Name: identification of homologous recombination events in mouse embryonic stem cells using southern blotting and polymerase chain reaction
Uploaded: 2018-11-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Dette arbeidet fikk støtte fra General programmet av National Natural Science Foundation i Kina (tilskudd nr. 31571432), den menneskelige provinsielle Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 2015JC3097) og den Research Foundation utdanning Bureau av Hunan Provinsen, Kina (Grant No. 15 K 054).

1. prosjektert rettet mot Construct(s), sonder for sørlige Blot og primere for PCR
<ol><li>Velg den første koding ekson (ekson 2) av Myh9 genet for avbrudd eller innsettingspunktet i programmet i knockout/knock-i rapporterte her.</li>
	<li>Hente de 5-kb oppstrøms og 5 kb nedstrøms DNA-sekvensene rundt Myh9 ekson 2 fra genome.ucsc.edu nettsted.</li>
	<li>Analysere begrensning fordøyelsen mønstre av enzymer (REs) med 1 – 2 kutt i denne 10-kb-regionen med pDRAW programvare for å finne egnet RE(s)...

<ol>
	<li>Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+combining+homologous+recombination+and+site-specific+recombination+for+targeted+mutagenesis+in+Drosophila.">A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).</li><li>Skarnes, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).</li><li>Vogel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nobel+Prizes.+A+knockout+award+in+medicine.">Nobel Prizes. A knockout award in medicine.</a> Science. 318 (5848), 178-179 (2007).</li><li>Salsman, J., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+genome+editing+in+the+CRISPR+era.">Precision genome editing in the CRISPR era.</a> Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).</li><li>Capecchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).</li><li>Van, d. W. L., Adams, D. J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+targeted+manipulation+of+the+mouse+genome.">Tools for targeted manipulation of the mouse genome.</a> Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).</li><li>Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+issues+in+mouse+genome+engineering.">Current issues in mouse genome engineering.</a> Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).</li><li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines.">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).</li><li>Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+genes+introduced+into+cultured+pluripotential+cells+by+retroviral+vector.">Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector.</a> Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).</li><li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells.">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51 (3), 503-512 (1987).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474 (7351), 337 (2011).</li><li>Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+for+all+reasons.">A mouse for all reasons.</a> Cell. 128 (1), 9-13 (2007).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Pettitt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agouti+C57BL/6N+embryonic+stem+cells+for+mouse+genetic+resources.">Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources.</a> Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).</li><li>Gertsenstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Germ+Line+Transmitting+Chimeras+from+C57BL/6N+ES+Cells+by+Aggregation+with+Outbred+Host+Embryos.">Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos.</a> PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).</li><li>Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+DNA+sequences+into+the+human+chromosomal+|[beta]|-globin+locus+by+homologous+recombination.">Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination.</a> Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).</li><li>Deng, C., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+gene+targeting+frequency+as+a+function+of+the+extent+of+homology+between+the+targeting+vector+and+the+target+locus.">Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus.</a> Molecular &amp; Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).</li><li>Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+confirmation+of+gene+targeting+in+embryonic+stem+cells+using+two+long-range+PCR+techniques.">Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques.</a> Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).</li><li>Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+detection+of+homologous+and+non-homologous+recombination+events+using+three+oligonucleotide+MLPA.">Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA.</a> Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).</li><li>G&#243;mezrodr&#237;guez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+q-PCR+as+a+method+of+screening+for+gene+targeting+in+mammalian+cells+using+conventional+and+whole+BAC-based+constructs.">Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs.</a> Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).</li><li>Kim, H. S., Smithies, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+fragment+assay+for+gene+targeting+based+on+the+polymerase+chain+reaction.">Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction.</a> Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).</li><li>Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+mutation+in+mouse+En-2+gene+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).</li><li>Ma, X., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vertebrate+nonmuscle+Myosin+II+in+development+and+human+disease.">The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease.</a> Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).</li><li>Malonek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+the+dynamics+of+cortical+blood+flow,+oxygenation,+and+volume+changes+following+sensory+stimulation.">Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).</li><li>Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+and+mutation+of+nonmuscle+myosin+heavy+chain+II-B+results+in+a+defect+in+cardiac+myocyte+cytokinesis.">Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis.</a> Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).</li><li>Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+cell+adhesion+and+the+visceral+endoderm+following+ablation+of+nonmuscle+myosin+heavy+chain+II-A+in+mice.">Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).</li><li>Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+myosin+II+isoform+and+domain+specificity+during+early+mouse+development.">Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+MYH9-related+disease:+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A.">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238 (2012).</li><li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+MYH9+locus+for+high+efficient+gene+knock-in+and+stable+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).</li><li>Saito, S., Adachi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+Development+of+Gene-Targeting+Vectors+to+Increase+the+Efficiency+of+Genetic+Modification.">Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).</li><li>Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+detection+of+homologous+and+non-homologous+recombination+events+using+three+oligonucleotide+MLPA.">Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA.</a> Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).</li><li>Martin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+ORF1+dramatically+decreases+L1+retrotransposition+and+provides+insight+into+nucleic+acid+chaperone+activity.">A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity.</a> Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).</li><li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).</li><li>Luo, Y., Bolund, L., S&#248;rensen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pig+gene+knockout+by+rAAV-mediated+homologous+recombination:+comparison+of+BRCA1+gene+knockout+efficiency+in+Yucatan+and+G&#246;ttingen+fibroblasts+with+slightly+different+target+sequences.">Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and G&#246;ttingen fibroblasts with slightly different target sequences.</a> Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).</li><li>Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+genomic+Southern+blot+probes.">Automated design of genomic Southern blot probes.</a> BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).</li><li>Zimmer, A., Gruss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+chimaeric+mice+containing+embryonic+stem+(ES)+cells+carrying+a+homoeobox+Hox+1.1+allele+mutated+by+homologous+recombination.">Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination.</a> Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).</li></ol>

