Name: identification of homologous recombination events in mouse embryonic stem cells using southern blotting and polymerase chain reaction
Uploaded: 2018-11-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Este trabalho recebeu o apoio do programa geral da Fundação Nacional de ciências naturais da China (subvenções no. 31571432), humano Fundação Provincial de ciências naturais da China (Grant No. 2015JC3097) e a pesquisa Fundação de educação Bureau de Hunan Província, China (Grant No. 15 K 054).

1. projeto de direcionamento Construct(s), sondas para Southern Blot e Primers para PCR
<ol><li>Selecione o primeiro exon codificação (exon 2) do gene Myh9 para interrupção ou inserção na aplicação do nocaute/TOC-no relatado aqui.</li>
	<li>Recupere as 5 kb upstream e 5 kb a jusante sequências de DNA cercam o Myh9 exon 2 do site genome.ucsc.edu .</li>
	<li>Analise padrões de digestão restrição de enzimas (REs) com 1 – 2 cortes nesta região de 10 kb usando software de pDRAW para determin...

<ol>
	<li>Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+combining+homologous+recombination+and+site-specific+recombination+for+targeted+mutagenesis+in+Drosophila.">A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).</li><li>Skarnes, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).</li><li>Vogel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nobel+Prizes.+A+knockout+award+in+medicine.">Nobel Prizes. A knockout award in medicine.</a> Science. 318 (5848), 178-179 (2007).</li><li>Salsman, J., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+genome+editing+in+the+CRISPR+era.">Precision genome editing in the CRISPR era.</a> Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).</li><li>Capecchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).</li><li>Van, d. W. L., Adams, D. J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+targeted+manipulation+of+the+mouse+genome.">Tools for targeted manipulation of the mouse genome.</a> Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).</li><li>Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+issues+in+mouse+genome+engineering.">Current issues in mouse genome engineering.</a> Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).</li><li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines.">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).</li><li>Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+genes+introduced+into+cultured+pluripotential+cells+by+retroviral+vector.">Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector.</a> Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).</li><li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells.">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51 (3), 503-512 (1987).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474 (7351), 337 (2011).</li><li>Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+for+all+reasons.">A mouse for all reasons.</a> Cell. 128 (1), 9-13 (2007).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Pettitt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agouti+C57BL/6N+embryonic+stem+cells+for+mouse+genetic+resources.">Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources.</a> Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).</li><li>Gertsenstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Germ+Line+Transmitting+Chimeras+from+C57BL/6N+ES+Cells+by+Aggregation+with+Outbred+Host+Embryos.">Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos.</a> PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).</li><li>Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+DNA+sequences+into+the+human+chromosomal+|[beta]|-globin+locus+by+homologous+recombination.">Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination.</a> Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).</li><li>Deng, C., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+gene+targeting+frequency+as+a+function+of+the+extent+of+homology+between+the+targeting+vector+and+the+target+locus.">Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus.</a> Molecular &amp; Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).</li><li>Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+confirmation+of+gene+targeting+in+embryonic+stem+cells+using+two+long-range+PCR+techniques.">Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques.</a> Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).</li><li>Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+detection+of+homologous+and+non-homologous+recombination+events+using+three+oligonucleotide+MLPA.">Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA.</a> Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).</li><li>G&#243;mezrodr&#237;guez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+q-PCR+as+a+method+of+screening+for+gene+targeting+in+mammalian+cells+using+conventional+and+whole+BAC-based+constructs.">Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs.</a> Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).</li><li>Kim, H. S., Smithies, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+fragment+assay+for+gene+targeting+based+on+the+polymerase+chain+reaction.">Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction.</a> Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).</li><li>Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+mutation+in+mouse+En-2+gene+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).</li><li>Ma, X., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vertebrate+nonmuscle+Myosin+II+in+development+and+human+disease.">The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease.</a> Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).</li><li>Malonek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+the+dynamics+of+cortical+blood+flow,+oxygenation,+and+volume+changes+following+sensory+stimulation.">Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).</li><li>Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+and+mutation+of+nonmuscle+myosin+heavy+chain+II-B+results+in+a+defect+in+cardiac+myocyte+cytokinesis.">Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis.</a> Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).</li><li>Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+cell+adhesion+and+the+visceral+endoderm+following+ablation+of+nonmuscle+myosin+heavy+chain+II-A+in+mice.">Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).</li><li>Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+myosin+II+isoform+and+domain+specificity+during+early+mouse+development.">Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+MYH9-related+disease:+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A.">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238 (2012).</li><li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+MYH9+locus+for+high+efficient+gene+knock-in+and+stable+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).</li><li>Saito, S., Adachi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+Development+of+Gene-Targeting+Vectors+to+Increase+the+Efficiency+of+Genetic+Modification.">Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).</li><li>Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+detection+of+homologous+and+non-homologous+recombination+events+using+three+oligonucleotide+MLPA.">Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA.</a> Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).</li><li>Martin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+ORF1+dramatically+decreases+L1+retrotransposition+and+provides+insight+into+nucleic+acid+chaperone+activity.">A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity.</a> Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).</li><li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).</li><li>Luo, Y., Bolund, L., S&#248;rensen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pig+gene+knockout+by+rAAV-mediated+homologous+recombination:+comparison+of+BRCA1+gene+knockout+efficiency+in+Yucatan+and+G&#246;ttingen+fibroblasts+with+slightly+different+target+sequences.">Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and G&#246;ttingen fibroblasts with slightly different target sequences.</a> Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).</li><li>Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+genomic+Southern+blot+probes.">Automated design of genomic Southern blot probes.</a> BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).</li><li>Zimmer, A., Gruss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+chimaeric+mice+containing+embryonic+stem+(ES)+cells+carrying+a+homoeobox+Hox+1.1+allele+mutated+by+homologous+recombination.">Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination.</a> Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).</li></ol>

