Name: immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies
Uploaded: 2019-01-26T12:30:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (P30GM103486).

<ol>
	<li>Krah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibodies+for+biomedical+applications.">Single-domain antibodies for biomedical applications.</a> Immunopharmacology and Immunotoxicology. 38 (1), 21-28 (2016).</li><li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+tracing+antigens+in+live+cells+with+fluorescent+nanobodies.">Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies.</a> Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).</li><li>Maass, D. R., Sepulveda, J., Pernthaner, A., Shoemaker, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpaca+(Lama+pacos)+as+a+convenient+source+of+recombinant+camelid+heavy+chain+antibodies+(VHHs).">Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs).</a> Journal of Immunological Methods. 324 (1-2), 13-25 (2007).</li><li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+protocol+for+the+generation+of+Nanobodies+for+structural+biology.">A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).</li><li>Hertveldt, K., Belien, T., Volckaert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+M13+phage+display:+M13+phage+display+in+identification+and+characterization+of+protein-protein+interactions.">General M13 phage display: M13 phage display in identification and characterization of protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 502, 321-339 (2009).</li><li>Kushwaha, R., Schafermeyer, K. R., Downie, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+phage+display+and+affinity+selection+using+recombinant+protein+baits.">A protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e50685 (2014).</li><li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).</li><li>Muyldermans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Camelid+immunoglobulins+and+nanobody+technology.">Camelid immunoglobulins and nanobody technology.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 128 (1-3), 178-183 (2009).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annu Rev Biochem. 82, 775-797 (2013).</li><li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments:+the+superfluous+luxury+of+paired+domains.">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody-derived+nanobiotechnology+tool+kits+for+diverse+biomedical+and+biotechnology+applications.">Nanobody-derived nanobiotechnology tool kits for diverse biomedical and biotechnology applications.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 3287-3303 (2016).</li><li>Van Saun, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+requirements+and+assessing+nutritional+status+in+camelids.">Nutritional requirements and assessing nutritional status in camelids.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 265-279 (2009).</li><li>Jones, M., Boileau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Camelid+herd+health.">Camelid herd health.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 239-263 (2009).</li><li>Daley, L. P., Gagliardo, L. F., Duffy, M. S., Smith, M. C., Appleton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+monoclonal+antibodies+in+functional+and+comparative+investigations+of+heavy-chain+immunoglobulins+in+new+world+camelids.">Application of monoclonal antibodies in functional and comparative investigations of heavy-chain immunoglobulins in new world camelids.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (3), 380-386 (2005).</li><li>Romao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Useful+Nanobodies+by+Phage+Display+of+Immune+Single+Domain+Libraries+Derived+from+Camelid+Heavy+Chain+Antibodies.">Identification of Useful Nanobodies by Phage Display of Immune Single Domain Libraries Derived from Camelid Heavy Chain Antibodies.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (43), 6500-6518 (2016).</li><li>Henry, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+TGF-beta-neutralizing+single-domain+antibodies+of+predetermined+epitope+specificity+using+next-generation+DNA+sequencing.">Isolation of TGF-beta-neutralizing single-domain antibodies of predetermined epitope specificity using next-generation DNA sequencing.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 29 (10), 439-443 (2016).</li><li>Burg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology.+Structural+basis+for+chemokine+recognition+and+activation+of+a+viral+G+protein-coupled+receptor.">Structural biology. Structural basis for chemokine recognition and activation of a viral G protein-coupled receptor.</a> Science. 347 (6226), 1113-1117 (2015).</li><li>Wesolowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+domain+antibodies:+promising+experimental+and+therapeutic+tools+in+infection+and+immunity.">Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity.</a> Medical Microbiology and Immunology. 198 (3), 157-174 (2009).</li><li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+production,+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments.">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77 (1), 13-22 (2007).</li><li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies.">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (3), 289-296 (2018).</li></ol>

DRs. Whiteheart og Hersh er på University of Kentucky og drive en kerne i Center for Molekylær medicin, der producerer enkelt domæne antistoffer i alpaca som et gebyr for service.

