Name: immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies
Uploaded: 2019-01-26T12:30:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies at JoVE.com

这项工作得到了国家卫生研究院 (p30gm103486) 的支持。

所有与羊的程序都是按照肯塔基州大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 批准的协议 (2017-2627 和 2017-2627) 进行的。
1. 抗原特异性羊驼毛抗体的产生
<ol><li>羊驼毛处理和一般注意事项
	<ol>
<li>获得适当的制度和监管批准。</li>
		<li>获得成年羊, 10岁以下, 身体状况得分至少为 3.0 (1-5 级)12。因为它们是牧群动物, 所以至少有两个, 但最好是三个动物在一起。 请注意:推荐男性, 因为一般来说, 他们的气质比较均衡, 更容易合作。</li>
		<li>通过兽医检查, 包括饮食、住房、疫苗接种和寄生虫控制计划的审查, 检查动物的健康状况13。根据专业兽医的建议, 确保动物接种适合当地地理区域的疫苗, 确保动物及时接种疫苗。根据对原产地群历史和当地具体情况的回顾, 与兽医协商, 制定外和内寄生虫控制方案13。</li>
		<li>适应至少一周, 包括吊环训练和接触约束。</li>
		<li>收集4毫升血液样本, 以获得血清作为免疫前控制 (见步骤 1.4)。将血清冷冻, 并以 0.5 ml 的等价物储存在-20°c。 请注意:此时, 可以进行完整的血细胞 (cbc) 分析, 以监测动物的初始健康状况。</li>
	</ol></li>
	<li>抗原制备
	<ol>
<li>在磷酸盐缓冲的生理盐水 (pbs) 或 heps 缓冲盐 (hbs) 中制备纯化的蛋白质抗原, 并浓缩至≥1 mg/ml。整个协议需要大约3毫克的蛋白质, 包括免疫、平移和克隆的确认。 请注意:骆驼抗体对蛋白质抗原表现出较高的特异性和选择性, 但通常不适合非结构化蛋白质或多肽抗原, 而非结构化的蛋白质或肽抗原通常是非结构化的。</li>
		<li>建立抗原纯度, 纯度和 gt;90%。使用一种分析方法, 如 sds-page。 注意事项:与其他蛋白质的严重污染可能会导致在选择单域抗体时出现问题, 在选择过程中, 单域抗体可以与污染物而不是目标蛋白质隔离。</li>
		<li>制备含有100μg 抗原的冷冻等价物。50μl 的2mgml 制剂是理想的。100μl 的 1 mgml 是最适用于免疫的稀释蛋白溶液。或者, 如果抗原不能经过冻融, 并且已知在溶液中长期稳定, 则可以将其储存在4°c。 请注意:为了确保抗原可以经历冷冻解冻周期, 测试20μl 的抗原应分配到一个薄壁 pcr 管, 并在液氮中冷冻。通过比较 uv/vis 在冷冻前后的吸收情况或运行 sds-page 凝胶, 对管材进行解冻, 进行高速离心, 并验证其定量回收。在可行的情况下, 还应测试抗原是否保留生物活性。如果冻融循环成功, 剩余的抗原被在100μl 的 aliquots 中被冷冻, 并在-80°c 下储存。如果冷冻解冻周期有问题, 可以在添加高达 2 0% 的甘油的情况下重复协议。</li>
	</ol></li>
	<li>免疫
	<ol>
<li>最多5种抗原, 每种200微克, 最后体积在300至 1, 000μl 之间。佐剂应以水作为稀释剂, 占最终体积的≥50%。 请注意:如果需要缓冲液, 请使用 hepes、mops 或甘氨酸。5到6之间的 ph 值往往被证明比严格的中性更有利。避免多价离子, 如磷酸盐或柠檬酸, 因为它们会引起凝固。</li>
		<li>用电动剪子修剪羊驼毛, 在一个月牙形的月亮图案沿着其颈部基部从肩部到肩部, 以暴露与弓淋巴结相邻的区域。</li>
		<li>用 22 g 针将羊与羊牵住, 慢慢地沿着颈部基部靠近弓淋巴结的情况下注射抗原。间隔约 200μl (或更小) ~ 5 厘米进行5次注射。 请注意:在注射过程中, 应由第二名工作人员约束动物。注射和流血的羊需要小心, 因为它们容易踢, 不仅从后面, 而且从侧身。在手术过程中, 让动物彼此接近, 在一个小组中是最好的。鉴于它们是牧群动物, 它们在一个群体中更平静, 在程序过程中需要不那么有力的约束。</li>