Atualmente, desenhador nucleases para genoma edição ainda não podem substituir tecnologia gene-alvo baseada em célula ES devido a seus problemas de efeitos fora do alvo e a dificuldade em inserir uma longa DNA fragmento30,31. Como os métodos de ouro para a identificação de HR eventos que ocorreram em pilhas do rato ES, este relatório fornece um protocolo detalhado da mancha do Sul e PCR para o campo. Nós validado a confiabilidade desses métodos, analisa...

A tecnologia do gene definião HR em pilhas do ES murino fornece uma ferramenta poderosa para dissecando as celulares consequências de mutações genéticas específicas1,2. A importância e o significado desta tecnologia são refletidas no seu reconhecimento por 2007 Prêmio Nobel de Fisiologia ou medicina de3,4; Enquanto isso, ele representa o advento da era moderna da engenharia do gene5. Gene-alvo através de HR pode ser utilizado para engenheiro praticamente qualquer alteração desde mutações pontuais até grandes rearranjos cromossômicos no genoma do rato ES células6,7. É sabido que, antes do surgimento das ferramentas de edição chamada genoma, a geração de um rato de nocaute do gene necessário a aplicação da tecnologia de gene-alvo no ES células8,9,10. Durante as últimas duas décadas, mais de 5.000 ratos gene-alvo foram produzidos por esta abordagem para a modelagem de doenças humanas ou estudar o gene funções11. Estabeleceu-se um esforço de todo o genoma nocaute para a distribuição de vetores do gene-alvo, alvo clones de células ES e ratos ao vivo para a comunidade científica2,12,13,14 , 15. sem dúvida, ES baseada em célula mediada por HR gene-alvo tecnologia avançou grandemente nossa compreensão das funções dos genes, jogados num contexto fisiológico ou patológico.
Porque o HR é um evento relativamente pouco frequente em mamíferos células16,17, o importante e o próximo passo a seguir direcionamento de gene em células de ES murino é analisar inúmeras colônias de ES para identificar alguns clones com mutações resultantes HR com o direcionamento de vetor18. Os métodos de ouro para a identificação de eventos HR incluem mancha do Sul e PCR19,20. As vantagens das abordagens incluem que mancha do Sul pode identificar corretamente direcionados ES clones e permite que os pesquisadores analisar a estrutura do evento gene-alvo, tais como a verificação de uma inserção de cópia única de construção, enquanto um Estratégia baseado em PCR permite mais rápida triagem para HR eventos21,22. Embora esses métodos têm desvantagens, tais como que eles são demorados e podem ter falsos positivos, o uso combinacional deles é amplamente aceites e aplicados pela maioria dos laboratórios em identificar eventos HR, particular em pilhas do ES, para gerar geneticamente modificado animais.
Três isoformas de miosina nonmuscle II (NM II) nos mamíferos, cada um composto por dois IIs NMHC idênticos que são codificadas por genes diferentes três (nomeado Myh9, Myh10 e Myh14) e dois pares de cadeias leves, são referidas como NM II-A, II-B e II-C23. Estudos anteriores indicaram que pelo menos as isoformas de NM II-A e II-B são essenciais para o desenvolvimento do mouse porque a ablação na vivo dessas isoformas resulta em embrionárias letalidade24,25,26. Para contornar este problema e obter novos insights sobre as funções específicas do isoform de NM II-A e II-B em fases posteriores do desenvolvimento do mouse, uma substituição genética foi adoptada a estratégia usando ES baseada em célula mediada por HR gene-alvo tecnologia para gere uma série de modelos de rato27. No curso de identificação de clones ES desejados, mancha do Sul e métodos PCR foram utilizados, e estas provaram para ser eficiente e confiável27,28.
Este trabalho pretende fornecer uma descrição detalhada do Sul da mancha e PCR, incluindo o projeto de segmentação vector(s) ição e as primeiras demão e a execução de experiências, bem como a análise dos resultados, exemplificado através da identificação de evento HR ocorrência em pilhas do ES para a criação do mouse NM II de substituição genética de modelos e dados representativos. Os protocolos destes dois métodos aqui apresentados também podem ser adoptados para identificar os genótipos de células geneticamente modificadas ou de animais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:903px;" width="903">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">BAC CLONE</td>
			<td style="width:232px;">BACPAC Resources Center (BPRC)</td>
			<td style="width:113px;">bMQ-330E21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN Large-Construct Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right">12462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:232px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:113px;">600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">T-easy vector</td>
			<td style="width:232px;">Promega</td>
			<td style="width:113px;">A1360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:391px;">Nuclei Lysis Solution</td>
			<td style="width:232px;">Promega</td>
			<td style="width:113px;">A7941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Precipitation Solution</td>
			<td style="width:232px;">Promega</td>
			<td>A7951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Denaturing Solution</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td>351-013-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Neutralizing Solution</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td>351-014-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP)</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td>27-9240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">UltraPure SSC, 20X</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">15557036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">15593031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">G418</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Salmon Sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">11304029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Not I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Dra I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">EcoR I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ganciclovir</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">G2536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman&#160;TurboBlotter Transfer System, Large Kits</td>
			<td style="width:232px;">Fisher Scientific</td>
			<td>09-301-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">[&#945;32P]dCTP</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEG013H100UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">ProbeQuan G-50 Micro Columns</td>
			<td style="width:232px;">GE Healthcare</td>
			<td>28-9034-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hybrisol I Hybridization Solution</td>
			<td style="width:232px;">Millipore</td>
			<td style="width:113px;">S4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodak X-Ray Film</td>
			<td>Z&#38;Z Medical</td>
			<td>844 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of homologous recombination events in mouse embryonic stem cells using southern blotting and polymerase chain reaction

