Name: identification of homologous recombination events in mouse embryonic stem cells using southern blotting and polymerase chain reaction
Uploaded: 2018-11-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

هذا العمل وتلقى الدعم من البرنامج العام لمؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (منح رقم 31571432) والبشرية المقاطعة العلوم الطبيعية مؤسسة من الصين (رقم المنحة 2015JC3097) ومؤسسة البحوث للتعليم المكتب هونان مقاطعة بالصين (ك منحة رقم 15 054).

1-التصميم لاستهداف Construct(s)، تحقيقات للجنوب وصمة عار، وكبسولة تفجير لبكر
<ol><li>حدد أول إكسون الترميز (إكسون 2) الجينات Myh9 للتعطيل أو الإدراج في التطبيق من خروج المغلوب/تدق في ذكرت هنا.</li>
	<li>استرداد 5 كيلو بايت المنبع و 5 كيلو بايت المصب تسلسل الحمض النووي المحيطة إكسون Myh9 2 من موقع genome.ucsc.edu<...

<ol>
	<li>Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+combining+homologous+recombination+and+site-specific+recombination+for+targeted+mutagenesis+in+Drosophila.">A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).</li><li>Skarnes, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).</li><li>Vogel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nobel+Prizes.+A+knockout+award+in+medicine.">Nobel Prizes. A knockout award in medicine.</a> Science. 318 (5848), 178-179 (2007).</li><li>Salsman, J., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+genome+editing+in+the+CRISPR+era.">Precision genome editing in the CRISPR era.</a> Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).</li><li>Capecchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).</li><li>Van, d. W. L., Adams, D. J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+targeted+manipulation+of+the+mouse+genome.">Tools for targeted manipulation of the mouse genome.</a> Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).</li><li>Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+issues+in+mouse+genome+engineering.">Current issues in mouse genome engineering.</a> Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).</li><li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines.">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).</li><li>Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+genes+introduced+into+cultured+pluripotential+cells+by+retroviral+vector.">Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector.</a> Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).</li><li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells.">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51 (3), 503-512 (1987).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474 (7351), 337 (2011).</li><li>Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+for+all+reasons.">A mouse for all reasons.</a> Cell. 128 (1), 9-13 (2007).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Pettitt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agouti+C57BL/6N+embryonic+stem+cells+for+mouse+genetic+resources.">Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources.</a> Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).</li><li>Gertsenstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Germ+Line+Transmitting+Chimeras+from+C57BL/6N+ES+Cells+by+Aggregation+with+Outbred+Host+Embryos.">Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos.</a> PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).</li><li>Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+DNA+sequences+into+the+human+chromosomal+|[beta]|-globin+locus+by+homologous+recombination.">Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination.</a> Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).</li><li>Deng, C., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+gene+targeting+frequency+as+a+function+of+the+extent+of+homology+between+the+targeting+vector+and+the+target+locus.">Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus.</a> Molecular &amp; Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).</li><li>Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+confirmation+of+gene+targeting+in+embryonic+stem+cells+using+two+long-range+PCR+techniques.">Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques.</a> Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).</li><li>Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+detection+of+homologous+and+non-homologous+recombination+events+using+three+oligonucleotide+MLPA.">Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA.</a> Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).</li><li>G&#243;mezrodr&#237;guez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+q-PCR+as+a+method+of+screening+for+gene+targeting+in+mammalian+cells+using+conventional+and+whole+BAC-based+constructs.">Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs.</a> Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).</li><li>Kim, H. S., Smithies, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+fragment+assay+for+gene+targeting+based+on+the+polymerase+chain+reaction.">Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction.</a> Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).</li><li>Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+mutation+in+mouse+En-2+gene+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).</li><li>Ma, X., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vertebrate+nonmuscle+Myosin+II+in+development+and+human+disease.">The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease.</a> Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).</li><li>Malonek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+the+dynamics+of+cortical+blood+flow,+oxygenation,+and+volume+changes+following+sensory+stimulation.">Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).</li><li>Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+and+mutation+of+nonmuscle+myosin+heavy+chain+II-B+results+in+a+defect+in+cardiac+myocyte+cytokinesis.">Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis.</a> Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).</li><li>Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+cell+adhesion+and+the+visceral+endoderm+following+ablation+of+nonmuscle+myosin+heavy+chain+II-A+in+mice.">Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).</li><li>Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+myosin+II+isoform+and+domain+specificity+during+early+mouse+development.">Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+MYH9-related+disease:+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A.">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238 (2012).</li><li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+MYH9+locus+for+high+efficient+gene+knock-in+and+stable+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).</li><li>Saito, S., Adachi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+Development+of+Gene-Targeting+Vectors+to+Increase+the+Efficiency+of+Genetic+Modification.">Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).</li><li>Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+detection+of+homologous+and+non-homologous+recombination+events+using+three+oligonucleotide+MLPA.">Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA.</a> Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).</li><li>Martin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+ORF1+dramatically+decreases+L1+retrotransposition+and+provides+insight+into+nucleic+acid+chaperone+activity.">A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity.</a> Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).</li><li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).</li><li>Luo, Y., Bolund, L., S&#248;rensen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pig+gene+knockout+by+rAAV-mediated+homologous+recombination:+comparison+of+BRCA1+gene+knockout+efficiency+in+Yucatan+and+G&#246;ttingen+fibroblasts+with+slightly+different+target+sequences.">Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and G&#246;ttingen fibroblasts with slightly different target sequences.</a> Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).</li><li>Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+genomic+Southern+blot+probes.">Automated design of genomic Southern blot probes.</a> BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).</li><li>Zimmer, A., Gruss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+chimaeric+mice+containing+embryonic+stem+(ES)+cells+carrying+a+homoeobox+Hox+1.1+allele+mutated+by+homologous+recombination.">Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination.</a> Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).</li></ol>

