Name: direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

Vi tackar Evelyn Wang och Gregory Hyde (Whitehead Institute, Cambridge, MA) för kloning och Harvey Lodish (Whitehead Institute) för att ge många av plasmidsna används för att generera retrovirala biblioteket. Vi tackar Lillemor Siva och Sofie Singbrant (Institutionen för molekylärmedicin och Gene Therapy, Lunds universitet), Göran Karlsson och Shamit Soneji (Institutionen för molekylär hematologi, Lunds universitet) för sina roller i Beskrivning av iEP produktion. Vi vill också erkänna och tacka Julian Pulecio (centrum för regenerativ medicin, Barcelona Biomedical Research Park), Violeta Rayon-Estrada (The Rockefeller University, New York), Carl Walkley (St. Vincent's Institutet för medicinsk forskning och Institutionen för medicin, St Vincent's Hospital, University of Melbourne), Ángel Raya (katalanska institutionen för forskning och avancerade studier, Barcelona) och Vijay G. Sankaran (Broad Institute i Massachusetts Institute of Technology och Harvard, Cambridge ) för deras tidigare bidrag till detta arbete. Detta arbete stöds av Ragnar Söderbergs stiftelse (till J.F.); Vetenskapsrådet (till J.F.); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (till J.F.); Stiftelsen för strategisk forskning (till J.F.); Åke Wibergs stiftelse (till J.F.); Marie Curie integration bidrag (till J.F.).

1. inrättande och underhåll av primära mus svans tips Fibroblast kulturer
<ol><li>Förbereda gelatin-belagd rätter (rekommenderar en 10 cm parabolantenn för en svans) genom att täcka ytan med 0,1% gelatin och ruvning rätter för ca 20 min vid 37 ° C. Aspirera gelatin lösningen från skålen och låt den torka i minst 2 h.</li>
	<li>Euthanize möss av cervikal dislokation. Ta bort svansen med sax, skär vid basen av svansen. Sätta svansen i Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) med 2% fetalt bovint serum...

<ol>
	<li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+We+Really+Vastly+Outnumbered?+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans.">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li><li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+multilineage+blood+progenitors.">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li><li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li><li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors.">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li><li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors.">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li><li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversions:+unnatural+but+useful.">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li><li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox.">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li><li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion.">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li><li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+reprogramming:+a+two-way+street.">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li><li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+couples+erythropoiesis,+B-lymphopoiesis,+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment.">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li><li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage.">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways.">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).</li><li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors.">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li><li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells.">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).</li></ol>

Överuttryck av en fyra-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, och c-MYC (GTLM), räcker att omprogrammera murina och mänskliga fibroblaster direkt till iEPs10. Omprogrammerade erytroid cellerna liknade kraftigt bona fide erytroid föräldraparets vad gäller morfologi, fenotyp, genuttryck och kolonibildande förmåga. Detta konstaterande bekräftar den logiska grunden för att använda ...