Relativo a questões dos efeitos fora do alvo e a dificuldade de inserção de um fragmento de DNA a longa na aplicação do desenhador nucleases para tronco embrionárias, edição de genoma tecnologia de gene-alvo baseada em célula (ES) não tem estas deficiências e é amplamente usado para modificar o genoma do animal/rato que vão desde grandes exclusões/inserções para substituições de nucleotídeo único. Notavelmente, identificar os relativamente poucos eventos de recombinação homóloga (HR) necessários para obter desejado ES clones é um passo fundamental, que exige métodos precisos e confiáveis. Mancha do Sul e/ou PCR convencional é frequentemente utilizado para esta finalidade. Aqui, descrevemos os procedimentos detalhados de usar esses dois métodos para identificar o HR eventos que ocorreram em pilhas do ES do rato em que o gene Myh9 endógeno destina-se a ser interrompido e substituído por cDNAs codificação outras cadeias pesadas de miosina nonmuscle do IIs (IIs NMHC). Todo o processo de mancha do Sul inclui a construção de direcionamento vector(s), eletroporação, seleção de drogas, a expansão e armazenamento de células de ES/clones, a preparação, digestão e mancha de DNA genômico (gDNA), a hibridização e lavagem de ição e uma etapa final de autoradiografia sobre os filmes de raio-x. PCR pode ser realizado diretamente com gDNA preparado e diluído. Para obter resultados ideais, as sondas e a enzima de restrição (RE) sites de corte para a mancha do Sul e os primers para PCR devem ser cuidadosamente planejadas. Embora a execução de mancha do Sul é demorada e trabalhosa e resultados PCR tem falsos positivos, a correta identificação pela mancha do Sul e a triagem rápida pelo PCR permite que o aplicativo único ou combinado desses métodos descritos Neste trabalho a ser amplamente utilizado e consultado pela maioria dos laboratórios na identificação de genótipos de pilhas do ES e geneticamente modificado animais.

Neste trabalho, um protocolo detalhado da mancha do Sul e do PCR é descrito, que é utilizado para identificar o HR eventos que ocorreram em pilhas do ES do rato para a geração de modelos de rato de substituição genética II NM, usando ES baseados em células mediada por HR segmentação tecnologia. Embora a mancha do Sul e PCR, bem como tecnologia de gene-alvo tradicional, têm sido amplamente utilizada por várias décadas, o sucesso da aplicação deles precisa ser cuidadosamente ...

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Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para identificar os eventos de recombinação homóloga que ocorreram em células-tronco embrionárias do mouse usando a mancha do Sul e/ou PCR. Este método é exemplificado pela geração de nonmuscle myosin II substituição genética rato modelos usando embrionária baseada em células-tronco homóloga mediada por recombinação segmentação tecnologia tradicional.

Identificação de eventos de recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo usando Southern Blotting e reação em cadeia da polimerase