		<li>在注射后监测大约20分钟的动物是否有过敏反应的迹象 (参见步骤 1.6)。每周监测注射部位的局部炎症, 这在使用推荐的佐剂时是不可预料的。确保注射部位的血液泄漏不过量。</li>
		<li>每周使用混合物中每种抗原的100μg 进行五次后续的提升注射。根据季节的不同, 每周可能需要在注射部位剪掉头发。在秋天和冬天, 动物的头发可以迅速生长。</li>
	</ol></li>
	<li>抽血
	<ol>
<li>用酒精棉签对收集网站进行夹紧和消毒。</li>
		<li>用挺直挺直的挺直的脖子轻轻地约束动物。 请注意:如视频中所示, 可以手动限制动物。如果有的话, 在出血和注射时使用羊驼毛来抑制羊的胃, 可以方便地处理。要使用羊驼毛槽, 有了悬吊的羊被带到降落伞里, 用脖子条和皮带克制住, 快速释放。羊驼毛槽的版本可从商业供应商处获得。</li>
		<li>利用椎体横向过程的腹侧投影作为地标, 通过向腹侧过程施加压力来阻断静脉。 请注意:成年羊驼毛没有明显的颈静脉沟。颈静脉受横向椎体的腹侧投射保护。这种厚实的皮肤 (例如, 1 厘米厚的 "战斗板" 在男性颈部的中间) 和颈部肌肉组织, 使其难以想象或触诊颈静脉本身。随后, 椎体地标的使用是颈静脉定位的最有用的指标。</li>
		<li>将针头以45°角稍微内侧 (~ 手指宽度) 插入颈部中心的投影。操纵针头, 直到血液流动。 请注意:颈静脉和颈动脉彼此接近。静脉血液的颜色可以是相当红色的, 但仍然比动脉血液深。收集后, 应在该部位施加 0.5-1分钟的压力 (如果进入颈动脉, 则应施加更长的压力), 直到止血得到保证。</li>
		<li>绘制4-10 毫升的血液进行分析。使用1.5 英寸, 20 g 针通常与一个合适的大小注射器或血液收集管。使用薰衣草顶k2edta 管收集全血时, 净化淋巴细胞。利用金顶血清分离管 (bd) 采集血液进行血清生产。</li>
		<li>为生产目的提取50-100 毫升的血液。使用一个额外的12英寸输液延长集与 19-20 g 有翅膀的 "蝴蝶" 输液套件。 请注意:扩展集配置允许助手填充多个采血管, 使静脉剂能够专注于稳定采集针。输液组的加法可容纳动物的潜在运动 (3-5分钟程序), 并为操作人员提供舒适的工作距离。</li>
	</ol></li>
	<li>免疫监测
	<ol>
<li>第3 、5次注射后三到四天, 对每只动物进行小范围的出血试验, 以获得血清进行检测。将血清冷冻并存放在0.5 毫升的等价物中。同时获取额外的血液样本, 以监测动物的健康状况, 如上文所述。</li>
		<li>通过 elisa 确认抗原特异性抗体的存在, 使用免疫前、三周和五周时间点的测试出血所获得的血清进行 elisa 检测。最好是在抗体滴度还在增加的情况下进行最后的出血。</li>
		<li>使用表面处理96孔板生成抗原亲和板。在 100 mm 碳酸钠缓冲液中稀释0.1 微克的抗原, ph 值9.0。在每口井中加入100μl 的溶液, 并在4°c 下孵育过夜。每种抗原的10种稀释物一式两份。制备了一种仅涂有碳酸盐缓冲液的空白控制井。</li>
		<li>隔夜孵育后, 将板材倒置取出井内物, 用0.1 毫升的 pbs 清洗三次, 0.1% tween 20 (pbs-t)。</li>
		<li>在 pbs-t 中加入 0.1 ml 的 bsa (5 mg/ml), 并在室温下孵育板 1小时, 从而堵塞井。</li>
		<li>用 pbs-t 将清洗液移入井中, 然后通过倒模来去除清洗液, 用 pbs-t 清洗三次。</li>
		<li>使用开始稀释为半, 并可制备 pbs-t 缓冲液中每个免疫前血清中 0.3 ml 的两倍串行稀释剂, 最高可达1/102400。</li>
		<li>在井中加入 100μl, 使井中的稀释时间达到 2小时, 并允许在室温下孵育2小时。</li>
		<li>从每口井中取出血清, 用0.2 毫升的 pbs-t 清洗三次。</li>
		<li>用0.1 毫升的 hrp 共轭山羊抗骆驼 igg 抗体在1:20000 的稀释下, 以1小时的速度, 对每口井进行培养。 请注意:测量的免疫反应包括常规和重链仅抗体, 存在在近似相等的比率在循环 3,14。</li>
		<li>取出抗体溶液, 用0.2 毫升的 pbs-t 清洗每口井三次。</li>
