшественники представляет возможность для более глубокого понимания эритроидные развития в естественных условиях.
Прямой линии перепрограммирования (DLR), также известный как transdifferentiation, является процесс перепрограммирования один тип ячейки непосредственно в другой, минуя плюрипотентных и Multipotent с прародителем этапов. DLR до настоящего времени был использован для создания многочисленных типов клеток, включая нейронные2, гемопоэтических3,4,5, печеночная6 и нефротическим7, клетки-предшественники. Для развития биологов DLR стал важным инструментом для допрос аспекты приверженность линии и терминала дифференциация процессы8,9. DLR может дополнять и частично заменить в vivo исследований для понимания механизмов судьбы клетки, определяющих факторов во время разработки. DLR протокол для перепрограммирования эритроидные предшественники, описанных в данном документе предоставляет поле бесплатный метод для развития исследований эритропоэза.
Ранее мы показали, что гиперэкспрессия коктейль четырех фактор, GATA1, TAL1, LMO2 и c-MYC (GTLM), достаточно для того перепрограммировать мышиных и человека фибробластов непосредственно к индуцированных эритроидные предшественники (ПРП) 10. GTLM-перепрограммирование эритроидных клеток сильно напоминают bona fide примитивных эритроидные предшественники плане морфологии, фенотип и ген выражение10. Таким образом ПРП имеют ограниченный потенциал распространения и зрелые ядерных эритроцитов аналогичны временно производится в начале эмбриона до начала окончательного эритропоэза. Внеся изменения в перепрограммирования условиях (например, точечные мутации в перепрограммировании факторов или добавление других факторов), можно понять как это приводит к изменениям в развитии эритроидные и дифференциации. Мы например показали, что добавление Klf1 или Myb на GTLM коктейль изменяет Глобин выражения от преимущественно эмбриональных (примитив) в основном взрослых (окончательный). Этот вывод подтверждают обоснованность использования DLR в качестве инструмента для определения развития факторов в эритропоэза.
Здесь мы приводим процесс генерации ПРП от мыши хвостовой оконечности фибробластов (TTF). В результаты нашего представителя, мы провели перепрограммирования на фибробласты от мышей линии трассировки эритроидные (Epor- Cre R26- eYFP) который Экспресс желтый флуоресцентный белок (eYFP) от Rosa26 Локус во всех клетках, выразили рецепторов эритропоэтина, позволяя легко визуализации приверженность линии эритроидные. С помощью этого метода, рекламы ЯФП позитивные (EpoR +) клетки присутствуют пять дней после передачи в кратчайшие сроки. Этот протокол, таким образом, предлагает быстрый и надежный метод для генерации эритроидные предшественники в пробирке.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1141px;" width="1142">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM without sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:505px;">Culturing media for PhGP cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM with sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30243.01</td>
			<td>Culturing media for tail tip fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)</td>
			<td style="width:167px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:123px;">9650</td>
			<td>Reprogramming media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum HyClone</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30071.03HI</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td>Antiboiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Non-Essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">11140050</td>
			<td>SNL media is suppplemented with this</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Trypsin HyClone (1x)</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30042.01</td>
			<td>Cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Murine Stem Cell Factor (mSCF)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">250-03</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Recombinant Murine Il-3</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">213-13</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">human recombinant erythropoietin (hrEPO)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-64</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">50-02-2&#160;&#160;</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">9000-70-8&#160;</td>
			<td>Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Blasticidin S hydrochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">3/9/3513</td>
			<td>Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30850.03</td>
			<td>Used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>Infection / Transfection&#160; Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:167px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td>Transfection Reagent for PhGP cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">BD Emerald Hypodermic Syringe</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">SKU: 307736</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm Culture Dish</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">10799541</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Jeweler Forceps #5</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">66-7642</td>
			<td>Used for handling small tail fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Sklarlite Iris Scissors</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">23-1149</td>
			<td>Used for cutting the tail into small pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:123px;">130-090-858</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">CD117 MicroBeads, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PheonixGP cells</td>
			<td style="width:167px;">ATCC</td>
			<td>CRL-3215</td>
			<td>retroviral packaging cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">EcoPAC vector (pCL-Eco)&#160;</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-29540</td>
			<td>retroviral helper vector containing gag and pol genes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Gata1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Tal1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Lmo2</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-cMyc</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellSens Standard 1.6 software&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Cytospin analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors

Эритроидных клеток приверженность и дифференциации перейти через активацию линии ограничена транскрипционный анализ сети, организованные группы клеток судьбы, определение и созревания факторов. Ранее мы намерены определить минимальный набор факторов, необходимых для инструктажа развития красных кровяных клеток, используя прямой линии перепрограммирования фибробластов в индуцированной эритроидные предшественники/прекурсоров (ПРП). Мы показали что Сверхэкспрессия Gata1, Tal1, Lmo2и c-Myc (GTLM) можно быстро преобразовать мышиных и человека фибробластов непосредственно к ПРП, которые напоминают bona fide эритроидные клетки с точки зрения морфологии, фенотип, и экспрессии генов. Мы планируем, что ПРП будет предоставлять бесценным инструментом для изучения эритропоэза и клетка судьба регулирования. Здесь мы описываем процесс поэтапного преобразования мышиных хвостовой оконечности фибробластов в ПРП через транскрипционным фактором driven прямой линии перепрограммирования (DLR). В этом примере мы выполняем перепрограммирования в фибробласты от мышей линии трассировки эритроидные, которые выражают желтый флуоресцентный белок (рекламы ЯФП) под контролем промотора гена (EpoR) рецепторов эритропоэтина, позволяя визуализации эритроидные клетки Судьба индукции после перепрограммирования. После этого протокола фибробласты могут быть перепрограммированы в ПРП в течение пяти до восьми дней.
В то время как еще можно улучшить процесс, мы показывают, что GTLM-опосредованной перепрограммирования быстрый и прямой процесс, уступая клетки с свойствами bona fide эритроидные клетки предшественники и прекурсоров.

Здесь мы представляем воспроизводимый протокол для производства ПРП от взрослых фибробластов, с помощью транскрипции фактор driven DLR. Мы оцениваем перепрограммирования клетки, с помощью проточной цитометрии, образуя колонии анализов и гена анализ выражения. Чтобы помо...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Прямые, Lineage перепрограммирование взрослых мыши фибробластов в эритроидные предшественники

Здесь мы представляем наши протокол для производства индуцированной эритроидные предшественники (ПРП) от взрослых фибробласты мыши с помощью транскрипции управляемый фактор прямой линии перепрограммирования (DLR).

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Прямая перепрограммирование линии от фибробластов до эритроидных клеток-предшественников. Это новый метод, который мы разработали в нашей лаборатории, чтобы лучше изучить процессы транскрипционные регуляции, определяющие судьбу эритроидных клеток. Основным преимуществом использования перепрограммирования прямой линии для изучения разработки является то, что это очень простая техника.Так что по сравнению, например, с потерей функциональных исследований в нокаут мышей, здесь мы можем очень легко манипулировать фактором, чрезмерно выразить его в определенный момент времени, а затем легко получить достаточно материала для изучения вниз по течению эффекты, такие как хроматин изменения или изменения экспрессии генов. Хотя этот метод фокусируется на перепрограммирование мыши хвост кончик фибробластов эритроидных прародителей, он также может быть применен к другим типам фибробластов клеток, а также к другим организмам, включая людей. Последствия этого метода распространяются на переливание медицины в том, что он прокладывает путь к производству красных кровяных телец в пробирке.Демонстрацией процедуры будет Альбан Иоханссон из моей исследовательской группы. Начните с покрытия поверхности блюд с 0,1% желатина. Инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в течение примерно 20 минут.Аспирировать раствор желатина и дать посуде высохнуть. Используйте ножницы, чтобы вырезать в основании хвоста усыпанной мыши, чтобы удалить его. Поместите хвост в DPBS с 2%FBS до готовности к использованию.В тканевой культуре капюшон в стерильных условиях, подготовить разбавленный трипсин раствор 0,02%трипсина EDTA в DPBS и добавить 5 миллилитров в неокрашенные 10-сантиметровое блюдо. В капюшоне культуры ткани, мыть хвост в достаточно 70% этанола в 15-миллилитровой трубке, чтобы покрыть его, а затем в DPBS. Поместите хвост плоским в блюдо и использовать типсы, чтобы держать его на месте.Используйте скальпель, чтобы сделать разрез на хвосте вдоль его продольной оси от основания до кончика. Используйте пару типсов, чтобы схватить хвост и держать его вертикально и использовать вторую пару, чтобы схватить кожу рядом с разрезом у основания хвоста и очистить его обратно. Выполните это по обе стороны от разреза, пока кожа может быть очищена, потянув вниз к кончику хвоста.Держите очищенный хвост типсами над блюдом, содержащим трипсиный раствор. Используйте ножницы для вскрытия, чтобы разрезать хвост на мелкие кусочки. Используйте ножницы, чтобы фрагментировать эти части в растворе трипсина на еще более мелкие кусочки, а затем инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут.Чтобы утолить трипсин, добавьте два тома FEX среды, DMEM с добавками и антибиотиками. Соберите все содержимое блюда в 50-миллилитровую трубку. Центрифуга трубки при 350 раз G в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию.Аспирировать супернатант и повторно израсходовать гранулы, содержащие фрагменты хвоста в 10 миллилитров свежей среды FEX. Перенесите эту суспензию в блюдо с желатиновым покрытием. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа и 4%кислорода, добавляя свежие FEX среды каждые два дня.Наблюдайте за культурой через пять-семь дней, в течение которых фрагменты хвоста прикрепляются в нижней части блюда, и фибробласты отходят от них. Как только скопления фибробластов видны, осторожно встряхните блюдо, чтобы выбить части хвоста. Аспирировать среду со всеми фрагментами костей, оставляя фибробласты прилагается к пластине.Добавьте 10 миллилитров свежей среды FEX и культуры фибробластов до слияния. Чтобы убедиться, что в фибробластовой культуре нет загрязнения гематопоэтическими прародителями, отмежевать клетки от пластины с помощью трипсина ЭДТА, как описано в рукописи. Добавить средний и собирать клетки, и добавить магнитные бусины с антителами.Используйте магнитную систему разделения для удаления клеток, выражаюющих гематопоэтические маркеры. В том числе этот шаг является абсолютно жизненно важным, поскольку он устраняет любые ГФУ, которые могут присутствовать в культуре и, следовательно, вероятность каких-либо ложных срабатываний в день анализа FACS. Семена ретровирусных упаковочных клеток примерно на 25 000 клеток на квадратный сантиметр на ткани культуры лечение блюдо.Инкубировать клетки в высоко глюкозы DMEM при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в одночасье. На следующее утро, удалить средний и добавить половину объема, используемого для культуры ночь DMEM без добавок. Во второй половине дня проверьте клетки на 70-80% слияние, необходимое для трансфекции.Начните трансфекцию, подготовив два к одному смеси из шести микрограммов вектора экспрессии PMX и трех микрограммов вектора помощников, содержащего gag, Pol и генов конвертов для каждого фактора перепрограммирования. Далее, для каждого фактора перепрограммирования, добавьте 300 микролитров комнатно-температурного DMEM в стерильную полистироловую трубку. Затем аккуратно добавьте 27 микролитров комнатно-температурного коммерческого трансфектного реагента непосредственно в среду, чтобы избежать контакта со стеной трубки.Добавьте смесь плазмиды в трансфектический реагент, содержащий трубку. Vortex кратко и инкубировать смесь в течение 15 минут при комнатной температуре. Vortex трансфекции реагент ДНК смеси снова.Добавьте его dropwise к ретровирусным упаковывая клеткам так, что оно равномерно распределено над культурой и инкубировать на 37 градусах Celsius. Через 24 часа после трансфекции, удалить средний и добавить DMEM с 20%FBS и 100 единиц на миллилитр пенициллина стрептомицин. Через 48 часов после трансфекции соберите супернатант и процберите его через фильтр шприца размером 0,22 микрометра.Начните трансдукцию путем посева фибробластов кончика хвоста на уровне 10 000 клеток на квадратный сантиметр на 0,1% желатиновых предварительно покрытых блюд в среде FEX. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 24 часов. При выполнении этого шага важно добавить четыре ретровирусных супернатанта в равном соотношении, чтобы все четыре трансгена в равной степени способствовали процессу перепрограммирования.На следующий день приготовьте трансдукционную смесь, сначала добавив один том вирусного супернатанта для каждого фактора перепрограммирования, дополненного четырьмя микрограммами на миллилитр ретровирусного инфекционного реагента до шести томов среды FEX. После этого, аспирировать FEX среды из фибробластовой культуры и добавить смесь трансдукции. Инкубировать трансдукционную реакцию в течение четырех часов при 37 градусах Цельсия в гипоксических условиях при 5%углекислом газе и 4%кислороде.Через четыре часа, аспирировать трансдукционную смесь и добавить свежие перепрограммирования среды. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в гипоксических условиях в течение восьми дней, добавляя свежие перепрограммирования среды каждые два дня. Наблюдайте успешное перепрограммирование с помощью уступаемых скоплений клеток, отделенных от пластины.Чтобы собрать перепрограммированные клетки из блюда для дальнейшего анализа, аккуратно пипетки их вверх и вниз, а затем собирать клетки. После успешной перепрограммирования IEPs, YFP-положительные клетки наблюдаются уже через пять дней после трансдукции. Они становятся круглыми, поднимаются с поверхности пластины, начинают формировать кластеры и отображают эритроидную прекурсорную морфологию.Гемоглобинизация некоторых клеток проявляется положительным окрашивание бензидина. Небольшая фракция выражает эритроид-специфический поверхностный маркер TER-119. К восьмому дню можно увидеть большие кластеры YFP-положительных.День восемь iEPs имеют более дифференцированный фенотип эритроида, чем день пять IEPs. Они значительно меньше, накопили больше гемоглобина и показывают повышенное выражение ТЕР-119. Анализ экспрессии генов, проведенный qPCR IEPs, собранный на восьмой день, показывает, что они почти закрыли экспрессию генов фибробластов и регулируют многие эритроидные гены.После выполнения BFU-e колонии формирования анализов на перепрограммированных клеток, день восемь iEPs образуют два типа колоний, отчетливо красный и не заметно красный. В то время как клетки из красных колоний отображаются эритробластной морфологии, клетки из некрасных колоний этого не сделали. Приблизительно один из 1000 день пять iEPs образуются красные колонии в то время как только примерно один из 10000 колоний, образованных с восьмого дня iEPs.На эффективность перепрограммирования фибробластов хвостового кончика или ТТФ влияет номер прохода. TTFs, которые были прохождение девять раз показали резкое снижение способности производить кластеры IEPs по сравнению с клетками, которые были пролетев в три раза. Кроме того, различные культурные условия могут повлиять на эффективность перепрограммирования.Транспродюцированные ТТФ, культурные в нормоксиях, гораздо медленнее перепрограммируются, и кластеры IEP наблюдаются через 10 дней вместо пяти-восьми дней. После этой процедуры для определения статуса дифференциации клеток могут применяться такие методы, как анализ колоний, qPCR и FACS. С момента своего развития, этот метод прокладывает путь для исследователей в области erythropoiesis в понимании переключателя между примитивными и окончательными эритроидных клеток в мыши и человека.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Стабильной и эффективной генетической модификации клеток у мышей взрослых V-СВЗ для анализа нейронных стволовых клеток автономный и Неавтономные эффекты

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Мышиные Кожные фибробластов Изоляция FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Создание первичного фибробластов Культуры с уха мыши и хвост тканей

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Количественный анализ экспрессии белка по изучению Lineage Спецификация в клетках мышиной предимплантационной эмбрионов

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Перепрограммирование эмбриональных фибробластов мыши с транскрипционных факторов для индуцирования кроветворения программы

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Оценка кардиомиоцитов подтипов После Транскрипция фактор опосредованного перепрограммирования эмбриональных фибробластов мыши

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Поколение эшафот бесплатно, трехмерные инсулина выражая Pancreatoids от мыши поджелудочной железы прародителями в пробирке

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Подавление Pro фиброзный сигнализации потенцирует фактор опосредованной перепрограммирования мыши эмбриональных фибробластов в индуцированной кардиомиоцитов

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Прямой и простой метод для оценки Drosophila меланогастер'S жизнеспособность от эмбриона к взрослому

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Сосудистый литье взрослых и ранних постнатальных легких мыши для micro-CT изображений

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...