حاليا، نوكليسيس مصمم للتحرير الجينوم لا تزال لا يمكن استبدال ES خلية التكنولوجيا القائمة على استهداف الجين بسبب قضايا لها آثار خارج الهدف، وصعوبة في إدراج الحمض النووي جزء30،طويلة31. ويقدم هذا التقرير كأساليب الذهبي لتحديد الموارد البشرية الأحداث التي وقعت ...

تكنولوجيا الجينات استهداف الموارد البشرية في موريني دإط الخلايا يوفر أداة قوية لتشريح الخلوية عواقب الطفرات الوراثية المحددة1،2. أهمية ومغزى هذه التكنولوجيا تنعكس في اعترافها بعام 2007 جائزة نوبل في الطب أو الفيزيولوجيا3،4؛ وفي الوقت نفسه، وهو يمثل قدوم العصر الحديث ل هندسة الجينات5. يمكن أن تستخدم الجينات تستهدف من خلال الموارد البشرية مهندس تقريبا أي تغيير تتراوح بين الطفرات الكبيرة ترتيبات جديدة كروموسومية في الجينوم من الماوس دإط الخلايا6،7. من المعروف أن توليد ماوس خروج المغلوب الجينات المطلوبة قبل ظهور أدوات تحرير ما يسمى الجينوم، تطبيق التكنولوجيا استهداف الجين في دإط الخلايا8،9،10. خلال العقدين الماضيين، تم إنتاج 5,000 أكثر من استهداف جينات الفئران بهذا النهج لنمذجة الأمراض البشرية أو دراسة وظائف الجينات11. وأنشئت بجهد على نطاق الجينوم بالضربة قاضية لتوزيع ناقلات استهداف الجين واستنساخ الخلايا ES المستهدفة، والفئران الحية إلى المجتمع العلمي2،12،،من1314 , 15-مما لا شك فيه، وفاق يستند إلى الخلية بوساطة الموارد البشرية استهداف الجين التكنولوجيا كثيرا المتقدمة فهمنا لوظائف المورثات لعبت في سياق الفسيولوجية أو المرضية.
نظراً لأن الموارد البشرية هي حدث نادر نسبيا في الثدييات خلايا16،17، الهامة، والخطوة التالية بعد استهداف الجينات في خلايا ES مورين تحليل العديد من المستعمرات ES لتحديد عدد قليل من الحيوانات المستنسخة مع الطفرات الناتجة عن الموارد البشرية مع استهداف ناقلات18. وتشمل أساليب الذهب لتحديد الموارد البشرية الأحداث النشاف الجنوبي وبكر19،20. تشمل مزايا النهج أن النشاف جنوب يمكن التعرف على الحيوانات المستنسخة ES مستهدفة بشكل صحيح، ويسمح للباحثين تحليل بنية الحدث الجينات المستهدفة، مثل قق إدراج نسخة واحدة من البناء، في حين استراتيجية تقوم على بكر يسمح بالفحص السريع للموارد البشرية أحداث21،22. على الرغم من أن هذه الأساليب قد عيوب، مثل أن فمضيعة للوقت ويمكن أن يكون المغلوطة، استخدام التوافيقيه منهم على نطاق واسع المقبولة وتطبقها معظم المعامل في تحديد أحداث الموارد البشرية، خاصة في دإط الخلايا، لتوليد وراثيا تعديل الحيوانات.
إيسوفورمس ثلاثة من الميوسين نونموسكلي "شمال البحر الأبيض المتوسط" (الثانية) في الثدييات، ويتألف كل منهما من اثنين متطابقة NMHC IIs التي تم ترميزها بثلاثة جينات مختلفة (المسماة Myh9 و Myh10 و Myh14) واثنين من أزواج من سلاسل خفيفة، يشار إلى شمال البحر الأبيض المتوسط الثاني-ألف والثاني-باء وثانيا-ج23. دراسات سابقة قد أشارت إلى أن على الأقل إيسوفورمس شمال البحر الأبيض المتوسط الثاني-ألف والثاني-ب ضرورية للتنمية الماوس لأن الاجتثاث في فيفو من isoforms هذه النتائج في الفتك الجنينية24،،من2526. للتحايل على هذه المشكلة والحصول على رواية ثاقبة وظائف محددة isoform شمال البحر الأبيض المتوسط الثاني-ألف والثاني-باء في مراحل لاحقة من الماوس التنمية، بديل وراثية اعتمد استراتيجية استخدام ES يستند إلى الخلية بوساطة الموارد البشرية استهداف الجين التكنولوجيا إلى إنشاء سلسلة من نماذج الماوس27. أثناء تحديد المستنسخين ES المرجوة، استخدمت النشاف الجنوبي وطرق PCR، وهذه أثبتت أنها فعالة وموثوق بها27،28.
