Name: identification of homologous recombination events in mouse embryonic stem cells using southern blotting and polymerase chain reaction
Uploaded: 2018-11-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Diese Arbeit erhielt Unterstützung durch das allgemeine Programm der National Natural Science Foundation of China (Grants Nr. 31571432), die menschlichen Provincial Natural Science Foundation of China (Grant No. 2015JC3097) und der Forschung Grundlage der Bildung Bureau Hunan Provinz, China (Grant Nr. 15 K 054).

1. Aufbau des Zielens Construct(s), Sonden für südlicher Fleck und Primer für PCR
<ol><li>Wählen Sie das erste kodierende Exon (Exon 2) des Gens Myh9 für Störungen oder Einfügung in der Anwendung von Ko/Knock-in hier berichtet.</li>
	<li>Rufen Sie die 5-kb vor- und 5 kb nachgeschaltete DNA-Sequenzen rund um das Myh9 Exon 2 von der genome.ucsc.edu -Website ab.</li>
	<li>Analysieren Sie Einschränkung Verdauung Muster von Enzymen (REs) mit 1 – 2 Schnitten in dieser 10-kb-Region mithilfe von pDRA...

<ol>
	<li>Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+combining+homologous+recombination+and+site-specific+recombination+for+targeted+mutagenesis+in+Drosophila.">A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).</li><li>Skarnes, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).</li><li>Vogel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nobel+Prizes.+A+knockout+award+in+medicine.">Nobel Prizes. A knockout award in medicine.</a> Science. 318 (5848), 178-179 (2007).</li><li>Salsman, J., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+genome+editing+in+the+CRISPR+era.">Precision genome editing in the CRISPR era.</a> Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).</li><li>Capecchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).</li><li>Van, d. W. L., Adams, D. J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+targeted+manipulation+of+the+mouse+genome.">Tools for targeted manipulation of the mouse genome.</a> Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).</li><li>Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+issues+in+mouse+genome+engineering.">Current issues in mouse genome engineering.</a> Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).</li><li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines.">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).</li><li>Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+genes+introduced+into+cultured+pluripotential+cells+by+retroviral+vector.">Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector.</a> Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).</li><li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells.">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51 (3), 503-512 (1987).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474 (7351), 337 (2011).</li><li>Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+for+all+reasons.">A mouse for all reasons.</a> Cell. 128 (1), 9-13 (2007).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Pettitt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agouti+C57BL/6N+embryonic+stem+cells+for+mouse+genetic+resources.">Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources.</a> Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).</li><li>Gertsenstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Germ+Line+Transmitting+Chimeras+from+C57BL/6N+ES+Cells+by+Aggregation+with+Outbred+Host+Embryos.">Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos.</a> PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).</li><li>Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+DNA+sequences+into+the+human+chromosomal+|[beta]|-globin+locus+by+homologous+recombination.">Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination.</a> Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).</li><li>Deng, C., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+gene+targeting+frequency+as+a+function+of+the+extent+of+homology+between+the+targeting+vector+and+the+target+locus.">Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus.</a> Molecular &amp; Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).</li><li>Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+confirmation+of+gene+targeting+in+embryonic+stem+cells+using+two+long-range+PCR+techniques.">Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques.</a> Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).</li><li>Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+detection+of+homologous+and+non-homologous+recombination+events+using+three+oligonucleotide+MLPA.">Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA.</a> Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).</li><li>G&#243;mezrodr&#237;guez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+q-PCR+as+a+method+of+screening+for+gene+targeting+in+mammalian+cells+using+conventional+and+whole+BAC-based+constructs.">Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs.</a> Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).</li><li>Kim, H. S., Smithies, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+fragment+assay+for+gene+targeting+based+on+the+polymerase+chain+reaction.">Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction.</a> Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).</li><li>Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+mutation+in+mouse+En-2+gene+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).</li><li>Ma, X., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vertebrate+nonmuscle+Myosin+II+in+development+and+human+disease.">The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease.</a> Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).</li><li>Malonek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+the+dynamics+of+cortical+blood+flow,+oxygenation,+and+volume+changes+following+sensory+stimulation.">Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).</li><li>Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+and+mutation+of+nonmuscle+myosin+heavy+chain+II-B+results+in+a+defect+in+cardiac+myocyte+cytokinesis.">Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis.</a> Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).</li><li>Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+cell+adhesion+and+the+visceral+endoderm+following+ablation+of+nonmuscle+myosin+heavy+chain+II-A+in+mice.">Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).</li><li>Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+myosin+II+isoform+and+domain+specificity+during+early+mouse+development.">Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+MYH9-related+disease:+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A.">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238 (2012).</li><li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+MYH9+locus+for+high+efficient+gene+knock-in+and+stable+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).</li><li>Saito, S., Adachi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+Development+of+Gene-Targeting+Vectors+to+Increase+the+Efficiency+of+Genetic+Modification.">Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).</li><li>Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+detection+of+homologous+and+non-homologous+recombination+events+using+three+oligonucleotide+MLPA.">Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA.</a> Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).</li><li>Martin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+ORF1+dramatically+decreases+L1+retrotransposition+and+provides+insight+into+nucleic+acid+chaperone+activity.">A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity.</a> Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).</li><li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).</li><li>Luo, Y., Bolund, L., S&#248;rensen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pig+gene+knockout+by+rAAV-mediated+homologous+recombination:+comparison+of+BRCA1+gene+knockout+efficiency+in+Yucatan+and+G&#246;ttingen+fibroblasts+with+slightly+different+target+sequences.">Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and G&#246;ttingen fibroblasts with slightly different target sequences.</a> Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).</li><li>Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+genomic+Southern+blot+probes.">Automated design of genomic Southern blot probes.</a> BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).</li><li>Zimmer, A., Gruss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+chimaeric+mice+containing+embryonic+stem+(ES)+cells+carrying+a+homoeobox+Hox+1.1+allele+mutated+by+homologous+recombination.">Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination.</a> Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).</li></ol>

