Name: identification of homologous recombination events in mouse embryonic stem cells using southern blotting and polymerase chain reaction
Uploaded: 2018-11-20T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Detta arbete fick stöd från programmet allmänna National Natural Science Foundation Kina (bidrag nr 31571432), den mänskliga provinsiella naturvetenskap Foundation i Kina (Grant No. 2015JC3097) och den forskning stiftelsen av utbildning presidiet i Hunan Provinsen, Kina (Grant nr 15 K 054).

1. design av inriktning Construct(s), prober för Southern Blot och Primers för PCR
<ol><li>Välj den första kodning exon (exon 2) av den Myh9 genen för störningar eller införande i tillämpningen av knockout/inpressning redovisas här.</li>
	<li>Hämta 5-kb uppströms och 5-kb nedströms DNA sekvenser kring den Myh9 exon 2 från webbplatsen genome.ucsc.edu .</li>
	<li>Analysera begränsning matsmältningen mönster av enzymer (REs) med 1 – 2 nedskärningar i denna 10-kb region med pDRAW program...

<ol>
	<li>Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+combining+homologous+recombination+and+site-specific+recombination+for+targeted+mutagenesis+in+Drosophila.">A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).</li><li>Skarnes, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).</li><li>Vogel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nobel+Prizes.+A+knockout+award+in+medicine.">Nobel Prizes. A knockout award in medicine.</a> Science. 318 (5848), 178-179 (2007).</li><li>Salsman, J., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+genome+editing+in+the+CRISPR+era.">Precision genome editing in the CRISPR era.</a> Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).</li><li>Capecchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).</li><li>Van, d. W. L., Adams, D. J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+targeted+manipulation+of+the+mouse+genome.">Tools for targeted manipulation of the mouse genome.</a> Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).</li><li>Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+issues+in+mouse+genome+engineering.">Current issues in mouse genome engineering.</a> Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).</li><li>Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+germ-line+chimaeras+from+embryo-derived+teratocarcinoma+cell+lines.">Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines.</a> Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).</li><li>Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+genes+introduced+into+cultured+pluripotential+cells+by+retroviral+vector.">Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector.</a> Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).</li><li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells.">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51 (3), 503-512 (1987).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditional+knockout+resource+for+the+genome-wide+study+of+mouse+gene+function.">A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.</a> Nature. 474 (7351), 337 (2011).</li><li>Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+for+all+reasons.">A mouse for all reasons.</a> Cell. 128 (1), 9-13 (2007).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Pettitt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agouti+C57BL/6N+embryonic+stem+cells+for+mouse+genetic+resources.">Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources.</a> Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).</li><li>Gertsenstein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Germ+Line+Transmitting+Chimeras+from+C57BL/6N+ES+Cells+by+Aggregation+with+Outbred+Host+Embryos.">Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos.</a> PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).</li><li>Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertion+of+DNA+sequences+into+the+human+chromosomal+|[beta]|-globin+locus+by+homologous+recombination.">Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination.</a> Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).</li><li>Deng, C., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reexamination+of+gene+targeting+frequency+as+a+function+of+the+extent+of+homology+between+the+targeting+vector+and+the+target+locus.">Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus.</a> Molecular &amp; Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).</li><li>Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+confirmation+of+gene+targeting+in+embryonic+stem+cells+using+two+long-range+PCR+techniques.">Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques.</a> Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).</li><li>Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+detection+of+homologous+and+non-homologous+recombination+events+using+three+oligonucleotide+MLPA.">Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA.</a> Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).</li><li>G&#243;mezrodr&#237;guez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+q-PCR+as+a+method+of+screening+for+gene+targeting+in+mammalian+cells+using+conventional+and+whole+BAC-based+constructs.">Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs.</a> Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).</li><li>Kim, H. S., Smithies, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+fragment+assay+for+gene+targeting+based+on+the+polymerase+chain+reaction.">Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction.</a> Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).</li><li>Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+mutation+in+mouse+En-2+gene+by+homologous+recombination+in+embryonic+stem+cells.">Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells.</a> Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).</li><li>Ma, X., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+vertebrate+nonmuscle+Myosin+II+in+development+and+human+disease.">The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease.</a> Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).</li><li>Malonek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+the+dynamics+of+cortical+blood+flow,+oxygenation,+and+volume+changes+following+sensory+stimulation.">Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).</li><li>Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+and+mutation+of+nonmuscle+myosin+heavy+chain+II-B+results+in+a+defect+in+cardiac+myocyte+cytokinesis.">Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis.</a> Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).</li><li>Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defects+in+cell+adhesion+and+the+visceral+endoderm+following+ablation+of+nonmuscle+myosin+heavy+chain+II-A+in+mice.">Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).</li><li>Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonmuscle+myosin+II+isoform+and+domain+specificity+during+early+mouse+development.">Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+MYH9-related+disease:+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A.">Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119 (1), 238 (2012).</li><li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+MYH9+locus+for+high+efficient+gene+knock-in+and+stable+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells.">Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).</li><li>Saito, S., Adachi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+Development+of+Gene-Targeting+Vectors+to+Increase+the+Efficiency+of+Genetic+Modification.">Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification.</a> Biological &amp; Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).</li><li>Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+detection+of+homologous+and+non-homologous+recombination+events+using+three+oligonucleotide+MLPA.">Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA.</a> Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).</li><li>Martin, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+amino+acid+substitution+in+ORF1+dramatically+decreases+L1+retrotransposition+and+provides+insight+into+nucleic+acid+chaperone+activity.">A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity.</a> Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).</li><li>Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+determining+the+efficiency+of+gene+targeting+in+the+moss+Physcomitrella+patens.">Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens.</a> Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).</li><li>Luo, Y., Bolund, L., S&#248;rensen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pig+gene+knockout+by+rAAV-mediated+homologous+recombination:+comparison+of+BRCA1+gene+knockout+efficiency+in+Yucatan+and+G&#246;ttingen+fibroblasts+with+slightly+different+target+sequences.">Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and G&#246;ttingen fibroblasts with slightly different target sequences.</a> Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).</li><li>Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+design+of+genomic+Southern+blot+probes.">Automated design of genomic Southern blot probes.</a> BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).</li><li>Zimmer, A., Gruss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+chimaeric+mice+containing+embryonic+stem+(ES)+cells+carrying+a+homoeobox+Hox+1.1+allele+mutated+by+homologous+recombination.">Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination.</a> Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).</li></ol>

För närvarande, ersätta designer nukleaser för editering fortfarande inte ES cellbaserade gen-inriktning teknik på grund av dess frågor av off-target effekter och svårigheter att sätta en lång DNA fragment30,31. Gyllene metoderna för att identifiera HR händelser som inträffat i mus ES-celler, ger denna rapport en detaljerad protokoll med södra blotting och PCR för fältet. Vi validerat tillförlitligheten i dessa metoder genom att analysera enskilda...

Tekniken för genmodifiering av HR i murina ES-celler erbjuder ett kraftfullt verktyg för att dissekera cellulära konsekvenserna av specifika genetiska mutationer1,2. Vikten och betydelsen av denna teknik reflekteras i dess erkännande av 2007 Nobelpriset i fysiologi eller medicin3,4. under tiden representerar den tillkomsten av den moderna eran av genen engineering5. Genmodifiering genom HR kan utnyttjas för att ingenjör valfri ändring alltifrån punktmutationer till stora kromosomala omflyttningar i genomet av mus ES celler6,7. Det är väl känt att, före uppkomsten av så kallade genomet redigeringsverktyg, generering av en gen knockoutmus krävs tillämpningen av gen-inriktning teknik i ES celler8,9,10. Under de senaste två decennierna producerades mer än 5.000 gen-riktade möss av detta tillvägagångssätt för modellering mänskliga sjukdomar eller studera gen funktioner11. En genome-wide knockout ansträngning har fastställts för att distribuera gen-targeting vektorer, riktade ES cell kloner och levande möss till forskarsamhället2,12,13,14 , 15. utan tvekan ES cellbaserade HR-medierad gen-inriktning teknik kraftigt har avancerad vår förståelse av funktionerna hos gener som spelade i fysiologiska eller patologiska sammanhang.
Eftersom HR är en relativt ovanlig händelse i däggdjurs celler16,17, den viktiga och nästa steg efter är genen inriktning i murina ES-celler att analysera många ES kolonier för att identifiera några kloner med mutationer som följd HR med inriktning vektor18. Guld metoderna för att identifiera HR händelser inkluderar södra blotting och PCR-19,20. Fördelarna med tillvägagångssätt är att södra blotting kan identifiera korrekt riktade ES kloner och tillåter forskare att analysera strukturen av gen-inriktade händelsen, till exempel en kontroll av ett enda exemplar insättning av konstruktionen, medan en PCR-baserad strategi tillåter snabb screening för HR evenemang21,22. Även om dessa metoder har nackdelar, såsom att de är tidskrävande och kan ha falska positiva, Idå användningen av dem är allmänt accepterade och tillämpas av de flesta labb i att identifiera HR händelser, särskilt i ES-celler, för generering av genetiskt modifierade djur.
Tre isoformer av nonmuscle myosin II (NM II) hos däggdjur, vardera bestående av två identiska NMHC IIs som kodas av tre olika gener (namngivna Myh9, Myh10 och Myh14) och två par lätta kedjor, kallas NM II-A, II-B och II-C23. Tidigare studier har visat att åtminstone isoformerna NM II-A och II-B är nödvändiga för mus utveckling eftersom i vivo ablation av dessa isoformer resulterar i embryonal dödlighet24,25,26. Att kringgå detta problem och få nya insikter i isoform-specifika funktioner NM II-A och II-B i de senare stadierna av mus utveckling, en genetisk ersättare antogs strategi med ES cellbaserade HR-medierad gen-inriktning teknik att Generera en rad mus modeller27. I samband med att identifiera önskad ES klonerna, utnyttjades både södra blotting och PCR-metoder, och dessa visade sig vara effektiva och tillförlitliga27,28.
Denna uppsats avser att ge en detaljerad beskrivning av södra blotting och PCR, inklusive utformningen av inriktning vector(s), probe(s), och primers och utförandet av experiment, samt analys av resultaten exemplifieras genom att identifiera HR händelse händelse i ES-celler för att skapa genetiska utbyte NM II mus modeller och representativa uppgifter. Protokoll av dessa två metoder som presenteras här kan också antas för att identifiera genotyperna genetiskt modifierade celler eller djur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:903px;" width="903">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">BAC CLONE</td>
			<td style="width:232px;">BACPAC Resources Center (BPRC)</td>
			<td style="width:113px;">bMQ-330E21</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN Large-Construct Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right">12462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN Plasmid Plus Maxi Kit</td>
			<td style="width:232px;">QIAGEN</td>
			<td align="right" style="width:113px;">12963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">PfuUltra High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:232px;">Agilent</td>
			<td align="right" style="width:113px;">600382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">T-easy vector</td>
			<td style="width:232px;">Promega</td>
			<td style="width:113px;">A1360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:391px;">Nuclei Lysis Solution</td>
			<td style="width:232px;">Promega</td>
			<td style="width:113px;">A7941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein Precipitation Solution</td>
			<td style="width:232px;">Promega</td>
			<td>A7951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Denaturing Solution</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td>351-013-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Neutralizing Solution</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td>351-014-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP)</td>
			<td style="width:232px;">VWR</td>
			<td>27-9240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">UltraPure SSC, 20X</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">15557036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">15593031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">G418</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Salmon Sperm DNA Solution</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Platinu Taq DNA Polymerase High Fidelity</td>
			<td style="width:232px;">Thermo Fisher</td>
			<td align="right">11304029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Not I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Dra I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">EcoR I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ganciclovir</td>
			<td style="width:232px;">Sigma</td>
			<td style="width:113px;">G2536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Whatman&#160;TurboBlotter Transfer System, Large Kits</td>
			<td style="width:232px;">Fisher Scientific</td>
			<td>09-301-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">[&#945;32P]dCTP</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEG013H100UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">ProbeQuan G-50 Micro Columns</td>
			<td style="width:232px;">GE Healthcare</td>
			<td>28-9034-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Hybrisol I Hybridization Solution</td>
			<td style="width:232px;">Millipore</td>
			<td style="width:113px;">S4040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kodak X-Ray Film</td>
			<td>Z&#38;Z Medical</td>
			<td>844 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of homologous recombination events in mouse embryonic stem cells using southern blotting and polymerase chain reaction

I förhållande till frågor om off-target effekter och svårigheten att infoga en lång DNA-fragment i tillämpningen av designer nukleaser för genomet redigering, embryonala stamceller (ES) cell-baserad gen-inriktning teknik har inte dessa brister och är allmänt används för att ändra djur/mus genomet alltifrån stora borttagningar/infogningar till enda nukleotid substitutioner. Noterbart önskad att identifiera de relativt få homolog rekombination (HR) händelserna som krävs för att uppnå ES kloner är ett viktigt steg, som kräver korrekta och tillförlitliga metoder. Södra blotting eller konventionella PCR utnyttjas ofta för detta ändamål. Här beskriver vi de detaljerade förfarandena för att använda dessa två metoder för att identifiera HR händelser som inträffat i mus ES-celler där den endogena Myh9-gen är avsett att vara störd och ersättas med cDNAs kodning andra nonmuscle myosin heavy chain IIs (NMHC IIs). Hela förfarandet av södra blotting omfattar byggandet av inriktade vector(s), elektroporation, drog urval, expansion och lagring av ES celler/kloner, förberedelse, matsmältningen och blotting av genomisk DNA (gDNA), hybridisering och tvätt av probe(s) och ett sista steg av autoradiografi med röntgen-filmerna. PCR kan utföras direkt med beredda och utspädda gDNA. För att få perfekt resultat, bör de sonder och restriktionsenzym (RE) skära platser för södra blotting och primers för PCR planeras noggrant. Även utförandet av södra blotting är tidskrävande och arbetsintensiva och PCR-resultaten har falska positiva, genom en korrekt identifiering av södra blotting och snabb screening av PCR tillåta programmet ensam eller i kombination av dessa metoder som beskrivs i denna uppsats att allmänt användas och konsulteras av de flesta labb i identifiering av genotyper av ES-celler och genetiskt modifierade djur.

I detta papper beskrivs ett detaljerat protokoll med södra blotting och PCR, som används för att identifiera HR händelser som inträffade i mus ES-celler för generering av NM II genetisk utbyte mus-modeller, med ES celler-baserade HR-medierad inriktning teknik. Även om södra blotting och PCR, samt traditionella gen-inriktning teknik, har använts i flera årtionden, måste en framgångsrik tillämpning av dem planeras noga. Åtminstone dessa aspekter behöver beaktas: längden på ...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction at JoVE.com

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att identifiera homolog rekombination händelser som inträffat i mus embryonala stamceller använder södra blotting eller PCR. Denna metod exemplifieras av generationen av nonmuscle myosin II genetisk utbyte musmodeller med traditionella embryonala stamceller-baserade homolog rekombination-medierad inriktningsteknik.

Identifiering av homolog rekombination händelser i mus embryonala stamceller med södra Blotting och Polymerase Chain Reaction