Som bemærket, høj affinitet og specificitet af enkelt domæne antistoffer, kombineret med deres facile udtryk og stabilitet, gør dem ideelle reagenser til programmer i biomedicinsk forskning, som kritiske biokemiske reagenser, diagnostiske værktøjer, eller terapeutiske agenter18. For kommercielle programmer er der nogle spørgsmål relateret til intellektuel ejendom, der skal overvejes. Derudover kan enkelt domæne antistoffer være udviklet til at indeholde bestemte mærker eller mærker, der kan bruges som journalister i cellulære assays eller i diagnostik. Nøglen til disse anvendelser er evnen til at producere specifikke enkelt domæne antistoffer mod antigener af interesse. En metode er beskrevet her til at producere enkelt domæne antistoffer ved hjælp af Alpaka, der producerer en robust immunrespons mod en bred vifte af protein antigener. Overvejelser i forbindelse med dyrs håndtering og overholdelse af lovgivningen er beskrevet. Disse er nøglen til succes i denne del af processen.
Der er andre strategier for at producere enkelt domæne antistoffer, der ikke kræver vaccination, men i stedet bruge semisyntetisk biblioteker med forskellige systemer for udvælgelse og iterativ optimering af tilhørsforhold19,20 . Men fordelen ved at bruge biblioteker fra immuniseret dyr er evnen til at pålideligt isolere yderst højberiget, forskelligartede og høj-affinitet enkelt domæne antistoffer. Derudover ikke kun er betydelig sekvens variationer observeret, men et stort flertal af specifikke enkelt domæne antistoffer isoleret havde unikke indsættelser og sletninger, især i CDR3.
Yderligere, enkelt domæne antistoffer kan produceres via en enkel proces, der kun kræver små injektioner af antigenet, og efter denne proces, at dyrene kan returneres for husdyrbestand. Bemærk, dyret kan anvendes frit til fremstilling af fibre, men bør udelukkes fra anvendelse som kød (fødekæden) anvendelse af test antigener og ikke-FDA godkendte adjuverende for enkelt domæne antistof produktion. Når proceduren er afsluttet, kan dyrene bør overvåges for en uge, givet en endelige veterinære eksamen, og derefter enten vendte tilbage til deres hjem gård eller hvilede i seks måneder forud for anden runde af enkelt domæne antistof produktion.

Alpaka, og andre medlemmer af familien camelid, er blevet en populær kilde til generering af antistoffer til biomedicinsk forskning1,2,3. Camelids har en unik immunsystemet, idet de producerer både normale antistoffer samt heavy-kæden kun antistoffer, der tillader produktion af meget mindre enkelt domæne antistoffer, samtidig bevare høj specificitet og høj affinitet. Således give camelid antistoffer en alsidig reagens nyttigt til en række forskellige formål. En metode til at immunisere alpaca og producere enkelt domæne antistoffer mod en række forskellige protein antigener er her beskrevet. Disse antistoffer kan fremstilles i camelids via en relativt enkel proces, der kun kræver immunisering via små injektioner af target proteinet (antigen) og en blod uafgjort4. Efterfølgende er bibliotek byggeri, M13 phage display5 og panorering versus rekombinante antigener6 brugt til at isolere og producere enkelt domæne antistoffer med de ønskede egenskaber. Fordi processen udnytter kraften i phage display teknologi, fem eller flere antigener kan udnyttes samtidig pr. dyr, hvilket reducerer antallet af dyr brugt og dermed forbundne udgifter.
Typiske pattedyr antistoffer eller immunoglobuliner er store molekyler bestående af to typer af kæder (2 tunge kæder og 2 lette kæder), der er forbundet med hinanden gennem disulfid obligationer. Disse antistoffer er relativt store, udstiller Molekylær vægt ~ 140-190 kDa til mere rigelige IgG arterne fra mennesker, mus, geder og kaniner. På grund af deres multi subunit struktur, høj molekylvægt, og disulfid obligationer, kan immunoglobuliner være temmelig udfordrende at producere i store mængder, hvilket gør deres høje omkostninger. I 1990 ' erne, blev det opdaget, at camelids, som omfatter kameler, lamaer og alpakaer gøre, ud over den typiske pattedyr type immunoglobulin, en roman form af immunglobulin, der er enklere i struktur, besidde kun tunge kæder7. Disse unikke camelid antistoffer besidder den samme evne til at binde specifikt fremmede stoffer med høj affinitet men kun består af ét protein kæde8. Derudover kan camelid antistoffer afkortes eksperimentelt til en mindre enhed VHH fragment, også kaldet et enkelt domæne antistof9. På grund af deres lille størrelse, enkelt domæne antistoffer er nyttige for en bred vifte af biomedicinsk forskning applikationer og er tilgængelig fra en række forskellige akademiske og kommercielle kilder1,10. En undtagelse synes at være Western blotting eftersom enkelt domæne antistoffer er mere ofte rettet mod kropsbygning afhængige epitoper, der er normalt tabt denaturering betingelser anvendes i Western blotting.
Da de er lavet af en enkelt polypeptid kæde, kan specifikke enkelt domæne antistoffer valgt og let produceres i store mængder som rekombinante proteiner i bakterier. Enkelt domæne antistoffer kan også være genetisk manipuleret til at indeholde specifikke mærker eller mærker, der kan bruges som "reporter grupper" til at diagnosticere sygdomme11. Denne lethed af manipulation kombineret med deres fleksibel anvendelse gør enkelt domæne antistoffer en vigtig ressource for forskere på universiteter og andre steder.
Som en del af en National Institutes of Health støttet core, er eksisterende metoder blevet tilpasset til at producere enkelt domæne antistoffer fra Alpaka3,4. Alpaka har betydelige fordele i både nem håndtering i forhold til større camelid familiemedlemmer samt tilgængelighed. Alpaka er bredt rejst til fiber og kød og dermed kan opnås regionalt fra lokale alpaca landmænd, der kan identificeres via deres hjemmesider eller stat opdrætter foreninger. To racer af Alpaka findes, Suri og Huacaya. Huacaya er mere almindelige og blev brugt til denne protokol, men protokollen er generelt gælder for enten racer og mere bredt gælder også for andre camelids.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:932px;" width="932">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">GERBU FAMA adjuvant</td>
			<td style="width:123px;">Biotechnik, Heidelberg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:344px;">3003,6001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serum collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacutainer blood collection set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Maxisorp Immuno plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HRP-conjugated goat anti-llama IgG antibody&#160;</td>
			<td>Bethyl Labs</td>
			<td>A160-100P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TMB reagent chromogenic peroxidase substrate&#160;</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-76-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plate Reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M5</td>
			<td>Any UV/VIS capable reader is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Uni-SepMAXI+ lyphocyte separation tube</td>
			<td>Novamed</td>
			<td>U-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAshredder column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Superscript IV reverse transcriptase&#160;&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AEBSF solution</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>A-5440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TG1 phage display competent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies

I dette manuskript, er en metode til immunisering af alpaca og brugen af molekylærbiologiske metoder til fremstilling af antigen-specifikke enkelt domæne antistoffer beskrevet og vist. Camelids, er såsom Alpaka og lamaer, blevet en værdifuld ressource for biomedicinsk forskning da de frembringer en roman type af tunge kæde-only antistof, som kan bruges til at producere enkelt domæne antistoffer. Fordi immunsystemet er yderst fleksibel, gøres enkelt domæne antistoffer til mange forskellige protein antigener, og endda forskellige konformationer af antigen, med en meget høj grad af specificitet. Disse funktioner, blandt andet gøre enkelt domæne antistoffer et uvurderligt værktøj for biomedicinsk forskning. En metode til fremstilling af enkelt domæne antistoffer fra Alpaka er rapporteret. En protokol for immunisering, indsamling og B-celle isolation er beskrevet. B-celler anvendes til opførelse af en immuniseret bibliotek, som bruges i forbindelse med udvælgelsen af specifikke enkelt domæne antistoffer via panorering. Formodede specifikke enkelt domæne antistoffer opnået via panorering bekræftes af pull-down, ELISA eller gel-Skift assays. De resulterende enkelt domæne antistoffer kan derefter bruges, enten direkte eller som en del af en manipuleret reagens. Anvendelser af enkelt domæne antistof og enkelt domæne antistof-baserede regents omfatter strukturelle, biokemiske, cellulære, in vivo og terapeutiske applikationer. Enkelt domæne antistoffer kan produceres i store mængder, som rekombinante proteiner i prokaryote udtryk systemer, renset, og anvendes direkte eller kan være konstrueret til at indeholde specifikke mærker eller mærker, der kan bruges som journalister i cellular undersøgelser eller i diagnosticering.