Derzeit können Designer Nukleasen für Genom-Bearbeitung noch nicht ES zellbasierte Gene-targeting Technologie aufgrund ihrer Probleme von Ziel-Effekten und Schwierigkeiten beim Einfügen einer langen DNA-Fragment30,31ersetzen. Dieser Bericht enthält als die goldenen Methoden zur Identifizierung von HR Ereignisse in Maus-ES-Zellen, ein detailliertes Protokoll der Southern blotting und PCR für das Feld. Wir validiert die Zuverlässigkeit dieser Methoden durch d...

Die Technologie der Gene targeting-HR in murinen embryonaler Stammzellen ist ein leistungsstarkes Tool für sezieren die zellulären Folgen von bestimmten Genmutationen1,2. Die Bedeutung und die Bedeutung dieser Technologie spiegeln sich in der Anerkennung von 2007 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin3,4; Unterdessen stellt es das Aufkommen der modernen Ära von gen-engineering-5. Gene targeting durch HR kann genutzt werden, um praktisch jede Änderung von Punktmutationen bis hin zu großen chromosomale Rearrangements im Genom der Maus ES Zellen6,7-Ingenieur. Es ist bekannt, dass vor der Entstehung der sogenannten Genome editing-Tools, die Generation von einer gen-Knockout-Maus die Anwendung der Gene-targeting Technologie ES Zellen8,9,10erforderlich. In den vergangenen zwei Jahrzehnten wurden mehr als 5.000 gen gezielt Mäuse durch diesen Ansatz für die Modellierung menschlicher Erkrankungen oder studieren gen Funktionen11produziert. Eine genomweite Ko Anstrengung hat sich etabliert für die Verteilung von gen-targeting Vektoren, gezielte ES Zellklonen und live Mäuse an die wissenschaftliche Gemeinschaft2,12,13,14 , 15. zweifellos, ES zellbasierte HR-mediated Gene-targeting-Technologie hat stark erweiterte unser Verständnis der Funktionen von Genen in physiologische oder pathologische Kontext gespielt.
Weil HR ist eine relativ seltene Ereignis in Säugetier-Zellen16,17, die wichtig und nächster Schritt nach soll gen gezielt in murinen Embryonische Stammzellen zahlreiche ES Kolonien zur Identifizierung von ein paar Klone mit Mutationen aus analysieren Mit dem targeting Vektor-18Std. Die gold Methoden zur Identifizierung von HR-Veranstaltungen gehören südliche beflecken und PCR19,20. Die Vorteile der Ansätze beinhalten, dass Southern blotting richtig gezielte ES-Klone zu identifizieren und erlaubt es den Forschern, die Struktur der gen ausgerichtete Veranstaltung, wie eine Überprüfung der eine einzelne Kopie Einfügung des Konstrukts, analysieren während einer PCR-basierte Strategie ermöglicht eine schnellere Screening für HR Veranstaltungen21,22. Obwohl diese Methoden Nachteile, wie z. B. haben, dass sie sind zeitaufwendig und können Fehlalarme, die kombinatorische Nutzung von ihnen ist weithin akzeptiert und angewendet, indem die meisten Labore bei der Identifizierung von HR-Veranstaltungen, insbesondere in ES-Zellen für Erzeugung genetisch geändert Tiere.
Drei Isoformen von Nonmuscle Myosin II (NM II) bei Säugetieren, jeweils bestehend aus zwei identischen NMHC IIs die durch drei verschiedene Gene (benannte Myh9, Myh10 und Myh14) und zwei Paare von Lichterketten, kodiert sind gekennzeichnet als NM II A, II B und II-C23. Frühere Studien haben gezeigt, dass mindestens der Isoformen von NM II A und II B sind wesentlich für Maus Entwicklung, da die in Vivo -Ablation von diese Isoformen embryonalen Tödlichkeit24,25,26führt. Um dieses Problem zu umgehen und erhalten neue Einblicke in die Isoform-spezifischen Funktionen der NM II A und II B in den späteren Stadien der Maus Entwicklung, ein genetischer Austausch war ES zellbasierte HR-mediated Gene-targeting Technologie, Strategie erzeugen Sie eine Reihe von Maus Modelle27. Im Zuge der Ermittlung der gewünschten ES-Klone, Southern blotting und PCR-Methoden wurden eingesetzt, und diese erwies sich als effiziente und zuverlässige27,28.
Dieses Papier soll eine detaillierte Beschreibung der südlichen Beflecken und PCR, einschließlich der Gestaltung von targeting, Vector(s), Wortanzahl, und Primer und die Durchführung von Experimenten sowie die Analyse der Ergebnisse durch die Identifizierung von HR-Ereignis veranschaulicht Vorkommen in ES-Zellen für die Erstellung von genetischen Austausch NM II Maus Modelle und repräsentative Daten. Die Protokolle der beiden hier vorgestellten Methoden können auch für die Ermittlung der Genotypen von genetisch veränderten Zellen oder Tieren angenommen werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:903px;" width="903">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">BAC CLONE</td>
			<td style="width:232px;">BACPAC Resources Center (BPRC)</td>
			<td style="width:113px;">bMQ-330E21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN Large-Construct Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right">12462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:232px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:113px;">600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">T-easy vector</td>
			<td style="width:232px;">Promega</td>
			<td style="width:113px;">A1360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:391px;">Nuclei Lysis Solution</td>
			<td style="width:232px;">Promega</td>
			<td style="width:113px;">A7941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Precipitation Solution</td>
			<td style="width:232px;">Promega</td>
			<td>A7951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Denaturing Solution</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td>351-013-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Neutralizing Solution</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td>351-014-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP)</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td>27-9240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">UltraPure SSC, 20X</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">15557036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">15593031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">G418</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Salmon Sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">11304029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Not I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Dra I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">EcoR I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ganciclovir</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">G2536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman&#160;TurboBlotter Transfer System, Large Kits</td>
			<td style="width:232px;">Fisher Scientific</td>
			<td>09-301-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">[&#945;32P]dCTP</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEG013H100UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">ProbeQuan G-50 Micro Columns</td>
			<td style="width:232px;">GE Healthcare</td>
			<td>28-9034-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hybrisol I Hybridization Solution</td>
			<td style="width:232px;">Millipore</td>
			<td style="width:113px;">S4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodak X-Ray Film</td>
			<td>Z&#38;Z Medical</td>
			<td>844 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of homologous recombination events in mouse embryonic stem cells using southern blotting and polymerase chain reaction