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom molekylär- och cellbiologiska området, såsom att identifiera homologa rekombinationshändelser i mus embryonala stamceller. Den största fördelen med denna teknik är att det är korrekt, tillförlitlig, och används i stor utsträckning. Så kan denna metod ge insikt i att identifiera homologa rekombination händelser i mus embryonala stamceller.Det kan också tillämpas på andra system, såsom genetiskt modifierade celler eller djur. Generellt kommer enskilda nya till denna metod kamp eftersom det tar lång tid och innebär flera steg. För varje gDNA, blanda 30 mikroliter med 10 x buffert för DRA en, tre mikroliter av DRA en och 10 mikrogram gDNAs per prov.Tillsätt vatten tills den slutliga volymen är 30 mikroliter, och inkubera vid 37 grader celsius över natten för att smälta gdnas. Förbered en 1%agaroselektroforesgel med ethidiumbromid. Ladda de tidigare förvärvade proverna tillsammans med en EN KB stege på gelen, och kör den på 30 till 40 volt över natten.Nästa dag, blötlägg gelen i ett fack som innehåller en 0,2 newton saltsyralösning. Använd en shaker för att skaka facket försiktigt i 20 minuter i rumstemperatur. Överför gelen till ett fack som innehåller en DNA-denatureringslösning.Skaka den försiktigt i 20 minuter i rumstemperatur. Överför sedan gelen till en bricka som innehåller en DNA-neutraliserande lösning. Och skaka den försiktigt i 20 minuter i rumstemperatur.Med hjälp av ett snabbt nedåtgående överföringssystem överför du DNAs från gelen till membranet. Därefter montera turble blotter och blotting stack som beskrivs i de instruktioner som tillhandahålls av tillverkaren. Efter detta, ta ut membranet och tvätta den med två X saltlösning natriumcitrat i en minut.Absorbera vätskan med vävnader, och sedan använda en UV-crosslinker att korsa länka DNA med membranet. För att börja märka DNA-sonderna med radioaktivitet, tillsätt den värmedenaturerade sonden DNAs till röret som innehåller den färdiga att gå DNA-märkning pärlor. Pipett upp och ner för att blanda.Och tillsätt fem mikroliter radioaktivt märkta deoxycytodintrifosfat. Inkubera vid 37 grader varmt i 15 minuter. Rena de märkta sonderna genom att använda G 50 mikrokolumner enligt de instruktioner som tillverkaren tillhandahåller.Använd en scintillationsräknare för att mäta radioaktiviteten. För att börja hybridisera membranen med de märkta sonderna, placera membranet i hybridiseringsröret. Lägg till den blandade lösningen för hybridisering före.Placera röret i hybridisering ugn och låt pre hybridisering fortsätta vid 42 grader celsius i 30 minuter. Ta sedan bort röret från ugnen och häll den pre hybridiseringslösningen i ett 50 milliliter rör. Tillsätt denaturerade sonden, och blanda försiktigt.För att ta bort de icke hybridiserade sonderna, placera membranet i ett fack som innehåller ett X saltlösning natriumcitrat med 0,1%SDS och skaka försiktigt vid 55 till 60 grader celsius i 10 minuter. Efter detta, linda membranet med plastfolie och fixa det i exponeringskassetten. I ett mörkt rum, exponera membranet för två ark av röntgenfilm.Utveckla filmen för att visualisera resultaten. Avgöra om en motsvarande ES-klon är den önskade med målet för rekombination eller inte, enligt storlekarna på de DNA-band som upptäckts av sonderna. I denna studie, södra blotting och PCR används för att identifiera HR-händelser som inträffar i mus ES-celler för generering av NM två genetiska ersättning mus modeller med hjälp av ES-celler