Foreløpig erstatte designer nucleases for genomet redigering fortsatt ikke ES cellebasert genet målretting teknologi på grunn av sine problemer av off-målet effekter, og vanskeligheter med å sette inn en lang DNA fragment30,31. Som de gylne metodene for å identifisere HR hendelsene skjedde i musen ES celler, gir denne rapporten detaljert protokollen Southern blotting og PCR for feltet. Vi validert påliteligheten av disse metodene ved å analysere individue...

Teknologien av genet målretting av HR i murine ES celler inneholder et kraftig verktøy for dissekere mobilnettet konsekvensene av bestemte genetiske mutasjoner1,2. Betydningen og betydningen av denne teknologien gjenspeiles i anerkjennelsen av 2007 Nobelprisen i medisin3,4; i mellomtiden representerer ankomsten av moderne tid genet engineering5. Gene målretting gjennom HR kan benyttes for å ingeniør nesten endringer mellom punkt mutasjoner store chromosomal rearrangements i genomet mus ES celler6,7. Det er velkjent at før fremveksten av såkalte genomet redigeringsverktøy, generering av genet knockout mus kreves bruk av genet målretting teknologi i ES celler8,9,10. I løpet av de siste to tiårene, ble mer enn 5000 genet målrettede mus produsert av denne tilnærmingen for modellering menneskelige sykdommer eller studere genet funksjoner11. En genomet hele knockout innsats er opprettet for å distribuere genet målretting vektorer, målrettet ES cellen kloner og levende mus til vitenskapelige samfunnet2,12,13,14 , 15. utvilsomt ES cellebasert HR-mediert genet målretting teknologien har sterkt avansert vår forståelse av funksjonene av gener i fysiologiske eller patologisk kontekst.
Fordi HR er en relativt sjelden hendelse i pattedyr celler16,17, viktig og neste trinn etter er genet målretting i murine ES celler å analysere mange ES koloniene for å identifisere noen kloner mutasjoner som følge av HR med målretting vektor18. Gull metodene for å identifisere HR hendelser inkluderer Southern blotting og PCR19,20. Fordelene med tilnærminger inkluderer at Southern blotting kan identifisere riktig målrettet ES kloner og tillater forskere å analysere strukturen i genet målrettede eventen en verifisering av en enkelt kopi innsetting av Konstruer, mens en PCR-basert strategi tillater rask screening for HR hendelser21,22. Selv om disse metodene har ulemper, slik at de er tidkrevende og kan har falske positiver, combinational bruk av dem er vidt akseptert og brukes av de fleste laboratorier identifisere HR hendelser, særlig i ES celler for generering av genetisk endret dyr.
Tre isoformene av nonmuscle myosin II (NM II) i pattedyr, hver bestående av to identiske NMHC IIs som kodes ved tre forskjellige gener (navngitt Myh9, Myh10 og Myh14) og to par lys kjeder, kalles NM II-A II-B og II-C23. Tidligere studier har indikert at minst isoformene NM II-A og II-B er avgjørende for musen utvikling fordi den i vivo ablation av disse isoformene gir embryonale dødelighet24,25,26. Å omgå dette problemet og få ny innsikt i isoformen-spesifikke funksjonene til NM II-A og II-B i senere stadier av musen utvikling, en genetisk erstatning strategi med ES cellebasert HR-mediert genet målretting teknologi ble vedtatt å generere en rekke musen modeller27. I løpet av identifisere ønsket ES kloner, både Southern blotting og PCR metoder ble brukt, og dette viste seg for å være effektive og pålitelige27,28.
Utredningen har til hensikt å gi en detaljert beskrivelse av Southern blotting og PCR, inkludert utforming av målretting vector(s), probe(s), og grunning og gjennomføring av eksperimenter og analyse av resultater eksemplifisert ved å identifisere HR hendelse forekomst i ES celler for å opprette genetisk erstatning NM II musen modeller og representant. Protokoller av disse to metodene presenteres her kan også vedtas for å identifisere genotyper genmodifiserte celleområde eller dyr.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:903px;" width="903">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">BAC CLONE</td>
			<td style="width:232px;">BACPAC Resources Center (BPRC)</td>
			<td style="width:113px;">bMQ-330E21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN Large-Construct Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right">12462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:232px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:113px;">600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">T-easy vector</td>
