Name: direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors
Uploaded: 2018-12-14T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

Biz Evelyn Wang ve Gregory Hyde (Whitehead Enstitüsü, Cambridge, MA) klonlama ve Harvey Lodish (Whitehead Enstitüsü) için birçok retroviral kütüphane oluşturmak için kullanılan plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz berkay Siva ve Sofie Singbrant (Moleküler Tıp bölümü ve gen terapisi, Lund Üniversitesi), Göran Karlsson ve Shamit Soneji (moleküler Hematoloji Bölümü, Lund Üniversitesi) Açıklama IEP üretim rolleri için teşekkür ederim. Ayrıca kabul ve teşekkür Julian Pulecio (rejeneratif tıp merkezi, Barcelona Biyomedikal Araştırma Parkı), Violeta Rayonu-Estrada (The Rockefeller Üniversitesi, New York), Carl Walkley istiyorum (St. Vincent'ın Enstitüsü tıbbi araştırma ve Bölümü tıp, St Vincent'ın hastane, Melbourne Üniversitesi), Ángel Raya (Katalan kurumun araştırma ve ileri araştırmalar, Barcelona) ve Vijay G. Sankaran (Broad Enstitüsü Massachusetts Institute of Technology ve Harvard, Cambridge ) Bu çalışmaya önceki katkılarından dolayı. Bu eser (için JF); Ragnar Söderberg Vakfı tarafından desteklenmiştir İsveç Araştırma Konseyi (için JF); Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare (için JF); İsveçli Vakfın Stratejik Araştırma (için JF); Åke Wiberg'ın kuruluşuna (J.F.); Marie Curie tümleştirme grant (için JF).

1. kuruluş ve bakım birincil fare kuyruk Fibroblast kültürler İpucu
<ol><li>% 0.1 jelatin ile yüzeyini örten ve bulaşıkları yaklaşık 20 dk 37 ° C'de için kuluçka (10 cm çanak bir kuyruk için tavsiye) jelatin kaplı yemekleri hazırlamak Çanak jelatin çözümden Aspire edin ve en az 2 h için kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Fareler tarafından servikal çıkığı ötenazi. Kuyruk kuyruk tabanında kesme makasla kaldırın. Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) kuyrukta % 2 fetal Sığ...

<ol>
	<li>Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+We+Really+Vastly+Outnumbered?+Revisiting+the+Ratio+of+Bacterial+to+Host+Cells+in+Humans.">Are We Really Vastly Outnumbered? Revisiting the Ratio of Bacterial to Host Cells in Humans.</a> Cell. 164 (3), 337-340 (2016).</li><li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing,+tripotent+neural+precursor+cells.">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2527-2532 (2012).</li><li>Szabo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+multilineage+blood+progenitors.">Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors.</a> Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).</li><li>Pereira, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a+hemogenic+program+in+mouse+fibroblasts.">Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).</li><li>Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+reprogramming+of+murine+fibroblasts+to+hematopoietic+progenitor+cells.">Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells.</a> Cell Reports. 9 (5), 1871-1884 (2014).</li><li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+fibroblasts+into+bipotential+hepatic+stem+cells+by+defined+factors.">Reprogramming fibroblasts into bipotential hepatic stem cells by defined factors.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 328-340 (2013).</li><li>Hendry, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transcriptional+reprogramming+of+adult+cells+to+embryonic+nephron+progenitors.">Direct transcriptional reprogramming of adult cells to embryonic nephron progenitors.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 24 (9), 1424-1434 (2013).</li><li>Vierbuchen, T., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+conversions:+unnatural+but+useful.">Direct lineage conversions: unnatural but useful.</a> Nature Biotechnology. 29 (10), 892-907 (2011).</li><li>Capellera-Garcia, S., Flygare, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+lineage+reprogramming:+a+useful+addition+to+the+blood+cell+research+toolbox.">Direct lineage reprogramming: a useful addition to the blood cell research toolbox.</a> Expert Review of Hematology. 10 (2), 107-109 (2017).</li><li>Capellera-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+Minimal+Factors+Required+for+Erythropoiesis+through+Direct+Lineage+Conversion.">Defining the Minimal Factors Required for Erythropoiesis through Direct Lineage Conversion.</a> Cell Reports. 15 (11), 2550-2562 (2016).</li><li>Mahmoudi, S., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+reprogramming:+a+two-way+street.">Aging and reprogramming: a two-way street.</a> Current Opinions in Cellular Biology. 24 (6), 744-756 (2012).</li><li>Singbrant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+couples+erythropoiesis,+B-lymphopoiesis,+and+bone+homeostasis+within+the+bone+marrow+microenvironment.">Erythropoietin couples erythropoiesis, B-lymphopoiesis, and bone homeostasis within the bone marrow microenvironment.</a> Blood. 117 (21), 5631-5642 (2011).</li><li>Heinrich, A. C., Pelanda, R., Klingmuller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+visualization+and+conditional+mutations+in+the+erythroid+lineage.">A mouse model for visualization and conditional mutations in the erythroid lineage.</a> Blood. 104 (3), 659-666 (2004).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Psaila, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+human+megakaryocyte-erythroid+progenitors+identifies+distinct+megakaryocyte+and+erythroid+differentiation+pathways.">Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways.</a> Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).</li><li>Pulecio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Conversion+of+Fibroblasts+to+Megakaryocyte+Progenitors.">Direct Conversion of Fibroblasts to Megakaryocyte Progenitors.</a> Cell Reports. 17 (3), 671-683 (2016).</li><li>Kurita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+immortalized+human+erythroid+progenitor+cell+lines+able+to+produce+enucleated+red+blood+cells.">Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells.</a> PLoS One. 8 (3), 59890 (2013).</li></ol>

Dört faktör kokteyl, overexpression, GATA1, TAL1, LMO2 ve c-MYC (GTLM), fare ve insan fibroblast iEPs10için doğrudan yeniden programlamak için yeterli. Programlanmış erythroid hücreleri bona fide erythroid ataları morfoloji, fenotip, gen ekspresyonu ve koloni kurma yeteneği açısından büyük ölçüde andıran. Bu bulgu gelişimsel faktörler hematopoiesis içinde tanımla...