Röda blodkroppar (RBC) är viktiga i alla ryggradsdjur och 84% av alla celler av mänskliga kroppar1. Från embryonala till vuxna liv är vår hälsa starkt beroende av exakt reglering av RBC homeostas. Pågående produktion av mogna röda blodkroppar under utveckling i vuxenlivet kallas erytropoes. En stor utmaning i erytropoesen forskning är att definiera ledar tillsynsmyndigheterna som dirigera RBC utveckling och växla mellan primitiva och slutgiltiga erytropoes. Direkt härstamning omprogrammering av erytroid föräldraparets utgör en möjlighet att ytterligare förstå erytroid utveckling i vivo.
Direkt härstamning omprogrammering (DLR), även känd som transdifferentiation, är processen att omprogrammera en celltyp direkt in i another, förbi pluripotenta och multipotenta stamceller stadier. DLR har hittills använts för att producera många celltyper inklusive neurala2, hematopoetiska3,4,5, nedsatt6 och nefrotiskt7, stamceller. För utvecklingstoxicitet biologer, har DLR blivit ett viktigt verktyg för förhör aspekter av härstamning engagemang och terminal differentiering processer8,9. DLR kan komplettera och delvis ersätta i vivo studier för förståelse mekanismer i cellen öde avgörande faktorer under utveckling. DLR protokollet för omprogrammering till erytroid stamfäder som beskrivs i detta dokument ger fältet en gratis metod för utvecklande studier av erytropoes.
Vi har tidigare visat att överuttryck av en fyra-faktor cocktail, GATA1, TAL1, LMO2, och c-MYC (GTLM), räcker att programmera både murina och mänskliga fibroblaster direkt till inducerad erytroid stamfäder (individuella) 10. the GTLM-omprogrammeras erytroid celler kraftigt likna bona fide primitiva erytroid föräldraparets vad gäller morfologi, fenotyp och gene expression10. Således iEPs har begränsad spridning kapacitet och mogna till kärnförsedda erytrocyter liknar de övergående produceras i det tidiga embryot innan uppkomsten av slutgiltiga erytropoes. Genom att göra ändringar i omplanering förhållanden (t.ex. punktmutationer i omprogrammering faktorer eller tillägg av andra faktorer), kan man förstå hur detta leder till förändringar i erytroid utveckling och differentiering. Vi har till exempel visat att tillägg av Klf1 eller Myb till GTLM cocktail ändras mönstret globin uttryck från huvudsakligen embryonala (primitiva) främst vuxna (slutgiltiga). Detta konstaterande bekräftar giltigheten av använda DLR som ett verktyg för att definiera utvecklingsmässiga faktorer i erytropoesen.
Här beskriver vi processen att skapa iEPs från mus tail tip fibroblaster (TTF). I våra representativa resultat, vi utfört omprogrammering på fibroblaster från erytroid härstamning-tracing möss (Epor- Cre R26- eYFP) som uttryckligt det gula fluorescerande proteinet (eYFP) från det Rosa26 locus i alla celler som har uttryckt erytropoietin receptorn, möjliggör enkel visualisering av åtagande att erytroid härstamning. Med den här metoden är positiv YFP (EpoR +) celler närvarande så tidigt som fem dagar efter transduktion. Detta protokoll, därför erbjuder en snabb och robust teknik för generering av erytroid stamfäder i vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1141px;" width="1142">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM without sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:505px;">Culturing media for PhGP cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM with sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30243.01</td>
			<td>Culturing media for tail tip fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)</td>
			<td style="width:167px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:123px;">9650</td>
			<td>Reprogramming media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum HyClone</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30071.03HI</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td>Antiboiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Non-Essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">11140050</td>
			<td>SNL media is suppplemented with this</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Trypsin HyClone (1x)</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30042.01</td>
			<td>Cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Murine Stem Cell Factor (mSCF)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">250-03</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Recombinant Murine Il-3</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">213-13</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">human recombinant erythropoietin (hrEPO)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-64</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">50-02-2&#160;&#160;</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">9000-70-8&#160;</td>
			<td>Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Blasticidin S hydrochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">3/9/3513</td>
			<td>Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30850.03</td>
			<td>Used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>Infection / Transfection&#160; Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:167px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td>Transfection Reagent for PhGP cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">BD Emerald Hypodermic Syringe</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">SKU: 307736</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm Culture Dish</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">10799541</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Jeweler Forceps #5</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">66-7642</td>
			<td>Used for handling small tail fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Sklarlite Iris Scissors</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">23-1149</td>
			<td>Used for cutting the tail into small pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:123px;">130-090-858</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">CD117 MicroBeads, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PheonixGP cells</td>
			<td style="width:167px;">ATCC</td>
			<td>CRL-3215</td>
			<td>retroviral packaging cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">EcoPAC vector (pCL-Eco)&#160;</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-29540</td>
			<td>retroviral helper vector containing gag and pol genes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Gata1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Tal1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Lmo2</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-cMyc</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellSens Standard 1.6 software&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Cytospin analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors

Erytroid cell engagemang och differentiering vidare genom aktivering av ett härstamning-begränsad transkriptionell nätverk iscensatt av en grupp av cell ödet avgöra och mognar faktorer. Vi tidigare anges för att definiera en minimal uppsättning faktorer som behövs för att instruera röda blodkroppar utveckling med hjälp av direkt härstamning omprogrammering av fibroblaster till inducerad erytroid föräldraparets/prekursorer (iEPs). Vi visade att överuttryck av Gata1, Tal1, Lmo2och c-Myc (GTLM) kan snabbt konvertera murina och mänskliga fibroblaster direkt till iEPs som liknar bona fide erytroid celler i form av morfologi, fenotyp, och genuttryck. Vi har för avsikt att iEPs kommer att ge ett ovärderligt verktyg för att studera erytropoesen och cell öde förordning. Här beskriver vi de stegvis processen att omvandla murina tail tip fibroblaster till iEPs via transkription faktorn-driven direkt härstamning omprogrammering (DLR). I det här exemplet utför vi omprogrammering i fibroblaster från erytroid härstamning-tracing möss som uttrycker det gula fluorescerande proteinet (YFP) under kontroll av erytropoietin receptorn gen (EpoR) arrangören, för visualisering av erytroid cell öde induktion vid omprogrammering. Efter detta protokoll, fibroblaster kan omprogrammeras till iEPs inom fem till åtta dagar.
Medan processen kan fortfarande förbättras, visar vi att GTLM-medierad omprogrammering är en snabb och direkt process, ger celler med egenskaperna för bona fide erytroid stamceller och föregångare celler.

Här presenterar vi ett reproducerbart protokoll för produktion av iEPs från vuxna fibroblaster med transkription faktorn-driven DLR. Vi utvärderar cell omprogrammering med flödescytometri, kolonibildande analyser och gen uttryck analys. För att bistå i visualisering av omvandlingen till erytroid cell öde, vi utfört omprogrammering på fibroblaster från erytroid härstamning-tracing möss (Epor- Cre R26- eYFP) som uttryckligt det gula fluorescerande proteinet (e...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Direkt härstamning omprogrammering av vuxen mus Fibroblast till erytroid stamfäder

Här presenterar vi våra protokoll för producera inducerad erytroid stamfäder (iEPs) från mus vuxen fibroblaster med transkription faktorn-driven direkt härstamning omprogrammering (DLR).