			<td style="width:232px;">Promega</td>
			<td style="width:113px;">A1360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:391px;">Nuclei Lysis Solution</td>
			<td style="width:232px;">Promega</td>
			<td style="width:113px;">A7941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Precipitation Solution</td>
			<td style="width:232px;">Promega</td>
			<td>A7951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Denaturing Solution</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td>351-013-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Neutralizing Solution</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td>351-014-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP)</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td>27-9240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">UltraPure SSC, 20X</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">15557036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">15593031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">G418</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Salmon Sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">11304029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Not I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Dra I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">EcoR I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ganciclovir</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">G2536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman&#160;TurboBlotter Transfer System, Large Kits</td>
			<td style="width:232px;">Fisher Scientific</td>
			<td>09-301-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">[&#945;32P]dCTP</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEG013H100UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">ProbeQuan G-50 Micro Columns</td>
			<td style="width:232px;">GE Healthcare</td>
			<td>28-9034-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hybrisol I Hybridization Solution</td>
			<td style="width:232px;">Millipore</td>
			<td style="width:113px;">S4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodak X-Ray Film</td>
			<td>Z&#38;Z Medical</td>
			<td>844 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of homologous recombination events in mouse embryonic stem cells using southern blotting and polymerase chain reaction

Forhold til saker av off-målet effekter og vanskelighetene med å sette inn en lang DNA-fragment i anvendelsen av designer nucleases for genomet redigering, embryonic stem (ES) cellebasert genet målretting teknologi har ikke disse svakhetene og mye brukes til å endre dyr/mus genomet mellom store slettinger/innsettinger single nukleotid erstatninger. Spesielt, ønsket identifisere relativt få homologe rekombinasjon (HR) hendelsene nødvendig for å oppnå ES kloner er et viktig skritt, som krever nøyaktig og pålitelig. Southern blotting og/eller konvensjonelle PCR benyttes ofte til dette formålet. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer for å bruke disse to metodene til å identifisere HR hendelsene skjedde i musen ES celler som endogene Myh9 genet er ment å være forstyrret og erstattet av cDNAs andre nonmuscle myosin tunge kjeden IIs (NMHC IIs)-koding. Hele prosedyren for Southern blotting omfatter bygging av vector(s), electroporation, stoff utvalg, utvidelse og lagring av ES celler/kloner, forberedelse, fordøyelse og blotting genomisk DNA (gDNA), hybridization og Vask av probe(s), og en siste trinnet i autoradiography på X-ray filmer. PCR kan utføres direkte med forberedt og utvannet gDNA. For å oppnå perfekt resultat, bør sonder og begrensning enzym (RE) kutte nettsteder for Southern blotting og primere for PCR være nøye planlagt. Om gjennomføring av Southern blotting er tidkrevende og arbeidskrevende og PCR resultater har falske positiver, riktig identifikasjon av Southern blotting og rask screening av PCR tillater alene eller kombinert bruk av metodene beskrevet i denne utredningen å bli mye brukt og konsultert av de fleste laboratorier i identifikasjon av genotyper ES celler og genetisk endret dyr.