وتعتزم هذه الورقة تقديم وصف مفصل لجنوب النشاف وبكر، بما في ذلك تصميم استهداف vector(s)، probe(s)، والإشعال، وتنفيذ التجارب، وكذلك تحليل النتائج يتجلى في تحديد الحدث الموارد البشرية التواجد في خلايا ES لتهيئة الماوس "الثاني شمال البحر الأبيض المتوسط" الوراثية استبدال نماذج وبيانات تمثيلية. ويمكن أيضا اعتماد بروتوكولات هاتين الطريقتين المقدمة هنا للتعرف الأنماط الجينية للخلايا المحورة وراثيا أو الحيوانات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:903px;" width="903">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">BAC CLONE</td>
			<td style="width:232px;">BACPAC Resources Center (BPRC)</td>
			<td style="width:113px;">bMQ-330E21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN Large-Construct Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right">12462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:232px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:113px;">600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">T-easy vector</td>
			<td style="width:232px;">Promega</td>
			<td style="width:113px;">A1360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:391px;">Nuclei Lysis Solution</td>
			<td style="width:232px;">Promega</td>
			<td style="width:113px;">A7941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Precipitation Solution</td>
			<td style="width:232px;">Promega</td>
			<td>A7951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Denaturing Solution</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td>351-013-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Neutralizing Solution</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td>351-014-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP)</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td>27-9240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">UltraPure SSC, 20X</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">15557036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">15593031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">G418</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Salmon Sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">11304029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Not I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Dra I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">EcoR I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ganciclovir</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">G2536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman&#160;TurboBlotter Transfer System, Large Kits</td>
			<td style="width:232px;">Fisher Scientific</td>
			<td>09-301-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">[&#945;32P]dCTP</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEG013H100UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">ProbeQuan G-50 Micro Columns</td>
			<td style="width:232px;">GE Healthcare</td>
			<td>28-9034-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hybrisol I Hybridization Solution</td>
			<td style="width:232px;">Millipore</td>
			<td style="width:113px;">S4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodak X-Ray Film</td>
			<td>Z&#38;Z Medical</td>
			<td>844 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of homologous recombination events in mouse embryonic stem cells using southern blotting and polymerase chain reaction