		<li>在井中加入100μl 的显冷过氧化物酶底物, 并在室温下孵育, 直到两个最高浓度点的强度饱和, 通常需要5-10。</li>
		<li>在每口井中加入 100μl 0.1 m 硫酸以停止反应。</li>
		<li>使用板式读取器测量每口井在 450 nm 处的吸收率。</li>
		<li>绘制吸收率作为功能浓度。</li>
	</ol></li>
	<li>羊驼毛监测和潜在并发症
	<ol>
<li>确保在整个过程中进行适当的羊驼毛监测。 请注意:预计这些程序不会造成重大不利影响。在喂养和浇水过程中, 饲养和研究人员应每天监测动物的健康和健康情况。任何没有得到缓解的实验诱发或自发自然发病率的动物, 都应通过兽医服务机构进行评估, 并酌情提供治疗, 直至必要时接受人道安乐死。 与静脉切开术相关的潜在不利后果是出血、擦伤和血肿。应监测动物20分钟后抽血, 寻找出血的迹象。应使用对这些地点的额外压力。如果出血不停止, 应联系兽医。 与注射和出血相关的其他潜在不利后果包括肉芽肿的形成和炎症。肉芽肿的形成是意料之外的, 肯塔基州大学也没有观察到。注射部位炎症 (发红或肿胀) 可能会发生, 应引起兽医的注意。生产出血代表着潜在的大量血液, 应该对动物进行监测, 以确保它们在采集血液后是稳定和活跃的。 过敏反应和热原反应是最可能的两个严重的不良后果, 但很少观察到。如果发生过敏反应, 过敏反应将发生在抗原注射后不久, 表现为直肠温度升高、虚弱、呕吐、呼吸问题和腹泻。每次注射后都可以监测直肠温度, 以检测体温的任何升高。如果这些被识别, 请立即通知兽医进行咨询。此外, 应与兽医协商准备紧急 "崩溃试剂盒" (如肾上腺素、皮质类固醇和抗组胺) 来治疗怀疑有不良反应的动物。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 纯化单领域抗体库构建淋巴细胞
<ol><li>最后一次注射后3至5天收集50毫升血液 (参见步骤 1.4)。 请注意:快速处理血液和分离 rna 对于获得合适的文库尺寸15、3 具有重要意义, 这对平移的成功非常重要。</li>
	<li>用5毫升的 pbs 稀释采集到的血液15毫升。</li>
	<li>根据厂家的建议, 采用密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞 (pbl)。 注意事项:制造商的说明表明, 高达25毫升的血液可以使用, 但这可能会饱和系统, 并防止获得一个干净的淋巴细胞准备。</li>
	<li>将5毫升的 pbs 预冷至4°c 添加到 pbl 中。</li>
	<li>在4°c 的 800 x克下旋转20分钟。</li>
	<li>在 pbl 中加入5毫升预冷到4°c 的 pbs 清洗, 然后在800xg 的4°c 下离心 20分钟. </li>
	<li>根据制造商的说明, 使用基于自旋柱的系统隔离总 rna。通过在适当的缓冲液中进行顶点化并应用于生物聚合物切碎系统, 使细胞同质化。根据单元格输入使用适当数量的迷你列或最大列。</li>
	<li>利用逆转录酶合成 cdna, 将10μg 的 rna 与0.1 微克的 Oligo(dT)12-18 引物混合在一起。</li>
	<li>使用既定方法生成噬菌体库4。这包括克隆与限制酶进入噬菌体显示载体 pMES4, 然后是插入融合到丝状噬菌体的基因 iii 的表达, 用于噬菌体溶液的产生。</li>
</ol>3. 单域抗体平移
<ol><li>使用表面处理96孔板生产抗原亲和板。在 100 mm 碳酸钠缓冲液中稀释0.25 微克的抗原, ph 值9.0。在每口井中加入 100μl, 并在4°c 下孵育过夜。每抗原涂两口井。准备一个空白的控制井, 只涂有碳酸盐缓冲液。 请注意:如果将执行多轮选择, 则可以在4°c 下生产和储存长达一周的板材。此外, 这种方法利用直接吸收, 不需要标签, 而其他方法使用生物素化或其他类型的标签策略。</li>
	<li>把盘子孵化一夜。倒置去除井内物, 用0.1 毫升的 pbs-t 清洗三次。</li>
	<li>在 pbs 中加入 0.1 ml 的 bsa (20 mg/ml), 并在室温下孵育板 2小时, 从而堵塞井。</li>
	<li>用 pbs-t 清洗三次, 然后用 pbs 清洗三次。抗原也可以共价标记, 并用于捕获系统, 例如, 链霉素系统。</li>
	<li>在室温振动平台上, 用100μl 的 40mgmml bsa 在 pbs 中预处理噬菌体溶液 (100μl), 时间为30分钟。</li>
	<li>将噬菌体溶液加入抗原包覆井, 在室温下温和搅拌2小时。使用多个井, 以确保每种抗原总共有 10个11 种噬菌体。</li>
	<li>通过倒置丢弃未绑定噬菌体, 然后用200μl 的 pbs-t 清洗井五次, 然后用 pbs 清洗五次。</li>
	<li>在 pbs 中加入 0.1 mg/ml 胰蛋白酶, 并在室温下在振动平台上孵育 30分钟, 以700转/分的速度, 以洗脱约束法道。</li>
	<li>将溶液转移到含有 5μml 4-苯磺酰氟盐酸盐 (aebsf) 溶液的小瓶中, 以测定胰蛋白酶活性。</li>
	<li>在37°c 下生长 tg1 噬菌体显示有能力的细胞, 并有晃动, 直到 od600 = 0.5。</li>
	<li>在 tg1 细胞的3毫升中加入50μl 的洗脱噬菌体。</li>
	<li>在37°c 下孵化 30分钟, 不摇晃。</li>
	<li>加入7毫升的 lb 介质, 辅以100μgml 氨匹西林, 2% 葡萄糖。</li>
	<li>在37°c 下夜间摇晃。 请注意:为了获得最多样化的单域抗体, 克隆可以进行测序, 测试所需的特性, 并在一轮平移后使用。为了获得最高亲和力的单域抗体, 应利用两轮平移。</li>
	<li>在 lb 琼脂板上隔夜生长后将细菌进行平板, 辅以100μgml 氨匹西林, 2% 葡萄糖。需要对几种系列稀释剂进行测试, 首先是两次稀释, 镀100微米的1/10000 和1/100000 稀释。</li>
	<li>在37°c 下将板材连夜孵化。</li>
	<li>选择无菌96孔板的菌落, 用100μml 的安匹西林、2% 葡萄糖、10% v/v 甘油对每口井接种96孔板的井。</li>
	<li>在37°c 下过夜, 不发生晃动。</li>
	<li>第二天, 在37°c 的170转/分中摇晃60分钟。</li>
	<li>将2μl 的培养基取出到 pcr 管中。剩余的溶液可以留在盘子里, 在4°c 下储存 1-2天, 也可以冷冻, 在-80°c 下储存, 供以后使用。</li>
	<li>使用适合所使用载体的引物进行 pcr 反应。对于 pmes4, pcr 对阳性克隆的筛选使用的引物是在多个克隆位点两侧的引物, 这些引物是 cctttgccgggggggggggggggggggtttattac 和 ggggggggggggggggggggggcg。利用适合所使用的聚合酶的循环条件、57°c 的退火温度和30个循环。</li>
	<li>通过运行1% 琼脂糖凝胶分析 pcr 反应。阳性菌落具有约 500 bp 的单域抗体基因插入物, 确保阳性克隆为样本的20-50。 请注意:这种方法为大多数研究实验室的克隆选择和分析提供了一种手段。或者, 可以应用下一代排序, 并提供允许统计和比较分析的大型数据集16。</li>
	<li>将板中的阳性克隆体接种到含有7毫升 lb 的新鲜管中, 并含有100μgml 氨匹西林。</li>
	<li>在37°c 下与晃动一起生长。</li>
	<li>对培养物进行微准备, 以获得质粒 dna。</li>
	<li>序列阳性克隆使用标准测序引物 pEX-Rev (cagtttcttttttcggc)。</li>
	<li>对产生的单域抗体序列进行计算分析。确保没有停止密码子或帧移动。</li>
	<li>对生成的序列进行相似性和多样性的分类。反复识别的序列最可能是高亲和力绑定序列, 尤其是在两轮选择之后。</li>
	<li>使用 bl21 衍生的e.线圈表达株表达单域抗体。通过添加 iptg, 在22°c 下连夜生长, 产生表达式。</li>
	<li>采用固定化金属亲和层析法 (immobilized) 纯化单域抗体。</li>
	<li>使用直接相互作用检测 (如下拉、原生凝胶电泳或 elisa) 验证单域抗体抗原结合。</li>
	<li>根据特定实验的需要, 验证特定于应用程序的单域抗体性能。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibodies+for+biomedical+applications.">Single-domain antibodies for biomedical applications.</a> Immunopharmacology and Immunotoxicology. 38 (1), 21-28 (2016).</li><li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+tracing+antigens+in+live+cells+with+fluorescent+nanobodies.">Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies.</a> Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).</li><li>Maass, D. R., Sepulveda, J., Pernthaner, A., Shoemaker, C. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+production,+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments.">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77 (1), 13-22 (2007).</li><li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies.">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (3), 289-296 (2018).</li></ol>

怀特海姆博士和赫什博士在肯塔基州大学, 在分子医学中心经营一个核心, 在羊驼毛中产生单一领域的抗体, 作为收费服务。

正如所指出的, 单域抗体具有高度的亲和力和特异性, 再加上其简单的表达和稳定性, 使其成为生物医学研究应用的理想试剂, 作为关键的生化试剂、诊断工具或治疗剂18。对于商业应用, 有一些与知识产权有关的问题必须加以考虑。此外, 单域抗体可以被设计成包含特定标记或标记, 可用作细胞检测或诊断中的记者。这些用途的关键是能够产生针对感兴趣的抗原的特定单域抗体。这里描述了一种利用羊产生单域抗体的方法, 它对各种各样的蛋白质抗原产生强大的免疫反应。介绍了动物处理和法规遵从性的注意事项。这些都是这一进程成功的关键。
还有其他用于生成单域抗体的策略, 这些策略不需要免疫, 而是使用具有不同系统的半合成库来选择和迭代优化亲和力19,20.然而, 使用从免疫动物中提取的文库的优势在于能够可靠地分离出高富集、多样化和高亲和力的单域抗体。此外, 不仅观察到显著的序列变化, 而且绝大多数被分离的特定单域抗体具有独特的插入和删除, 特别是在 cdr3 中。
此外, 单域抗体可以通过一个简单的过程产生, 只需要少量注射抗原, 在这个过程之后, 动物可以返回到牧群。值得注意的是, 这种动物可以自由地用于纤维生产, 但由于使用检测抗原和非 fda 批准的单域抗体生产佐剂, 必须排除作为肉类 (人类食物链) 的用途。手术完成后, 应对动物进行一周的监测, 进行最后的兽医检查, 然后可以返回自己的家庭农场, 也可以在另一轮单域抗体生产之前休息六个月。

羊和其他骆驼科成员已经成为产生生物医学研究抗体的热门来源 1、2、3.骆驼具有独特的免疫系统, 因为它们产生的是正常抗体以及只产生重链抗体, 可以产生更小的单域抗体, 同时保持高特异性和高亲和力。因此, 骆驼抗体提供了一种用途广泛的试剂, 可用于各种用途。本文介绍了一种对羊驼毛进行免疫并产生多种蛋白质抗原单域抗体的方法。这些抗体可以通过一个相对简单的过程在骆驼中产生, 只需要通过小的注射目标蛋白 (抗原) 和抽血4进行免疫接种。随后, 利用图书馆结构, m13 噬菌体显示5 , 与重组抗原6相比, 进行了单域抗体的分离和产生, 具有所需的特性。由于该工艺利用噬菌体显示技术的力量, 每种动物可以同时使用五种或五种以上的抗原, 从而减少了所使用的动物数量和相关成本。