I dette papiret, er detaljert protokollen Southern blotting og PCR beskrevet, som brukes til å identifisere HR hendelsene skjedde i musen ES celler for generering av NM II genetisk erstatning musen modellene i ES celler-baserte HR-mediert targeting teknologi. Selv om Southern blotting og PCR, samt tradisjonelle genet målretting teknologi, har vært mye brukt i flere tiår, må bruk av dem planlegges nøye. Minst disse aspektene er må vurderes: lengden på lange og korte armer, posisjon...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Her presenterer vi en detaljert protokoll for å identifisere homologe rekombinasjon hendelsene skjedde i mus embryonale stamceller bruker Southern blotting og/eller PCR. Denne metoden er eksemplifisert ved generering av nonmuscle myosin II genetisk erstatning musen modeller med tradisjonelle embryonale stamcelleforskningen-baserte homologe rekombinasjon-mediert teknologi.

Identifikasjon av homologe rekombinasjon hendelser i mus embryonale stamceller Southern Blotting og polymerasekjedereaksjons

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål innen molekylær og cellulær biologi, for eksempel identifisering av homologe rekombinasjonshendelser i musembryonale stamceller. Den største fordelen med denne teknikken er at den er nøyaktig, pålitelig og mye brukt. Så, denne metoden kan gi innsikt i å identifisere homolog rekombinasjon hendelser i mus embryonale stamcelle.Det kan også brukes på andre systemer, for eksempel genmodifisert celle eller dyr. Vanligvis vil individuell ny til denne metoden slite fordi det tar lang tid og innebærer flere trinn. For hver gDNA, bland 30 mikroliter med 10 x buffer for DRA en, tre mikroliter dra ett og 10 mikrogram gDNAer per prøve.Tilsett vann til det endelige volumet er 30 mikroliter, og inkuber ved 37 grader celsius over natten for å fordøye gDNAs. Forbered en 1% agarose elektroforesegel med ethidiumbromid. Last de tidligere kjøpte prøvene sammen med en KB-stige på gelen, og kjør den på 30 til 40 volt over natten.Neste dag, suge gelen i et brett som inneholder en 0,2 newton saltsyre løsning. Bruk en shaker til å riste brettet forsiktig i 20 minutter ved romtemperatur. Overfør gelen til et brett som inneholder en DNA-denaturingsløsning.Rist den forsiktig i 20 minutter ved romtemperatur. Overfør deretter gelen til et brett som inneholder en DNA-nøytraliserende løsning. Og rist den forsiktig i 20 minutter ved romtemperatur.Ved hjelp av et raskt nedadgående overføringssystem, overfør DNAene fra gelen til membranen. Deretter monterer du turble blotter og blotting stabel som beskrevet i instruksjonene fra produsenten. Etter dette, ta ut membranen og vask den med to X saltvann natriumsitrat i ett minutt.Absorber væsken med vev, og bruk deretter en UV-krysskobling til å krysskoble DNA med membranen. For å begynne å merke DNA-sondene med radioaktivitet, legg til den varmedeaturerte sonden DNAer til røret som inneholder klar til å gå DNA merking perler. Pipetten opp og ned for å blande.Og tilsett fem mikroliter radioaktivt merket deoksycytodintrifosfat. Inkuber ved 37 grader celsius i 15 minutter. Rens de merkede sondene ved hjelp av G 50 mikrokolonner i henhold til instruksjonene fra produsenten.Bruk en scintillation teller for å måle radioaktivitet. For å begynne å hybridisere membranene med de merkede sondene, legg membranen i hybridiseringsrøret. Legg til den blandede pre hybridiseringsløsningen.Plasser røret i hybridiseringsovnen og la prehybridiseringsgraden fortsette på 42 grader celsius i 30 minutter. Deretter fjerner du røret fra ovnen og hell prehybridiseringsløsningen i et 50 ml ml. Tilsett denaturerte sonden, og bland forsiktig.For å fjerne de ikke hybridiserte sondene, legg membranen i et brett som inneholder en X saltvannsnatriumsitrat med 0,1% SDS og