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Direkt härstamning omprogrammering från fibroblaster till erythroid stamceller. Det är en ny metod som vi har utvecklat i vårt labb för att bättre studera processerna för transkriptional reglering fastställa erytroida cell öde. Den största fördelen med att använda direkt härstamning omprogrammering för att studera utvecklingen är att det är en mycket enkel teknik.Så jämfört med till exempel förlust av funktionsstudier inom knockoutmöss, kan vi här mycket enkelt manipulera faktorn, över-uttrycka den vid viss tidpunkt, och sedan enkelt få tillräckligt med material för att studera nedströms effekter som kromatinmodifieringar eller genuttrycksförändringar. Medan denna metod fokuserar på omprogrammering av mus svans-tip fibroblaster till erythroid progenitors, Det kan också tillämpas på andra fibroblast celltyper, och till andra organismer inklusive människor. Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot transfusion medicin i att det banar väg mot produktion av röda blodkroppar in vitro.Demonstrerar proceduren blir Alban Johansson från min forskargrupp. Börja med att täcka ytan av disken med 0,1%gelatin. Inkubera dem i 37 grader Celsius i cirka 20 minuter.Aspirera gelatinlösningen och låt disken torka. Använd sax för att skära vid basen av svansen på en avlivad mus för att ta bort den. Placera svansen i DPBS med 2%FBS tills den är klar att användas.I en vävnadskultur huva under sterila förhållanden, förbereda en utspädd trypsin lösning av 0,02%trypsin EDTA i DPBS och tillsätt 5 milliliter i en obestruken 10-centimeters maträtt. I en vävnadskultur huva, tvätta svansen i tillräckligt 70%etanol i en 15-milliliter tub för att täcka den och sedan i DPBS. Placera svansen platt i en maträtt och använda tlyck för att hålla den på plats.Använd en skalpell för att göra ett snitt på svansen längs dess längsgående axel från basen till spetsen. Använd ett par tlyck för att greppa svansen och hålla den vertikalt och använda ett andra par för att greppa huden bredvid snittet vid basen av svansen och skala tillbaka den. Utför detta på båda sidor av snittet tills huden kan skalas av genom att dra nedåt mot spetsen av svansen.Håll den skalade svansen med tlyck över skålen som innehåller trypsinlösningen. Använd dissekering sax för att skära svansen i små bitar. Använd sax för att fragmentera dessa bitar i trypsinlösningen i ännu mindre bitar och sedan inkubera i 37 grader Celsius i 10 minuter.För att släcka trypsin, tillsätt två volymer av FEX medium, DMEM med kosttillskott och antibiotika. Samla hela innehållet i skålen i en 50-milliliter rör. Centrifugera röret vid 350 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius.Aspirera supernatanten och resuspend pelleten som innehåller svansfragmenten i 10 milliliter färskt FEX-medium. Överför denna suspension till en gelatinbelagd skål. Inkubera vid 37 grader Celsius i 5%-syre och 4%syre, tillsätt färskt FEX-medium varannan dag.Observera kulturen efter fem till sju dagar, där svansfragmenten har fäst på botten av skålen, och fibroblaster rör sig bort från dem. När kluster av fibroblaster är synliga, skaka försiktigt skålen för att rubba svansbitar. Aspirera mediet med alla benfragment, lämnar fibroblaster fäst vid plattan.Tillsätt 10 milliliter färskt FEX medium och odla fibroblaster tills de konfluenta. För att säkerställa att det inte sker någon kontaminering av hematopoetiska progenitorer i fibroblastkulturen, dissociate cellerna från plattan med hjälp av trypsin EDTA som beskrivs i manuskriptet. Lägg medium och samla in cellerna, och tillsätt magnetiska pärlor med antikroppar.Använd ett magnetiskt separationssystem för att ta bort celler som uttrycker hematopoetiska markörer. Att inkludera detta steg är absolut nödvändigt eftersom det eliminerar alla HSPCs som kan finnas i kulturen och därmed sannolikheten för falska positiva på dagen för FACS-analysen. Frö retrovirala förpackningsceller vid cirka 25, 000 celler per kvadratcentimeter på en vävnadsodlingsbehandlad maträtt.Inkubera cellerna i högglukos-DMEM vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid över natten. På följande morgon, ta bort mediet och tillsätt hälften av den volym som används för att odla över natten av DMEM utan tillsatser. På eftermiddagen, kontrollera cellerna för 70 till 80%konfluency som krävs för transfection.Börja transfektionen genom att förbereda en två till en blandning av sex mikrogram av uttrycket vektorn PMX och tre mikrogram av hjälprektorn som innehåller Gag, Pol och kuvertgener för varje omprogrammeringsfaktor. Nästa, för varje omprogrammering faktor, tillsätt 300 mikroliter av rumstemperatur DMEM i en steril polystyren röret. Tillsätt sedan försiktigt 27 mikroliter av kommersiella transfektionsreagens i rumstemperatur direkt i mediet för att undvika kontakt med rörväggen.Tillsätt plasmidblandningen i transfektionsreagensen som innehåller röret. Vortex kort och inkubera blandningen i 15 minuter vid rumstemperatur. Vortexa transfektionsreas-DNA-blandningen igen.Lägg den dropwise till retrovirala förpackningsceller så att det är jämnt fördelade över kulturen och inkubera vid 37 grader Celsius. 