baserade HR medierad inriktning teknik.Eftersom de genomiska DNAs skärs i många fragment med olika längder, de visar ett utstryk som status på DNA-gel. Detta tyder på en fullständig rötning av genomisk DNAs. Som ett sista steg i södra blotting visas signalerna från en radioaktivitets märkt sond hybridisering med ett mål-DNA-fragment på filmen.Utseendet på förväntade band återspeglar förekomsten av HR-händelser i ES-klonerna. Enligt predesignen i studien har ES-kloner med muterad allel två distinkta storleksband. Medan vilda typ ES kloner bara har ett band, vilket tyder på de önskade ES klonerna är heterozygous.Efter PCR-reaktionen kan PCR-produkterna analyseras på DNA-gelen. Om ett specifikt NPCR-band av rätt storlek observeras, tyder detta på förekomsten av HR-händelser som ytterligare kan bekräftas genom sekvensering som PCR-bandet. Innebörden av denna teknik utvidgas till terapi av identifiera punkt mutation eftersom grunden är identiska.Samtidigt försöker detta förfarande är viktigt att komma ihåg att vara tålmodig och försiktig. Efter detta förfarande, andra metod som microinjection av ES cell i blastocysts kan utföras för att besvara ytterligare fråga som där bildandet av chimär djur. Aft dess utveckling, banade denna teknik vägen för forskaren inom deras område för molekylär och cellulär biologi för att utforska funktionen av en specifik gen eller konsekvensen av en muterad gen hos möss eller utanför.Glöm inte att arbeta med radioaktivitet labeler P32 DCTB kan vara extremt farligt och försiktighetsåtgärder såsom avskärmning med skydd ombord bör alltid ta medan du utför denna procedur.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Studying DNA and RNA

SCIENTISTS IN ACTION

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Förbättrad Polymerase Chain Reaction-restriction fragment length polymorphism Genotypning av Toxic Pufferfish genom vätskekromatografi / masspektrometri

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Halvkvantitativ detektion av RNA-beroende RNA-polymeras aktivitet av mänskliga telomeras omvänt transkriptas Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Högeffektiva gen störningar av murina och mänskliga hematopoetiska stamceller av CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-medierad omorganiseringen av kromatin Loop struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Enda Droplet Digital polymeraskedjereaktion för omfattande och samtidiga detektion av mutationer i Hotspot områden

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogen Protein taggning i mänskliga inducerade pluripotenta stamceller med CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

Odling och manipulering av O9-1 Neural Crest celler

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses

Utvärdering av en Universal kapslad omvänd transkription polymerase kedje reaktion för detektion av Lyssaviruses

To detect rabies virus and other member species of the genus Lyssavirus within the family Rhabdoviridae, the pan-lyssavirus nested reverse transcription ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Konstgjorda RNA-polymeras II förlängning komplex för dissekera Co-transkriptionella RNA bearbetning händelser

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

En robust Polymerase kedjereaktion-baserad analys för att kvantifiera cytosin-guanine-Guanintrinukleotidrepetitioner i bräcklig X mental retardation-1 gen

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...