Kırmızı kan hücreleri (RBCs) tüm omurgalıların gereklidir ve tüm hücreleri insan organları%184'yapmak. Yetişkin yaşam için gelen embriyonik, sağlığımız çok RBC homeostazı tam regülasyonu bağlıdır. Olgun RBCs geliştirme yetişkinlik boyunca devam eden üretim arttığından bilinir. RBC geliştirme ve ilkel ve kesin arttığından arasında geçiş alacak ana düzenleyiciler tanımlamak için arttığından araştırma büyük bir sorun olduğunu. Doğrudan soy erythroid ataları yeniden şekillendirmek için daha erythroid geliştirme içinde vivoanlamak için bir fırsat sunuyor.
Doğrudan soy da transdifferentiation bilinen (DLR), yeniden programlama pluripotent ve multipotent progenitör aşamaları atlayarak bir hücre tipi doğrudan içine başka yeniden programlama işlemidir. DLR, sinirsel2, hematopoetik3,4,5, hepatik6 ve nefrotik7, progenitör hücre de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipleri üretmek için şu ana kadar kullanılmıştır. Gelişimsel biyologlar için DLR lineage bağlılık ve terminal farklılaşma işlemler8,9sorgulama yönleri için önemli bir araç haline gelmiştir. DLR tamamlayan ve kısmen in vivo çalışmalar anlayış mekanizmaları hücre kader geliştirme sırasında faktörlerin belirlenmesi için değiştirin. Bu raporda açıklanan erythroid ataları yeniden programlama için DLR protokol alanı arttığından gelişim çalışmaları için ücretsiz bir yöntem sağlar.
Daha önce dört faktör kokteyl, overexpression, GATA1, TAL1, LMO2 ve c-MYC (GTLM), fare ve insan fibroblast doğrudan bağlı erythroid ataları için yeniden programlamak için yeterli olduğunu göstermiştir (iEPs) 10. erythroid GTLM yeniden programlanan hücreler büyük ölçüde bona fide ilkel erythroid ataları morfoloji, fenotip ve gen ifade10açısından benzer. Böylece iEPs nükleer silahların yayılmasına karşı kapasitesi sınırlı ve çekirdekli eritrositler geçici kesin arttığından başlangıcından önce erken embriyo üretilen benzer olgun. (Örneğin, nokta faktörler veya diğer faktörlerin yanı sıra yeniden programlama içinde mutasyonlar) programlama koşullarında değişiklikler yaparak, biri nasıl bu erythroid geliştirme ve farklılaşma değişikliklere neden anlayabiliyorum. Biz örneğin Klf1 veya Myb eklenmesi için GTLM kokteyl globin ifade deseninin ağırlıklı olarak embriyonik (ilkel) değişiklikleri için esas olarak yetişkin göstermiştir (kesin). Bu bulgu DLR arttığından gelişimsel faktörleri tanımlamak için bir araç olarak kullanarak geçerlilik doğruluyor.
Burada, iEPs fare kuyruk ucu fibroblastlar (TTF) oluşturma işlemine anahat. Temsilcisi sonuçlarımızda fibroblastlar üzerinden erythroid soy izleme fareler üzerinde yeniden programlama yapılır (Epor- Cre R26- eYFP) Rosa26 odağı tüm gelen sarı floresan protein (eYFP) ifade bu hücreleri erythroid soy bağlılık kolay görselleştirme sağlayan eritropoetin reseptör ifade ettiler. Bu yöntemi kullanarak, YFP pozitif (EpoR +) hücrelerinin beş gün sonra iletim gibi erken mevcut. Bu iletişim kuralı, bu nedenle, erythroid ataları vitroüretimi için hızlı ve sağlam bir teknik sunar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1141px;" width="1142">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM without sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30022.01</td>
			<td style="width:505px;">Culturing media for PhGP cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM with sodium pyruvate</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30243.01</td>
			<td>Culturing media for tail tip fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">StemSpan Serum Free Expansion Media (SFEM)</td>
			<td style="width:167px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td style="width:123px;">9650</td>
			<td>Reprogramming media&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal Bovine Serum HyClone</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30071.03HI</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin/Streptomycin HyClone (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td>Antiboiotic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Non-Essential Amino Acids (100x)</td>
			<td style="width:167px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:123px;">11140050</td>
			<td>SNL media is suppplemented with this</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Trypsin HyClone (1x)</td>
			<td style="width:167px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30042.01</td>
			<td>Cell dissociation agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Murine Stem Cell Factor (mSCF)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">250-03</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Recombinant Murine Il-3</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">213-13</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">human recombinant erythropoietin (hrEPO)</td>
			<td style="width:167px;">Peprotech</td>
			<td style="width:123px;">100-64</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">50-02-2&#160;&#160;</td>
			<td>Added to reprogramming media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">9000-70-8&#160;</td>
			<td>Dissovled in dH2O and used for coating plates. Ensure sterility before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Blasticidin S hydrochloride</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">3/9/3513</td>
			<td>Selection antibiotic. Affects both pro- and eukaryotic cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td style="width:167px;">Ge Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30850.03</td>
			<td>Used for washing steps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Polybrene</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">TR-1003-G</td>
			<td>Infection / Transfection&#160; Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td style="width:167px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2311</td>
			<td>Transfection Reagent for PhGP cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Merck</td>
			<td style="width:123px;">SLGP033RS</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">BD Emerald Hypodermic Syringe</td>
			<td style="width:167px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:123px;">SKU: 307736</td>
			<td>Used for filtering virus supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">100 mm Culture Dish</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430167</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">6-well plate</td>
			<td style="width:167px;">Falcon</td>
			<td style="width:123px;">10799541</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Jeweler Forceps #5</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">66-7642</td>
			<td>Used for handling small tail fragments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Sklarlite Iris Scissors</td>
			<td style="width:167px;">Sklar</td>
			<td style="width:123px;">23-1149</td>
			<td>Used for cutting the tail into small pieces</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Lineage Cell Depletion Kit, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:123px;">130-090-858</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">CD117 MicroBeads, mouse</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-224</td>
			<td>For depletion of hematopoietic cells in fibroblast cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PheonixGP cells</td>
			<td style="width:167px;">ATCC</td>
			<td>CRL-3215</td>
			<td>retroviral packaging cell line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">EcoPAC vector (pCL-Eco)&#160;</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP2-29540</td>
			<td>retroviral helper vector containing gag and pol genes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Gata1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Tal1</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-Lmo2</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">pMX-cMyc</td>
			<td style="width:167px;">Cloned in-lab</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellSens Standard 1.6 software&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>Cytospin analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct lineage reprogramming of adult mouse fibroblast to erythroid progenitors