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia molecular e celular, como identificar eventos de recombinação homólogos em células-tronco embrionárias de camundongos. A principal vantagem desta técnica é que ela é precisa, confiável e amplamente utilizada. Assim, este método pode fornecer informações sobre a identificação de eventos de recombinação homólogos em célula-tronco embrionária do rato.Também pode ser aplicado a outros sistemas, como células geneticamente modificadas ou animais. Geralmente, o novo indivíduo neste método vai lutar porque leva muito tempo e envolve múltiplos passos. Para cada gDNA, misture 30 microlitadores de 10 x buffer para DRA um, três microliters de DRA um e 10 microgramas de gDNAs por amostra.Adicione água até que o volume final seja de 30 microlitadores, e incubar a 37 graus celsius durante a noite para digerir os gDNAs. Prepare um gel de eletroforese de 1%agarose com brometo de ethidium. Carregue as amostras adquiridas anteriormente junto com uma escada KB de um KB no gel, e execute-as a 30 a 40 volts durante a noite.No dia seguinte, mergulhe o gel em uma bandeja contendo uma solução de ácido clorídrico newton 0,2. Use um agitador para agitar a bandeja suavemente por 20 minutos em temperatura ambiente. Transfira o gel para uma bandeja contendo uma solução de desnaturação de DNA.Agite suavemente por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira o gel para uma bandeja contendo uma solução de neutralização de DNA. E agite suavemente por 20 minutos em temperatura ambiente.Usando um sistema de transferência descendente rápido, transfira os DNAs do gel para a membrana. Em seguida, monte a mancha turva e a pilha de manchas, conforme descrito nas instruções fornecidas pelo fabricante. Depois disso, tire a membrana e lave-a com duas citratos de sódio salino X por um minuto.Absorva o líquido com tecidos, e então use um crosslinker UV para cruzar o DNA com a membrana. Para começar a rotular as sondas de DNA com radioatividade, adicione o calor desnaturado DNAs sonda ao tubo contendo as contas prontas para a rotulagem de DNA. Pipeta para cima e para baixo para misturar.E adicione cinco microliters de triphosfato de deoxicytodine radioativamente rotulado. Incubar a 37 graus celsius por 15 minutos. Purifique os testes rotulados usando colunas G 50 micro de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.Use um contador de cintilação para medir a radioatividade. Para começar a hibridizar as membranas com as sondas rotuladas, coloque a membrana no tubo de hibridização. Adicione a solução mista de pré-hibridização.Coloque o tubo no forno de hibridização e deixe a pré-hibridização prosseguir a 42 graus celsius por 30 minutos. Em seguida, retire o tubo do forno e despeje a solução de pré-hibridização em um tubo de 50 mililitros. Adicione a sonda desnaturada e misture delicadamente.Para remover as sondas não hibridizadas, coloque a membrana em uma bandeja contendo uma citrato de sódio salino X com SDS de 0,1% e agite suavemente a 55 a 60 graus celsius por 10 minutos. Depois disso, enrole a membrana com plástico e fixe-a no de exposição. Em uma sala escura, exponha a membrana a duas folhas de filme de raio-X.Desenvolva o filme para visualizar os resultados. Determine se um clone ES correspondente é o desejado com o alvo de recombinação ou não, de acordo com os tamanhos das bandas