典型的哺乳动物抗体或免疫球蛋白是由两种链 (2 根重链和2根轻链) 组成的大分子, 通过二硫键连接在一起。这些抗体相对较大, 对人类、小鼠、山羊和兔子中含有较丰富的 igg 种类的分子量约为 140-190 kda。免疫球蛋白由于其多亚基结构、高分子量和二硫键, 大量生产具有相当高的挑战性, 使其成本较高。20世纪90年代, 人们发现骆驼, 包括骆驼、骆驼和羊, 除了典型的哺乳动物型免疫球蛋白外, 还制造一种结构简单、只有沉重的链的新型免疫球蛋白.这些独特的骆驼抗体具有相同的能力, 专门结合具有高亲和力的外来物质, 但只由一个蛋白质链 8.此外, 骆驼抗体可以通过实验截断到一个更小的单位 vh片段, 也称为单域抗体9。由于其体积小, 单域抗体可用于广泛的生物医学研究应用, 并可从各种学术和商业来源1,10。一个例外似乎是西方印迹, 因为单域抗体更经常地针对构象依赖性表位, 这些表位通常在西方印迹中使用的变性条件下丢失。
由于它们是由单个多肽链组成的, 因此可以选择特定的单域抗体, 并在细菌中作为重组蛋白大量生产。单域抗体也可以进行基因工程, 以包含特定的标记或标签, 可作为诊断疾病的"记者组" 11。这种操作的易用性, 加上其使用的灵活性, 使单域抗体成为大学和其他地方研究人员的重要资源。
作为国家卫生研究院支持的核心的一部分, 对现有方法进行了调整, 以产生来自羊3、4 的单一领域抗体。与较大的骆驼家族成员相比, 羊在处理方便方面都有显著的优势, 也有很好的可达性。羊可以广泛种植用于纤维和肉类, 因此可以从当地的羊驼毛农民那里获得, 他们可以通过自己的网站或国家饲养员协会进行识别。有两个品种的羊, 苏瑞和华卡亚。huacaya 比较常见, 用于此协议, 但该协议一般适用于任何一种品种, 也更广泛地适用于其他骆驼。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:932px;" width="932">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">GERBU FAMA adjuvant</td>
			<td style="width:123px;">Biotechnik, Heidelberg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:344px;">3003,6001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serum collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacutainer blood collection set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Maxisorp Immuno plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HRP-conjugated goat anti-llama IgG antibody&#160;</td>
			<td>Bethyl Labs</td>
			<td>A160-100P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TMB reagent chromogenic peroxidase substrate&#160;</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-76-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plate Reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M5</td>
			<td>Any UV/VIS capable reader is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Uni-SepMAXI+ lyphocyte separation tube</td>
			<td>Novamed</td>