Erythroid hücre bağlılık ve farklılaşma etkinleştirmesi belirleme ve faktörler olgunlaşması hücre kaderi bir grup tarafından düzenledi lineage tarafından kısıtlanmış transkripsiyon ağ üzerinden devam etmek. Biz daha önce faktörler doğrudan lineage fibroblastlar indüklenen erythroid ataları/öncüleri (iEPs) yeniden programlama kullanarak kırmızı kan hücresi geliştirme talimat için gerekli en az sayıda tanımlamak için yola çıktı. Biz bu overexpression Gata1, Tal1, Lmo2ve c-Myc (GTLM) hızlı bir şekilde dönüştürmek fare ve insan fibroblast doğrudan bona fide erythroid hücre morfolojisi, açısından benzer iEPs için olabilir gösterdi fenotip, ve gen ekspresyonu. Biz iEPs arttığından ve hücre kader düzenleme eğitim için paha biçilmez bir araç sağlamak niyetindeyim. Burada fare kuyruk ucu fibroblastlar (DLR) yeniden programlama iEPs üzerinden transkripsiyon faktörü uygulamalı doğrudan lineage dönüştürme kademeli işlemi açıklanmaktadır. Bu örnekte, biz fibroblastlar gelen sarı floresan protein (YFP) erythroid hücre görselleştirme sağlayan eritropoetin reseptör gen (EpoR) düzenleyici kontrolü altında hızlı erythroid soy izleme fareler içinde yeniden programlama yapmak yeniden programlama üzerine kader indüksiyon. Bu iletişim kuralı fibroblastlar beş-sekiz gün içinde iEPs programlanabilir.
Gelişmeler hala süreci için yapılabilir iken, biz GTLM-aracılı yeniden programlama hızlı ve doğrudan bir süreç, bona fide özelliklerini içeren hücreleri erythroid yaratıcı ve öncü hücreleri verimli gösteriyor ki.

Burada iEPs gelen yetişkin fibroblastlar transkripsiyon faktörü odaklı DLR kullanarak üretim için tekrarlanabilir bir protokol mevcut. Akış Sitometresi, koloni oluşturan deneyleri ve gen kullanarak hücre yeniden programlama değerlendirmek ifade analizi. Görselleştirme erythroid hücre kaderi dönüşüm yardımcı olmak amacıyla, fibroblastlar üzerinden erythroid soy izleme fareler üzerinde yeniden programlama yapılır (Epor- Cre R26- eYFP) Sarı floresa...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors at JoVE.com

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Üreten indüklenen için burada bizim iletişim kuralı mevcut erythroid ataları (iEPs) üzerinden fare yetişkin fibroblastlar transkripsiyon faktörü odaklı kullanarak doğrudan lineage (DLR) yeniden şekillendirmek için.