24 timmar efter transfektion, ta bort mediet och tillsätt DMEM med 20%FBS och 100 enheter per milliliter penicillin streptomycin. 48 timmar efter transfektion, samla supernatanten och filtrera den genom ett 0,22 mikrometers sprutfilter för porstorlek.Påbörja transduktionen genom att så svansspetsen fibroblaster vid 10, 000 celler per kvadratcentimeter på 0,1%gelatin förlackerade rätter i FEX medium. Inkubera vid 37 grader Celsius i 24 timmar. När du utför detta steg är det viktigt att lägga till de fyra retrovirala supernatanterna på ett lika stort förhållande för att säkerställa att alla fyra transgener bidrar lika mycket till omprogrammeringsprocessen.På följande dag, förbereda en transduktion blandning genom att först lägga till en volym viral supernatant för varje omprogrammering faktor kompletteras med fyra mikrogram per milliliter av retroviral infektion reagens till sex volymer av FEX medium. Därefter aspirerar du FEX-mediet från fibroblastkulturen och lägger till transduktionsblandningen. Inkubera transduktionsreaktionen i fyra timmar vid 37 grader Celsius vid hypoxiska förhållanden vid 5%koldioxid och 4%syre.Efter fyra timmar aspirerar transduktionsblandningen och lägger till nytt omprogrammeringsmedium. Inkubera vid 37 grader Celsius under hypoxiska förhållanden i åtta dagar, lägga till färska omprogrammering medium varannan dag. Observera framgångsrik omprogrammering med gav kluster av celler som lossnat från plattan.För att skörda omprogrammerade celler från skålen för vidare analys, försiktigt pipettera dem upp och ner och sedan samla in cellerna. Efter framgångsrik omprogrammering av IEPs, YFP-positiva celler är observerbara så tidigt som fem dagar efter transduktion. De blir runda, lyfter från ytan av plattan, börjar bilda kluster och visar en erythroid föregångare-liknande morfologi.Hemoglobinization av vissa celler är uppenbart genom positiva benzidin färgning. En liten fraktion uttrycker den erytroida ytmarkören TER-119. Vid dag åtta kan stora YFP-positiva kluster ses.Dag åtta iEPs har en mer differentierad erythroid fenotyp än dag fem iEPs. De är betydligt mindre, har samlat mer hemoglobin, och visar ökat uttryck för TER-119. Genuttryck analys av qPCR av iEPs samlas in på dag åtta visar att de nästan har stängt av uttryck av fibroblast gener och har upregulated många erythroid gener.Efter att ha utfört BFU-e kolonibildande analyser på de omprogrammerade cellerna, bildar dag åtta iEPs två typer av kolonier, tydligt röda och inte synbart röda. Medan celler från röda kolonier visade erythroblast morfologi, celler från icke-röda kolonier inte. Ungefär en av 1, 000 dag fem iEPs bildade röda kolonier medan endast ungefär en i 10, 000 kolonier bildas från dag åtta iEPs.Omprogrammeringseffektivitet av svans-tip fibroblaster eller TTFs påverkas av passagen nummer. TTFs som hade passaged nio gånger visade en dramatisk minskning av förmågan att producera kluster av ieps jämfört med de celler som hade passaged tre gånger. Vidare kan olika odlingsförhållanden påverka effektiviteten vid omprogrammering.Transduced TTFs odlade i normoxia är mycket långsammare att programmera om och IEP kluster observeras efter 10 dagar i stället för fem till åtta dagar. Efter denna procedur kan metoder som kolonibildande analyser, qPCR- och FACS-analys tillämpas i syfte att bestämma celldifferentieringsstatus. Sedan dess utveckling, denna teknik banar väg för forskare inom området erytropoiesi att förstå övergången mellan primitiva och definitiva erytroida celler i mus och människa.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabil och effektiv genetisk modifiering av celler i vuxen mus V-SVZ för analys av neurala stamceller autonoma och icke-självständiga effekter

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Murin Dermal Fibroblast Isolering av FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Generera Primär fibroblastkulturer från mus Öron och Tail Vävnader

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analys av proteinuttryck att studera Lineage Specifikation i mus Preimplantatorisk embryon

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Omprogrammering Mouse Embryonala fibroblasts med transkriptionsfaktorer att inducera en Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Uppskatta cardiomyocyte Subtyper Efter transkriptionsfaktor-medierad Omprogrammering av mus embryonala fibroblaster

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation av byggnadsställning-fri, tredimensionella Insulin att uttrycka Pancreatoids från mus bukspottskörteln föräldraparets In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Dämpning av Pro-fibrotiska signalering potentierar faktor-medierad omprogrammering av mus embryonala fibroblaster till inducerad hjärtmuskelcellerna

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

En direkt och enkel metod för att bedöma Drosophila melanogasterlönsamhet från embryo till vuxen

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Vaskulär gjutning av vuxna och tidiga Postnatala Mus lungor för Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...