			<td>U-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAshredder column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Superscript IV reverse transcriptase&#160;&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AEBSF solution</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>A-5440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TG1 phage display competent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies

本文介绍并演示了一种羊驼毛免疫方法和利用分子生物学方法制备抗原特异性单域抗体的方法。骆驼, 如羊和骆驼, 已经成为生物医学研究的宝贵资源, 因为它们产生了一种新型的重链专用抗体, 可用于产生单一领域的抗体。由于免疫系统具有高度的灵活性, 单域抗体可以对许多不同的蛋白质抗原, 甚至不同的抗原构象, 具有非常高的特异性。除其他外, 这些特性使单域抗体成为生物医学研究的宝贵工具。报道了一种从羊的单域抗体中产生的方法。介绍了免疫、血液采集和 b 细胞分离的一种方案。b 细胞用于构建免疫文库, 用于通过平移选择特异性单域抗体。通过平移获得的特定域抗体通过下拉、elisa 或凝胶移位检测得到确认。由此产生的单域抗体可以直接使用, 也可以作为工程试剂的一部分使用。单域抗体和单域抗体的应用包括结构、生化、细胞、体内和治疗应用。单域抗体可以作为原核表达系统中的重组蛋白大量产生, 直接纯化和使用, 也可以设计成包含特定标记或标签, 作为记者在细胞研究中或诊断。

这里介绍的协议被用来产生针对一系列蛋白质抗原的单域抗体。每只羊驼毛使用了五种抗原。免疫监测表明, 大多数抗原从三周开始表现出强劲的反应 (图 1)。大约六个星期后, 生产出血和图书馆建设为注射多种抗原的动物提供了最好的平衡。对每种抗原进行两轮平移, 并对分离菌落进行筛选 (图 2)。阳性菌落测序确定了不同抗原的不同单域抗体序列。例如, 将三个独特的克隆分离到参考抗原麦芽糖结合蛋白 (mbp) (图 3a)。正如经常观察到的, 单域抗体包含显著的序列多样性和高度可变的 cdr3 长度 (图 3)。这些特征在单域抗体抗原相互作用中尤为重要, 如参考单域抗体 (cx3cl1复合物 17) 所示 (图 3b)。
大多数全长单域抗体序列可以在培养的 1-10 mgl 时表示和纯化 (图 4 a)。由于 cdr3 长度的多样性, 不同的单域抗体在分子量上有轻微的变化。确认直接绑定和特定于应用程序的性能至关重要。例如, 在对抗原 b 进行两轮选择后, 确定了一个单域抗体面板 (图 2)。确定了多个相同的序列, 并制备和纯化了单域抗体。然后用抗原亲和力树脂直接拉下测试, 并表现出稳健的剂量依赖性结合 (图 4b)。重要的是, 单域抗体不具有控制树脂的约束力。这些数据演示了直接绑定交互, 并且非常适合在下拉式和基于 elisa 的格式中进行关联捕获。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig1.jpg"> 图 1: 对两种不同抗原进行有代表性的免疫监测, 显示同一动物对不同抗原的显著特异性免疫反应.许多抗原早在开始免疫后三周就表现出强劲的反应, 其中大多数抗原在六周后表现出最大的反应。六个星期也允许亲和力成熟, 是生产出血和 b 细胞分离的推荐时间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig1large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig2.jpg"> 图 2: 基于 pcr 的阳性克隆的确认.引物跨越 pMES4 向量的 mcs, 正纳米无体克隆产生约 500 bp 的振幅 (标记为 *)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig2large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig3.jpg"> 图 3: 抗原特异性序列突出了羊驼毛单域抗体的多样性.(a) 将与 mbp 分离的选定单域抗体序列与参考单域抗体4xt1 对齐, 并在下面突出显示框架和互补确定区域 (kabat)。(b) 羊驼毛单域抗体4xt1 的结构与 cx3cl1 (pdb 4xt1) 结合, 强调可变 cdr 环在特定抗原结合中的关键作用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig3large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig4.jpg"> 图 4: 单域抗体的纯化和验证.(a) imaac 纯化单域抗体的 sds-page, 比较不同的单域抗体。不同的分子量主要是由于 cdr3 环路的长度不同。还观察到不同的表达水平, 少数单一领域抗体显示纯化蛋白的产量很低。(b) 使用抗原亲和力下拉式验证直接结合。用抗原偶联树脂观察到鲁棒剂量依赖性单域抗体结合, 而不是对照树脂。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig4large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>

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Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

蛋白质抗原对羊的免疫和抗原特异性单域抗体的制备

介绍了一种从羊的免疫、血液采集、b 细胞分离和选择等方面制备单域抗体的方法。

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

我们在这里描述的方法由我们的NIH COBRE赞助，肯塔基大学蛋白质核心设施采用，以帮助研究人员在羊驼中产生单域抗体。单域抗体是回答生物医学研究中关键问题的重要工具。我们演示的技术的主要优点是，它允许在单个羊驼中生产多达五种不同蛋白质的单域抗体。这项技术的影响延伸到人类健康和疾病治疗，因为这些单域抗体可以用作治疗，疫苗和诊断。对于大多数成熟的生物医学研究者来说，最重要的障碍是处理大型动物，如羊驼。处理羊驼、注射抗原和采集血液的视觉演示对于这些骆驼体中单域抗体的成功生产至关重要。演示该程序将是杰夫·斯迈利医生，大学兽医，凯西·博阿兹女士，兽医技术员，和艾琳·琼斯女士，实验室动物技术员。研究助理赵马丁博士将演示血液的处理。这组作品的真实故事是蓝眼睛，大男孩，或亲切地被称为大猩猩，和弗雷迪，我们的肯塔基羊驼。首先，用吊带和铅约束动物。然后修剪羊驼的头发与电动剪子在一个新月图案沿它的脖子底部，从肩到肩。小心地握住羊驼的头部和颈部，沿着颈部底部，在弓淋巴结附近，用22个量表针慢慢注射抗原皮。进行五次注射，每次约200微升，相距约5厘米。在此之后，监测动物约20分钟，以寻找过敏的迹象。每周检查注射部位的局部炎症。要抽血，请夹住羊驼的头发，用酒精拭子对采集地点进行消毒。轻轻地抑制羊驼，确保颈部保持直立和直。利用椎骨横向过程的腹体投影作为里程碑，通过向腹体过程施加内向压力来遮挡静脉。接下来，以 45 度角插入针头，稍微向投影中，朝向颈部中心。操纵针头，直到血液流动。首先，用5毫升PBS稀释15毫升的采集血液。然后，移液器血液进入淋巴细胞分离管，通过密度梯度离心分离外周血淋巴细胞（PBL）。轻轻取出顶部等离子层，将其保存在单独的管中。然后，轻轻去除PBL层，并将其转移到无菌的50毫升管。在 PLL 中加入 45 毫升预冷却 PBS，在 800 倍 G 和 4 摄氏度下旋转管管 20 分钟。用移液器去除上流液，留下含有淋巴细胞的颗粒。再用五毫升预冷却的 PBS 清洗颗粒两次，为 RNA 分离做好准备。利用此协议，针对一系列蛋白质抗原生成单域抗体。免疫监测表明，大多数抗原从三周开始表现出强健反应，获得血液的最佳时间是六周。对阳性菌落的测序确定了不同抗原的不同单域抗体序列。例如，三个独特的菌落被分离到参考抗原麦芽糖结合蛋白。一般来说，单域抗体含有显著的序列多样性和抗原结合回路的极可变长度。这些功能在单域抗体抗原相互作用中尤为重要。该程序允许生产单域抗体，每个动物最多生产五种抗原。每个动物都使用单一的血液收集和图书馆结构。利用基于噬菌体显示的选择来识别抗原特异性单链抗体。在进行抗原注射和血液采样时，重要的是将羊驼留在一组，使它们更平静。这可以使用吊带和引线完成，并在过程中将它们紧密地绑在一起。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

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