Im Verhältnis zu den Fragen der Ziel-Effekte und die Schwierigkeit des Einsetzens einer langen DNA-Fragment in der Anwendung von Designer Nukleasen für Genom Bearbeitung, embryonale Stammzellen (ES) Zell-basierte gen-targeting Technologie verfügt nicht über diese Mängel und ist weithin verwendet, um Tier/Maus Genom von großen Deletionen/Insertionen bis hin zu Einzel-Nukleotid-Substitutionen ändern. Vor allem gewünscht Identifizierung von relativ wenigen homologe Rekombination (HR) Veranstaltungen notwendig ES-Klone ist ein wichtiger Schritt, der genaue und zuverlässige Methoden verlangt. Südliche beflecken und/oder konventionellen PCR werden häufig für diesen Zweck genutzt. Hier beschreiben wir die Modalitäten der Verwendung dieser beiden Verfahren HR Ereignisse zu identifizieren, die in ES-Zellen aufgetreten in denen endogene Myh9 gen gestört und durch cDNAs Codierung andere Nonmuscle Myosin schwere Kette IIs (NMHC IIs) ersetzt werden soll. Das gesamte Verfahren der Southern blotting umfasst den Bau von Vector(s), Elektroporation, Droge-Auswahl, Ausbau und Lagerung von ES-Zellen/Klone, die Vorbereitung, Verdauung-targeting und Beflecken der genomic DNA (gDNA), die Hybridisierung und Waschen der Wortanzahl und letzten Schritt der Autoradiographie auf die x-ray-Filme. PCR kann direkt mit vorbereitet und verdünnte gDNA durchgeführt werden. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, sollten die Sonden und Restriktionsenzym (Re-) schneiden Websites für das südliche beflecken und die Primer für PCR sorgfältig geplant werden. Obwohl die Ausführung von Southern blotting ist zeitaufwendig und arbeitsintensiv und PCR-Ergebnisse sind Fehlalarme, die korrekte Identifizierung von Southern blotting und die schnelle Screening mittels PCR erlauben die alleinige oder kombinierte Anwendung dieser Methoden beschrieben in diesem Papier auf allgemein verwendet und Anhörung durch die meisten Labore bei der Identifizierung von Genotypen von ES-Zellen und genetisch veränderter Tiere.

In diesem Papier wird ein detailliertes Protokoll der Southern blotting und PCR beschrieben, die genutzt wird, HR Ereignisse zu identifizieren, die in ES-Zellen für die Erzeugung von NM II genetischen Austausch Mausmodelle, verwenden ES Zellen-basierten HR-vermittelten targeting-Technologie aufgetreten. Obwohl Southern blotting PCR, sowie traditionelle Gene-targeting-Technologie seit mehreren Jahrzehnten verbreitet haben, muss die erfolgreiche Anwendung von ihnen sorgfältig geplant werd...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern blotting und/oder PCR. Diese Methode ist durch die Generierung von Nonmuscle Myosin II genetische Ersatz Mausmodellen mit traditionellen embryonalen Stammzell-basierte homologe Rekombination-vermittelten targeting-Technologie veranschaulicht.

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im molekularen und zellulären Bereich zu beantworten, wie z. B. die Identifizierung homologe Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie genau, zuverlässig und weit verbreitet ist. Diese Methode kann also Einblicke in die Identifizierung homologer Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus geben.Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie genetisch veränderte Zellen oder Tiere. Im Allgemeinen wird einzelne neue dieser Methode kämpfen, weil es lange dauert und mehrere Schritte umfasst. Mischen Sie für jede gDNA 30 Mikroliter 10 x Puffer für DRA eins, drei Mikroliter DRA eins und 10 Mikrogramm gDNAs pro Probe.Fügen Sie Wasser hinzu, bis das endgültige Volumen 30 Mikroliter beträgt, und brüten Sie bei 37 Grad Celsius über Nacht, um die gDNAs zu verdauen. Bereiten Sie ein 1%Agarose Elektrophorese Gel mit Ethidiumbromid. Laden Sie die zuvor erworbenen Proben zusammen mit einer KB-Leiter auf das Gel und führen Sie es mit 30 bis 40 Volt über Nacht.Am nächsten Tag das Gel in einem Tablett mit einer 0,2 Newton Salzsäurelösung einweichen. Verwenden Sie einen Shaker, um das Tablett bei Raumtemperatur 20 Minuten lang sanft zu schütteln. Übertragen Sie das Gel in ein Tablett, das eine DNA-Denaturierungslösung enthält.Schütteln Sie es vorsichtig für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Dann das Gel in ein Tablett mit einer DNA-Neutralisationslösung geben. Und schütteln Sie es vorsichtig für 20 Minuten bei Raumtemperatur.Übertragen Sie die DNAs mit einem schnellen Abwärtsübertragungssystem vom Gel auf die Membran. Als nächstes montieren Sie den Turble Blotter und Blotting Stack, wie in den Anweisungen des Herstellers angegeben. Danach nehmen Sie die Membran heraus und waschen Sie sie mit zwei X-Saline-Natriumcitrat für eine Minute.Absorbieren Sie die Flüssigkeit mit Geweben, und verwenden Sie dann einen UV-Verklinker, um die DNA mit der Membran zu vernetzen. Um mit der Kennzeichnung der DNA-Sonden mit Radioaktivität zu beginnen, fügen Sie die wärmedenaturierte Sonde DNAs in die Röhre ein, die die gebrauchsfertigen DNA-Etikettierungsperlen enthält. Pipette nach oben und unten zu mischen.Und fügen Sie fünf Mikroliter radioaktiv beschriftetes Desoxycytintriphosphat hinzu. Bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren. Reinigen Sie die beschrifteten Sonden mit G 50 Mikrosäulen gemäß den Anweisungen des Herstellers.Verwenden Sie einen Szintillationszähler, um die Radioaktivität zu messen. Um mit der Hybridisierung der Membranen mit den beschrifteten Sonden zu beginnen, legen Sie die Membran in das Hybridisierungsrohr. Fügen Sie die gemischte Vorhybridisierungslösung hinzu.Die Röhre in den Hybridisierungsofen geben und die Vorhybridisierung bei 42 Grad Celsius 30 Minuten lang verlaufen lassen. Dann entfernen Sie das Rohr aus dem Ofen und gießen Sie die Vorhybridisierungslösung in ein 50-Milliliter-Rohr. Fügen Sie die denaturierte Sonde hinzu, und mischen Sie sie vorsichtig.Um die nicht hybridisierten Sonden zu entfernen, legen Sie die Membran in eine Schale mit einem X-Saline-Natriumcitrat mit 0,1% SDS und schütteln Sie 10 Minuten lang sanft bei 55 bis 60 Grad Celsius. Danach die Membran mit Plastikfolie umwickeln und in der Belichtungskassette