rist forsiktig ved 55 til 60 grader celsius i 10 minutter. Etter dette, pakk membranen med plastfolie og fest den i eksponeringskassetten. I et mørkt rom, utsett membranen til to ark med røntgenfilm.Utvikle filmen for å visualisere resultatene. Bestem om en tilsvarende ES-klone er den ønskede med mål om rekombinasjon eller ikke, i henhold til størrelsene på DNA-båndene som oppdages av sondene. I denne studien benyttes sørlige blotting og PCR for å identifisere HR-hendelser som forekommer i mus ES-celler for generering av NM to genetiske erstatningsmusmodeller ved hjelp av ES-celler basert HR mediert målrettingsteknologi.Fordi genomiske DNAer er skåret i mange fragmenter med forskjellige lengder, viser de en smørelignende status på DNA-gelen. Dette tyder på en fullstendig fordøyelse av genomiske DNAer. Som et siste trinn i den sørlige blottingen vises signalene fra en radioaktivitet merket sonde hybridisering med et mål-DNA-fragment på filmen.Utseendet til forventede bånd gjenspeiler forekomsten av HR-hendelser i ES-klonene. Ifølge predesign i studien har ES kloner med mutert allele to forskjellige størrelsesbånd. Mens vill type ES kloner bare har ett bånd, noe som tyder på at de ønskede ES kloner er heterozygous.Etter PCR-reaksjonen kan PCR-produktene analyseres på DNA-gelen. Hvis et bestemt NPCR-bånd av riktig størrelse observeres, antyder dette forekomsten av HR-hendelser som kan bekreftes ytterligere ved å sekvensere pcr-båndet. Implikasjonen av denne teknikken utvidet til terapi av å identifisere punktmutasjon fordi grunnlaget er identisk.Mens du prøver denne prosedyren er viktig å huske å være tålmodig og forsiktig. Etter denne prosedyren kan annen metode som mikroinjeksjon av ES-celle i blastocysts utføres for å svare på ytterligere spørsmål som det dannelsen av kimeriske dyr. Akter utviklingen banet denne teknikken veien for forskeren innen molekylær og cellulær biologi for å utforske funksjonen til et bestemt gen eller konsekvensen av et mutert gen hos mus eller utover.Ikke glem at det å arbeide med radioaktivitetsmerke P32 DCTB kan være ekstremt farlig, og forholdsregler som skjerming med beskyttelseskort bør alltid ta mens du utfører denne prosedyren.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Studying DNA and RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Forbedret Polymerase Chain Reaction-rflp Genotyping av Toxic Pufferfish ved væskekromatografi / massespektrometri

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi kvantitative påvisning av RNA-avhengig RNA Polymerase aktivitet av menneskelig Telomerase revers transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Svært effektiv Gene avbrudd i Murine og menneskelig blodkreft stamfar celler av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-mediert reorganisering av Chromatin Loop struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Eneste dråpe digitale polymerasekjedereaksjons omfattende og samtidige deteksjon av mutasjoner i Hotspot regioner

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein merking i menneskelig indusert Pluripotent stilk celler med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Dyrking og manipulering av O9-1 Neural Crest celler

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Evaluering av en Universal nestet omvendt transkripsjon polymerase Kjedere reaksjon for påvisning av Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Kunstig RNA polymerase II forlengelse komplekser for dissekere co-transcriptional RNA prosessering hendelser

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

En robust polymerase Kjedere reaksjon-basert analyse for kvantifisere Cytosin-Guanin-Guanin Trinucleotide gjentar i skjøre X mental retardasjon-1 Gene

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...