de DNA detectadas pelas sondas. Neste estudo, a mancha do sul e o PCR são utilizados para identificar eventos de RH que ocorrem em células ES de camundongos para a geração de NM dois modelos de camundongos de substituição genética usando a tecnologia de segmentação mediada por RH baseado em células ES.Como os DNAs genômicos são cortados em muitos fragmentos com diferentes comprimentos, eles exibem uma mancha como status no gel de DNA. Isso sugere uma digestão completa dos DNAs genômicos. Como um passo final de mancha sul, os sinais de uma sonda rotulada por radioatividade hibridização com um fragmento de DNA alvo são mostrados no filme.O aparecimento de bandas esperadas reflete a ocorrência de eventos de RH nos clones do ES. De acordo com o pré-sinal do estudo, os clones ES com alelo mutado têm duas faixas de tamanho distintas. Enquanto os clones do tipo selvagem ES têm apenas uma banda, sugerindo que os clones ES desejados são heterozigosos.Após a reação do PCR, os produtos PCR podem ser analisados no gel de DNA. Se uma banda NPCR específica do tamanho correto for observada, isso sugere a ocorrência de eventos de RH que podem ser confirmados ainda mais pelo sequenciamento dessa banda PCR. A implicação dessa técnica se estendeu à terapia de identificação de mutação de ponto porque a fundação é idêntica.Ao tentar este procedimento é importante lembrar de ser paciente e cuidadoso. Após esse procedimento, outro método como a microinjeção de células ES em blastocistos pode ser realizado a fim de responder a perguntas adicionais como a formação de animais quiméricos. Ao alto de seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para o pesquisador em seu campo de biologia molecular e celular explorar a função de um gene específico ou a consequência de um gene mutante em camundongos ou além.Não se esqueça que trabalhar com o etiquetador de radioatividade P32 DCTB pode ser extremamente perigoso e precauções como blindagem com placa de proteção devem estar sempre tomando durante a realização deste procedimento.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Studying DNA and RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Melhoria Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Genotipagem de Pufferfish Tóxico por Cromatografia Líquida / Espectrometria de Massa

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Genética

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganização da estrutura de Loop de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Reação em Cadeia da Polimerase Digital de Gota Única para Detecção Abrangente e Simultânea de Mutações em Regiões de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Cultivo e manipulação das células da crista Neural de O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Avaliação de uma reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa universal aninhada para a detecção de lissavírus

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Complexos artificiais de alongamento de RNA polimerase II para dissecar eventos co-transcricionais do processamento de RNA

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Um ensaio robusto baseado em reação em cadeia da polimerase para quantificar repetições de trinucleotídeo de citosina-guanina-guanina em X frágil retardo mental-1 gene

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...