fixieren. In einem dunklen Raum, setzen Sie die Membran zwei Blatt Röntgenfilm.Entwickeln Sie den Film, um die Ergebnisse zu visualisieren. Bestimmen Sie, ob ein entsprechender ES-Klon der gewünschte mit dem Ziel der Rekombination ist oder nicht, entsprechend den Größen der DNA-Bänder, die von den Sonden erkannt werden. In dieser Studie werden Southern Blotting und PCR verwendet, um HR-Ereignisse zu identifizieren, die in Maus-ES-Zellen für die Erzeugung von NM zwei genetische Ersatzmausmodelle mit ES-Zellen-basierte HR-vermittelte Targeting-Technologie auftreten.Da die genomischen DNAs in viele Fragmente mit unterschiedlichen Längen geschnitten sind, zeigen sie einen abstrichähnlichen Status auf dem DNA-Gel an. Dies deutet auf eine vollständige Verdauung der genomischen DNAs hin. Als letzten Schritt der südlichen Blotting werden die Signale einer Radioaktivität sonden bezeichnet, die mit einem Ziel-DNA-Fragment hybridisiert wird.Das Auftreten erwarteter Bänder spiegelt das Auftreten von HR-Ereignissen in den ES-Klonen wider. Nach dem Vorentwurf in der Studie haben ES-Klone mit mutiertem Allel zwei unterschiedliche Größenbänder. Während Wild-Typ ES-Klone nur ein Band haben, was darauf hindeutet, dass die gewünschten ES-Klone heterozygot sind.Nach der PCR-Reaktion können die PCR-Produkte auf dem DNA-Gel analysiert werden. Wenn ein bestimmtes NPCR-Band der richtigen Größe beobachtet wird, deutet dies auf das Auftreten von HR-Ereignissen hin, die durch Sequenzierung dieses PCR-Bandes weiter bestätigt werden können. Die Implikation dieser Technik erstreckte sich auf die Therapie der Identifizierung der Punktmutation, da die Grundlage identisch ist.Beim Versuch dieses Verfahrens ist wichtig, daran zu denken, geduldig und vorsichtig zu sein. Nach diesem Verfahren kann eine andere Methode wie die Mikroinjektion von ES-Zellen in Blastozysten durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die Bildung von chimarischen Tieren zu beantworten. Diese Technik ebnete dem Forscher auf seinem Gebiet der Molekular- und Zellbiologie den Weg, um die Funktion eines bestimmten Gens oder die Folge eines mutierten Gens bei Mäusen oder darüber hinaus zu erforschen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit dem Radioaktivitätsetikettierer P32 DCTB extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Abschirmung mit Schutzplatine immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Studying DNA and RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP Genotypisierung von Toxic Kugelfisch durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Forschung

Genetik

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Kultivierung und Manipulation von Zellen der Neuralleiste O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Bewertung einer universellen, veralteten Transcription Polymerase Chain Reaction zur Erkennung von Lyssaviren

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Künstliche RNA-Polymerase II-Dehnungskomplexe zur Sezieren von co-transkriptionellen RNA-Verarbeitungsereignissen

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Ein robuster Polymerase-Kettenreaktions-basierter Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen in fragilen X Mental Retardation-1 Gen

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...