بالنسبة للمسائل المتعلقة بالآثار خارج الهدف وصعوبة إدراج جزء الحمض النووي طويلة في تطبيق nucleases المصمم للجينوم الجذعية الجنينية، وتحرير (ES) يستند إلى الخلية استهداف الجين التكنولوجيا ليس لديها أوجه القصور هذه وعلى نطاق واسع يستخدم لتعديل جينوم الحيوان/الماوس بدءاً من الحذف/الملاحق الكبيرة لاستبدال النوكليوتيدات واحدة. جدير بالذكر أن تعريف الأحداث جزئ المتجانسة (HR) قليلة نسبيا اللازمة للحصول على المطلوب استنساخ ES هو خطوة رئيسية التي تتطلب أساليب دقيقة وموثوق بها. النشاف الجنوبية و/أو PCR التقليدية غالباً ما تستخدم لهذا الغرض. هنا، يمكننا وصف الإجراءات المفصلة لاستخدام تلك الأساليب اثنين لتحديد الموارد البشرية الأحداث التي وقعت في الماوس دإط الخلايا التي يراد الجين Myh9 الذاتية أن تعطل والاستعاضة عنها بترميز أخرى نونموسكلي الميوسين سلسلة ثقيلة IIs (NMHC IIs) كدناس. يتضمن الإجراء بأكمله من النشاف جنوب بناء استهداف vector(s) انهانسر، التحديد المخدرات، والتوسع وتخزين خلايا ES/الحيوانات المستنسخة، وإعداد، والهضم، والنشاف للحمض النووي (جدنا)، التهجين و غسالة من probe(s)، وخطوة أخيرة من أوتوراديوجرافي على أفلام الأشعة السينية. يمكن أن يؤديها بكر مباشرة مع جدنا استعداد والمخفف. للحصول على نتائج مثالية، ينبغي بدقة التخطيط المسابير وإنزيم التقييد (إعادة) مواقع قطع النشاف الجنوبي والإشعال لبكر. على الرغم من تنفيذ النشاف الجنوبية تستغرق وقتاً طويلاً وتتطلب عمالة مكثفة ولها نتائج PCR المغلوطة، التعرف الصحيح النشاف الجنوبي والفحص السريع ببكر يسمح بتطبيق هذه الأساليب الموصوفة وحدها أو مجتمعة وفي هذه الورقة استخدامها على نطاق واسع واستشارها معظم المعامل في التعرف على الأنماط الجينية لخلايا ES ووراثيا تعديل الحيوانات.