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Fibroblastlardan eritroid ata hücrelerine doğru soy yeniden programlama. Eritroid hücre kaderini belirleyen transkripsiyonel düzenleme süreçlerini daha iyi incelemek için laboratuarımızda geliştirdiğimiz yeni bir yöntemdir. Geliştirme yi incelemek için doğrudan soy yeniden programlamakullanmanın en büyük avantajı çok basit bir teknik olmasıdır.Yani, örneğin, nakavt fareler içinde fonksiyon çalışmalarıkaybı ile karşılaştırıldığında, burada çok kolay faktör manipüle, belirli bir zaman noktasında aşırı ifade ve daha sonra kolayca kromatin değişiklikleri veya gen ekspresyon değişiklikleri gibi downstream etkileri incelemek için yeterli malzeme elde edebilirsiniz. Bu yöntem, fare kuyruk ucu fibroblastlarının eritroitoid atalarına yeniden programlanmasına odaklanırken, diğer fibroblast hücre tiplerine ve insanlar da dahil olmak üzere diğer organizmalara da uygulanabilir. Bu tekniğin etkileri transfüzyon tıbbına kadar uzanır ve bu da in vitro olarak kırmızı kan hücrelerinin üretimine giden yolu açmaktır.Prosedürü gösteren araştırma grubumdan Alban Johansson olacak. % 0.1 jelatin ile bulaşıkyüzeyini kaplayarak başlayın. Yaklaşık 20 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yat.Jelatin çözeltisini aspire edin ve yemeklerin kurumasını bekleyin. Kaldırmak için ötenazi li bir farenin kuyruğunun tabanını kesmek için makas kullanın. Kuyruk kullanıma hazır olana kadar %2 FBS ile DPBS'ye yerleştirin.Steril koşullar altında bir doku kültürü başlık, DPBS 0.02% tripsin EDTA seyreltilmiş trippsin çözeltisi hazırlamak ve kaplamasız 10 santimetrelik çanak içine 5 mililitre ekleyin. Bir doku kültürü başlık olarak, onu kapsayacak şekilde 15 mililitrelik bir tüp içinde yeterli% 70 etanol kuyruk yıkayın ve daha sonra DPBS. Kuyruğu bir tabağa düz yerleştirin ve yerinde tutmak için forceps kullanın.Tabandan uca uzunlamasına eksenboyunca kuyruk üzerinde bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. Kuyruğu kavramak ve dikey olarak tutmak için bir çift forceps kullanın ve kuyruk tabanında kesi yanında deri kavrama ve geri soyma kullanabilirsiniz ikinci bir çift kullanın. Deri kuyruğun ucuna doğru aşağı doğru çekerek soyulmuş kadar kesiğin her iki tarafında bunu gerçekleştirin.Soyulmuş kuyruğu, tripsin çözeltisini içeren yemeğin üzerinde forsepslerle tutun. Küçük parçalar halinde kuyruk kesmek için diseksiyon makas kullanın. Daha küçük parçalar halinde tripsin çözeltisi bu parçaları parçalamak ve daha sonra 10 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka makas kullanın.Tripsin gidermek için, FEX orta iki cilt ekleyin, Takviyeleri ve antibiyotikler ile DMEM. 50 mililitrelik bir tüp içine çanak tüm içeriğini toplayın. Tüpü 350 kez G'de beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin.Supernatant aspire ve taze FEX orta 10 mililitre kuyruk parçaları içeren pelet resuspend. Bu süspansiyonu jelatin kaplı bir tabağa aktarın. %5 karbondioksit ve %4 oksijenle 37 derecede kuluçkaya yatarak her iki günde bir taze FEX ortamı ekleyin.Kuyruk parçalarının yemeğin altına bağlandığı ve fibroblastların onlardan uzaklaştığını gösteren beş ila yedi gün sonra kültürü gözlemleyin. Fibroblastkümeleri görünür olduktan sonra, yavaşça kuyruk parçaları yerinden çanak sallayın. Tüm kemik parçaları ile orta aspire, plaka bağlı fibroblastlar bırakarak.Taze FEX orta ve kültür fibroblastlar 10 mililitre ekleyin confluent kadar fibroblastlar. Fibroblast kültüründe hematopoetik ataların kontaminasyon olmamasını sağlamak için, el yazmasında açıklandığı gibi tripsin EDTA kullanarak hücreleri plakadan ayırın. Orta ekleyin ve hücreleri toplamak ve antikorlar ile manyetik boncukekleyin.Hematopoetik belirteçleri ifade eden hücreleri kaldırmak için manyetik ayırma sistemi kullanın. Bu adım ın dahil edilmesi kesinlikle hayati önem taşımaktadır, çünkü kültürde bulunabilecek herhangi bir HSPC'yi ve bu nedenle FACS analizinin olduğu gün herhangi bir yanlış pozitif sonuç olasılığını ortadan kaldırır. Tohum retroviral ambalaj hücreleri yaklaşık 25, 000 hücre kare santimetre kare bir doku kültürü tedavi çanak üzerinde.Yüksek glikozLu DMEM'deki hücreleri bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle inkübe edin. Ertesi sabah, orta çıkarın ve hiçbir katkı maddesi ile DMEM kültür için kullanılan hacmin yarısını ekleyin. Öğleden sonra, transfeksiyon için gerekli% 70-80 birleşimi için hücreleri kontrol edin.Her yeniden programlama faktörü için gag, Pol ve zarf genleri içeren yardımcı vektörün altı mikrogramı ve üç mikrogramı ile altı mikrogramlık bir karışımını hazırlayarak transfeksiyona başlayın. Daha sonra, her yeniden programlama faktörü için steril polistiren tüpe 300 mikrolitre oda sıcaklığında DMEM ekleyin. Daha sonra dikkatlice tüp duvar ile temas önlemek için doğrudan orta içine oda sıcaklığında ticari transfeksiyon reaktif 27 mikrolitre ekleyin.Plazmid karışımını tüp içeren transfeksiyon reaktifine ekleyin. Girdap kısaca ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca karışımı kuluçkaya yatırın. Girdap transfeksiyon reaktif DNA karışımı tekrar.Retroviral ambalaj hücrelerine damla şeklinde ekleyin, böylece kültüre eşit olarak yayılır ve 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırılır. Transfeksiyondan 24 saat sonra, ortayı çıkarın ve mililitre penisilin streptomisin başına 100 ünite ile DMEM ekleyin. Transfeksiyondan 48 saat sonra, supernatant'ı toplayın ve 0,22 mikrometre lik gözenek boyutuşırşırıktan geçirin.FEX ortamda%0,1 jelatin önceden kaplanmış yemeklerde kuyruk ucu fibroblastlarını santimetre kare başına 10,000 hücreye tohumlayarak transdüksiyona başlayın. 24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Bu adımı gerçekleştirirken, dört transgenin de yeniden programlama sürecine eşit katkıda bulunmasını sağlamak için dört retroviral süpernatantı eşit oranda eklemek önemlidir.Ertesi gün, ilk FEX orta altı hacimli retroviral enfeksiyon reaktif mililitre başına dört mikrogram ile desteklenen her yeniden programlama faktörü için viral supernatant bir hacim ekleyerek bir transdüksiyon karışımı hazırlamak. Bundan sonra, fibroblast kültüründen FEX ortamı aspire ve transdüksiyon karışımı ekleyin. Transdüksiyon reaksiyonu hipoksik koşullarda %5 karbondioksit ve %4 oksijenle 37 santigrat derecede dört saat kuluçkaya yatırın.Dört saat sonra, transdüksiyon karışımı aspire ve taze yeniden programlama ortamı ekleyin. Hipoksik koşullarda 8 gün boyunca 37 derecede kuluçkaya yat, her iki günde bir yeni programlama ortamı ekleyin. Plakadan