Protokollen præsenteres her blev udnyttet til at generere enkelt domæne antistoffer mod en række af protein antigener. Fem antigener blev udnyttet pr. alpaca. Immun overvågning tilkendegivet, at fleste af antigener viste robuste svar begyndelsen på tre uger (figur 1). Produktion beskæringer og bibliotek byggeri efter cirka seks uger giver den bedste balance for dyr, der har flere antigener injiceres. To runder af panorering blev udført for hvert antigen, og isolerede kolonier screenet (figur 2). Sekventering af positive kolonier identificeret forskellige enkelt domæne antistof sekvenser for de forskellige antigener. For eksempler var tre unikke kloner isoleret til reference antigen Maltose bindende Protein (MBPS) (figur 3A). Som er ofte observeret, indeholder enkelt domæne antistoffer betydelige sekvens mangfoldighed og meget varierende CDR3 længde (figur 3). Disse funktioner er særlig vigtig i enkelt domæne antistof/antigen interaktioner som ses i den reference enkelt domæne antistof/CX3CL1 komplekse17 (figur 3B).
Størstedelen af fuld længde enkelt domæne antistof sekvenser kan udtrykkes og renset på 1-10 mg/L af kulturen (figur 4A). På grund af mangfoldigheden i CDR3 længden vise forskellige enkelt domæne antistoffer mindre variation i molekylvægt. Bekræftelse af direkte bindende og programmets specifikke ydeevne er kritisk. For eksempel, efter to runder af udvælgelse imod Antigen B identificeret et panel af enkelt domæne antistoffer var (figur 2). Flere identiske sekvenser blev identificeret, og enkelt domæne antistof blev produceret og renset. Det blev derefter testet via direkte trække ned med antigen affinitet harpiks og viste robust dosis-afhængige bindende (figur 4B). Vigtigere, viste enkelt domæne antistof ingen binding til styre harpiks. Disse data viser en direkte bindende interaktion, og det er velegnet til affinitet opsamling i både pull-down og ELISA-baseret formaters.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig1.jpg"> Figur 1 : Repræsentant immun overvågning af to særskilte antigener viser betydelig specifikke immunrespons til forskellige antigener i samme dyr. Mange antigener Vis robuste svar så tidligt som tre uger efter begyndende immunisering, med de fleste viser maksimal svar efter seks uger. Seks uger også giver mulighed for affinitet modning og er den anbefalede tid for produktion beskærings- og B-celle isolation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig2.jpg"> Figur 2 : PCR-baserede bekræftelse af positive kloner. Primere span MCS af vektoren, pMES4, og en positiv nanobody klon producerer en amplikon ~ 500 bp (markeret med *). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig3.jpg"> Figur 3 : Antigen-specifikke sekvenser fremhæve alpaca enkelt domæne antistof mangfoldighed. (A) justering af Vælg enkelt domæne antistof sekvenser isoleret til MBP med en reference enkelt domæne antistof 4XT1, rammer og komplementaritet-bestemmende områder (Kabat) fremhævet nedenfor. (B) struktur af alpaca enkelt domæne antistof 4XT1 bundet til CX3CL1 (FBF 4XT1), som understreger den afgørende rolle af variable CDR sløjfer i specifikke antigen bindende. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig4.jpg"> Figur 4 : Oprensning og validering af enkelt domæne antistoffer. (A) SDS-PAGE IMAC renset enkelt domæne antistoffer, sammenligne forskellige enkelt domæne antistoffer. Forskellige Molekylær vægt er primært på grund af varierende længde af CDR3 sløjfen. Forskellige niveauer af udtryk er også observeret, med et mindretal af enkelt domæne antistoffer viser dårlig udbyttet af oprenset protein. (B) kontrol af direkte bindende ved hjælp af et antigen affinitet pull-down. Robust dosisafhængig enkelt domæne antistof bindende er observeret med antigen-kombineret harpiks, men ikke med kontrol harpiks. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies at JoVE.com

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunisering af Alpaka (Lama pacos) med Protein antigener og produktion af Antigen-specifikke enkelt domæne antistoffer

En metode til fremstilling af enkelt domæne antistoffer fra Alpaka, herunder vaccination, indsamling, B-celle isolation og udvælgelse er beskrevet.