في هذه الورقة، بروتوكول مفصل النشاف الجنوبي وبكر هو وصف، الذي يستخدم لتحديد الموارد البشرية الأحداث التي وقعت في الماوس دإط الخلايا لتوليد نماذج الماوس استبدال الوراثية "الثاني شمال البحر الأبيض المتوسط"، باستخدام دإط الخلايا التكنولوجيا القائمة على الموارد البشرية ب?...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

نقدم هنا، بروتوكول مفصلة لتحديد الأحداث جزئ المتجانسة التي وقعت في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبية و/أو PCR. ويتجلى هذا الأسلوب توليد نونموسكلي الميوسين الثانية استبدال الوراثية الماوس النماذج باستخدام الجنينية يستند إلى الخلية الجذعية المتجانسة اقترانها بوساطة تستهدف التكنولوجيا التقليدية.

تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الجزيئية والخلوية، مثل تحديد أحداث إعادة التركيب المتجانسة في الخلايا الجذعية الجنينية للماوس. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها دقيقة وموثوقة، وتستخدم على نطاق واسع. لذا، يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لتحديد أحداث إعادة التركيب المتجانسة في الخلايا الجذعية الجنينية للماوس.ويمكن أيضا أن تطبق على نظم أخرى، مثل الخلايا المعدلة وراثيا أو الحيوانات. بشكل عام، سوف تناضل الفردية الجديدة لهذا الأسلوب لأنه يستغرق وقتاً طويلاً وينطوي على خطوات متعددة. لكل gDNA، مزيج 30 ميكرولترات من 10 × العازلة لDRA واحد، وثلاثة ميكرولترات من DRA واحد و 10 ميكروغرام من gDNAs لكل عينة.يضاف الماء حتى الحجم النهائي هو 30 ميكرولترات، واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها لهضم gDNAs. إعداد 1٪ agarose جل الكهرباء مع بروميد الإثيديوم. قم بتحميل العينات التي تم الحصول عليها سابقًا مع سلم كيلوبايت واحد على الجل ، وتشغيله بسرعة 30 إلى 40 فولت بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، نقع الجل في علبة تحتوي على محلول حمض الهيدروكلوريك 0.2 نيوتن. استخدم الشاكر لتهز الصينية بلطف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل الجل إلى علبة تحتوي على محلول الحمض النووي.اهزها بلطف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم نقل الجل في علبة تحتوي على حل تحييد الحمض النووي. وتهزها بلطف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.باستخدام نظام نقل تنازلي سريع، نقل DNAs من الجل إلى الغشاء. المقبل، وتجميع النشاف turble وكومة النشاف كما هو مبين في التعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة. بعد ذلك، أخرج الغشاء واغسله بـ 2 من سترات الصوديوم المالحة X لمدة دقيقة واحدة.امتصاص السائل مع الأنسجة، ومن ثم استخدام crosslinker الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط الحمض النووي مع الغشاء. للبدء في وضع العلامات على مسابير الحمض النووي مع النشاط الإشعاعي، إضافة الحرارة denatured مسابير DNAs إلى الأنبوب الذي يحتوي على استعداد للذهاب الحمض النووي وضع العلامات الخرز. الماصة صعودا وهبوطا لخلط.وإضافة خمسة ميكروليترات من deoxycytodine المسمى مشعا ثلاثي الفوسفات. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تنقية مسابير المسمى باستخدام G 50 أعمدة صغيرة وفقا للتعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة.استخدم عداد التألق لقياس النشاط الإشعاعي. للبدء في تهجين الأغشية باستخدام المسابير المسماة، ضع الغشاء في أنبوب التهجين. إضافة حل ما قبل التهجين المختلط.ضع الأنبوب في فرن التهجين واترك التهجين قبل ذلك 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم، إزالة الأنبوب من الفرن وصب محلول ما قبل التهجين في أنبوب 50 ملليلتر. إضافة التحقيق التشويه، ومزيج بلطف.لإزالة المسابير غير المهجّنة، ضع الغشاء في صينية تحتوي على سترات صوديوم ملحية X مع 0.1٪SDS واهزها بلطف عند 55 إلى 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بلف الغشاء بلف بلاستيكي ثم قم بإصلاحه في الكاسيت المتعرض. في غرفة مظلمة، يعرض الغشاء إلى ورقتين من فيلم الأشعة السينية.تطوير الفيلم لتصور النتائج. تحديد ما إذا كان استنساخ ES المقابلة هو واحد المطلوب مع هدف إعادة التركيب أم لا، وفقا لأحجام العصابات الحمض النووي التي اكتشفتها المسابير. في هذه الدراسة، يتم استخدام النشاف الجنوبي و PCR لتحديد أحداث الموارد البشرية التي تحدث في خلايا ماوس ES لتوليد نموذجين الماوس استبدال الجينية NM باستخدام خلايا ES تستند HR بوساطة تكنولوجيا الاستهداف.لأن يتم قطع DNAs الجينوم إلى أجزاء كثيرة بأطوال مختلفة، فإنها تعرض مسحة مثل حالة على هلام الحمض النووي. وهذا يشير إلى هضم كامل من DNAs الجينومية. كخطوة أخيرة من النشاف الجنوبي، يتم عرض إشارات من النشاط الإشعاعي مسمّى مسبار التهجين مع جزء الحمض النووي الهدف على الفيلم.ويعكس ظهور النطاقات المتوقعة حدوث أحداث الموارد البشرية في استنساخ ES. وفقا ل predesign في الدراسة ، وES استنساخ مع أليل تحور لها اثنين من حجم نطاقات متميزة. في حين أن الحيوانات المستنسخة من النوع البري ES لديها نطاق واحد فقط ، مما يشير إلى أن المستنسخات ES المطلوبة هي heterozygous.بعد تفاعل PCR، يمكن تحليل منتجات PCR على هلام الحمض النووي. إذا لوحظ نطاق محدد من حجم NPCR، وهذا يشير إلى حدوث الأحداث الموارد البشرية التي يمكن تأكيدها كذلك عن طريق تسلسل هذا النطاق PCR. امتدت الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى العلاج لتحديد طفرة النقطة لأن الأساس مطابق.أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن يكون المريض والحذر. بعد هذا الإجراء، طريقة أخرى مثل الحقن المجهري من الخلية ES في blastocysts يمكن أن يتم تنفيذها من أجل الإجابة على سؤال إضافي مثل تشكيل الحيوانات الشميرية. Aft تطورها، ومهدت هذه التقنية الطريق للباحث في مجالها البيولوجيا الجزيئية والخلوية لاستكشاف وظيفة جين معين أو نتيجة جين متحول في الفئران أو خارجها.لا ننسى أن العمل مع صمّة النشاط الإشعاعي P32 DCTB يمكن أن تكون خطرة للغاية وينبغي أن تكون الاحتياطات مثل التدريع مع مجلس الحماية دائماً اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Studying DNA and RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

تحسين تفاعل البلمرة المتسلسل-تقييد جزء طول تعدد الأشكال الجيني من ينفوخية السامة من قبل اللوني السائل / قياس الطيف الكتلي

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

كريسبر بوساطة إعادة تنظيم هيكل حلقة الكروماتين

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

قطره واحدة رقمي البلمرة المتسلسل لكشف شامل ومتزامن من الطفرات في المناطق الساخنة

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

البروتين الذاتية في الإنسان التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent باستخدام كريسبر/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

استزراع والتلاعب بالخلايا Crest العصبي O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

تقييم تفاعل البلمره المتسلسل المتداخل العالمي للكشف عن فيروسات الليسايسيس

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

الاصطناعي RNA بولميراز الثاني استطالة المجمعات لتشريح شارك في النسخ RNA معالجة الأحداث

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

اختبار قوي من تفاعل البوليميراز القائم على سلسلة لقياس السيتوسين-غوانين-غوانين ترينوكلوتيد يكرر في التهشاشة X التخلف العقلي-1 الجينات

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...