ayrılan hücre kümeleri ile başarılı yeniden programlama gözlemleyin.Daha fazla analiz için çanak yeniden programlanmış hücreleri hasat için, yavaşça onları pipet yukarı ve aşağı ve daha sonra hücreleri toplamak. IED'lerin başarılı bir şekilde yeniden programlanmasından sonra, YFP pozitif hücreler transdüksiyondan beş gün sonra gözlemlenebilir. Yuvarlak olurlar, plakanın yüzeyinden yükselirler, kümeler oluşturmaya başlarlar ve eritroid öncül benzeri morfolojisi sergilerler.Bazı hücrelerin hemoglobinizasyonu pozitif benzidin boyama ile belirgindir. Küçük bir kısmı eritroid özgü yüzey belirteci TER-119 ifade eder. Sekizinci güne kadar büyük YFP pozitif kümeler görülebilir.Sekizinci gün iEP'ler beşinci gün iEP'lerden daha farklı eritroid fenotipgösterirler. Onlar önemli ölçüde daha küçük, daha fazla hemoglobin birikmiş, ve TER-119 artan ifade göstermektedir. Sekizinci gün toplanan iPCR'lerin qPCR'ı ile yapılan gen ekspresyonu analizi, fibroblast genlerinin ekspresyonunu neredeyse kapattıklarını ve birçok eritroid geni güncellediklerini göstermektedir.Yeniden programlanmış hücrelerde BFU-e koloni oluşturan tahliller yaptıktan sonra, sekizinci gün iEP'ler belirgin kırmızı ve gözle görülür kırmızı olmayan iki tür koloni oluştururlar. Kırmızı kolonilerden hücreler eritroblast morfolojisi sergilerken, kırmızı olmayan kolonilerden hücreler sergilenmedi. Yaklaşık 1,000 günde bir, beş iEP kırmızı koloniler oluşurken, sekiz giyotlu iEP'den sadece 10,000 koloniden biri oluşmuştur.Kuyruk ucu fibroblastlarının veya TTF'lerin yeniden programlama verimi geçiş sayısından etkilenir. Dokuz kez geçen TTF'ler, üç kez geçen hücrelere kıyasla iED kümeleri üretme yeteneğinde dramatik bir azalma gösterdi. Ayrıca, farklı kültür koşulları yeniden programlama verimliliğini etkileyebilir.Normoksia da kültüre aktarılan TTF'ler yeniden programlanır ve IEP kümeleri beş ila sekiz gün yerine 10 gün sonra gözlenir. Bu işlemden sonra hücre farklılaşma durumunu belirlemek için koloni oluşturma tahlilleri, qPCR ve FACS analizi gibi yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, gelişiminden bu yana, fare ve insan daki ilkel ve kesin eritroid hücreler arasındaki geçişi anlamada eritropoez alanında araştırmacıların önünü açmektedir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ&#39;una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Fare Kulak ve Kuyruk Dokular Yaratma İlköğretim Fibroblast Kültürleri

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Suppression of Pro-fibrotic Signaling Potentiates Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts into Induced Cardiomyocytes

Pro-fibrotik sinyal bastırma faktörü-aracılı fare embriyonik fibroblastlar indüklenen Cardiomyocytes yeniden programlama Potentiates

Trans-differentiation of one somatic cell type into another has enormous potential to model and treat human diseases. Previous studies have shown that ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Drosophila Melanogaster'In Embriyodan Yetişkine Canlılığını Değerlendirmek Için Doğrudan ve Basit Bir Yöntem

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Mikro-BT Görüntüleme için Erişkin ve Erken Postnatal Fare Akciğerlerinin Vasküler Döküm

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...