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

De metoder, vi beskriver her blev vedtaget af vores NIH COBRE sponsoreret, University of Kentucky Protein Core Facility til at hjælpe forskere producere enkelt-domæne antistoffer i alpakaer. Antistoffer på et enkelt domæne er et vigtigt redskab, der bruges til at besvare centrale spørgsmål i biomedicinsk forskning. Den største fordel ved de teknikker, vi viser, er, at det giver mulighed for produktion af enkelt-domæne antistoffer til op til fem forskellige proteiner i en enkelt alpaca.Konsekvenserne af denne teknik omfatter menneskers sundhed og sygdomsbehandling, da disse enkelt-domæne antistoffer kan bruges som terapeutiske, som vacciner, og som diagnostik. Den mest betydningsfulde forhindring for de fleste etablerede biomedicinske efterforskere er håndtering af store dyr, såsom alpaca. Visuel demonstration af håndtering af en alpaca, injektion af antigener, og indsamling af blod, er afgørende for en vellykket produktion af enkelt-domæne antistoffer i disse camelids.Demonstrere proceduren vil være Doctor Jeff Smiley, University Dyrlæge, Ms Kathy Boaz, Veterinærtekniker, og Ms.Erin Jones, Lab Animal Technician. Håndtering af blodet vil blive påvist af Doctor Martin Chao, Research Associate. De virkelige historier om denne produktion er Blue Eyes, Big Boy, eller kærligt kendt som Gorilla, og Freddie, vores Kentucky alpacas.Til at begynde, begrænse dyret med en grime og bly. Trim derefter alpaca hår med elektriske klippere i en halvmåne mønster langs bunden af det hals, fra skulder til skulder. Hold forsigtigt alpaca ved hoved og hals, og langsomt injicere antigener subkutanely med en 22 gauge nål langs bunden af halsen, nær bov lymfeknuder.Udfør fem injektioner af ca 200 mikroliter hver, omkring fem centimeter fra hinanden. Efter dette, overvåge dyret i ca 20 minutter for tegn på anafylaksi. Undersøg injektionsstedet for lokaliseret inflammation på injektionsstederne ugentligt.For at tegne blod skal du klippe alpakaens hår og desinficere indsamlingsstedet med spritservietter. Begrænse alpaca forsigtigt, sikre, at halsen holdes oprejst og lige. Brug af ventrale fremskrivninger af den tværgående proces af ryghvirvler som et vartegn, okkludere venen ved at anvende pres bare mediale til ventrale processen.Dernæst indsætte nålen i en 45 graders vinkel, lidt mediale til projektionen, mod midten af halsen. Manipuler nålen, indtil blodet flyder. Fortyndes først 15 milliliter af det opsamlede blod med fem milliliter PBS.Derefter pipette blod ind i en lymfocyt adskillelse rør til at isolere perifere blod lymfocytter, eller PBLs, via densitet gradient centrifugering. Fjern forsigtigt det øverste plasmalag og gemmer det i et separat rør. Fjern derefter forsigtigt PBL-laget, og overfør det til et sterilt 50 milliliterrør.Tilsæt 45 milliliter forkølet PBS til PBLs og drej røret i 20 minutter ved 800 gange G og fire grader Celsius. Fjern supernatanten med en pipette, så pellet indeholder lymfocytter. Vask pellet to gange mere med fem milliliter forkølet PBS for at gøre PBLs klar til RNA-isolering.Ved hjælp af denne protokol blev antistoffer på et enkelt domæne genereret mod en række proteinantigener. Immunovervågning viste, at størstedelen af antigener viste robust respons begynder ved tre uger, og at det optimale tidspunkt at få blod er på seks uger. Sekventering af de positive kolonier identificerede forskellige antistofsekvenser på et enkelt domæne for forskellige antigener.For eksempel blev tre unikke kolonier isoleret til referenceantigent maltosebindende protein. Generelt indeholdt antistofferne på et enkelt domæne signifikant sekvensmangfoldighed og meget variabel længde af antigenbindende sløjfer. Disse funktioner er særligt vigtige i enkelt-domæne antistof antigen interaktioner.Denne procedure gør det muligt at fremdere antistoffer på et enkelt domæne for op til fem antigener pr. dyr. En enkelt blodtapning, og bibliotek konstruktion, er udnyttet for hvert dyr. Med display-baseret udvælgelse udnyttes til at identificere antigen-specifikke, single-kæde antistoffer.Mens du gør antigen injektioner og blodprøvetagning, Det er vigtigt at holde alpakaer i en gruppe, som holder dem roligere. Dette kan gøres ved hjælp af halters og fører, og binde dem i umiddelbar nærhed under procedurerne.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Instrueret Protein Emballage inden ydermembranvesikler fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produktion og oprensning

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en Atomic Force mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metode til effektiv hvorved man genfolder og rensning af Chemoreceptor Ligand bindende domæne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering af proteiner for enkelt molekyle kraft spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal struktur af den N-terminale domæne af ryanodinreceptoren fra Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Ekspression, rensning, krystallisering og enzym assays af Fumarylacetoacetat hydrolase-domæne-holdige proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Produktion, krystallisering og struktur bestemmelse af IKK-bindings domænet NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion af dynein og Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer til observation af et enkelt molekyle

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Oprettelse af meget specifikke kemisk induceret protein Dimerization systemer ved trinvis Phage udvælgelse af en kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek