Name: immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies
Uploaded: 2019-01-26T12:30:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (P30GM103486).

<ol>
	<li>Krah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibodies+for+biomedical+applications.">Single-domain antibodies for biomedical applications.</a> Immunopharmacology and Immunotoxicology. 38 (1), 21-28 (2016).</li><li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+tracing+antigens+in+live+cells+with+fluorescent+nanobodies.">Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies.</a> Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).</li><li>Maass, D. R., Sepulveda, J., Pernthaner, A., Shoemaker, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpaca+(Lama+pacos)+as+a+convenient+source+of+recombinant+camelid+heavy+chain+antibodies+(VHHs).">Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs).</a> Journal of Immunological Methods. 324 (1-2), 13-25 (2007).</li><li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+protocol+for+the+generation+of+Nanobodies+for+structural+biology.">A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).</li><li>Hertveldt, K., Belien, T., Volckaert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+M13+phage+display:+M13+phage+display+in+identification+and+characterization+of+protein-protein+interactions.">General M13 phage display: M13 phage display in identification and characterization of protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 502, 321-339 (2009).</li><li>Kushwaha, R., Schafermeyer, K. R., Downie, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+phage+display+and+affinity+selection+using+recombinant+protein+baits.">A protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e50685 (2014).</li><li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).</li><li>Muyldermans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Camelid+immunoglobulins+and+nanobody+technology.">Camelid immunoglobulins and nanobody technology.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 128 (1-3), 178-183 (2009).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annu Rev Biochem. 82, 775-797 (2013).</li><li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments:+the+superfluous+luxury+of+paired+domains.">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody-derived+nanobiotechnology+tool+kits+for+diverse+biomedical+and+biotechnology+applications.">Nanobody-derived nanobiotechnology tool kits for diverse biomedical and biotechnology applications.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 3287-3303 (2016).</li><li>Van Saun, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+requirements+and+assessing+nutritional+status+in+camelids.">Nutritional requirements and assessing nutritional status in camelids.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 265-279 (2009).</li><li>Jones, M., Boileau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Camelid+herd+health.">Camelid herd health.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 239-263 (2009).</li><li>Daley, L. P., Gagliardo, L. F., Duffy, M. S., Smith, M. C., Appleton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+monoclonal+antibodies+in+functional+and+comparative+investigations+of+heavy-chain+immunoglobulins+in+new+world+camelids.">Application of monoclonal antibodies in functional and comparative investigations of heavy-chain immunoglobulins in new world camelids.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (3), 380-386 (2005).</li><li>Romao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Useful+Nanobodies+by+Phage+Display+of+Immune+Single+Domain+Libraries+Derived+from+Camelid+Heavy+Chain+Antibodies.">Identification of Useful Nanobodies by Phage Display of Immune Single Domain Libraries Derived from Camelid Heavy Chain Antibodies.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (43), 6500-6518 (2016).</li><li>Henry, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+TGF-beta-neutralizing+single-domain+antibodies+of+predetermined+epitope+specificity+using+next-generation+DNA+sequencing.">Isolation of TGF-beta-neutralizing single-domain antibodies of predetermined epitope specificity using next-generation DNA sequencing.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 29 (10), 439-443 (2016).</li><li>Burg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology.+Structural+basis+for+chemokine+recognition+and+activation+of+a+viral+G+protein-coupled+receptor.">Structural biology. Structural basis for chemokine recognition and activation of a viral G protein-coupled receptor.</a> Science. 347 (6226), 1113-1117 (2015).</li><li>Wesolowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+domain+antibodies:+promising+experimental+and+therapeutic+tools+in+infection+and+immunity.">Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity.</a> Medical Microbiology and Immunology. 198 (3), 157-174 (2009).</li><li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+production,+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments.">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77 (1), 13-22 (2007).</li><li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies.">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (3), 289-296 (2018).</li></ol>

Drs. Whiteheart en Hersh zijn aan de Universiteit van Kentucky en opereren van een kern in het centrum voor moleculaire geneeskunde die geen enkel domein antilichamen aanmaakt in alpaca als een vergoeding voor de service.

Zoals opgemerkt, de hoge affiniteit en de specificiteit van één domein antilichamen, gecombineerd met hun facile expressie en stabiliteit, maak hen ideaal reagentia voor de toepassingen in biomedisch onderzoek, als kritische biochemische reagentia, diagnostische hulpprogramma's, of therapeutische agenten18. Voor commerciële toepassingen zijn er sommige kwesties verband houden met intellectuele eigendom die moet worden beschouwd. Bovendien, kunnen één domein antilichamen worden ontworpen om te bevatten specifieke markers of tags die kunnen worden gebruikt als verslaggevers in cellulaire assays of diagnostiek. De sleutel tot deze toepassingen is de mogelijkheid om specifiek één domein antilichamen tegen de antigenen van belang te produceren. Een methode is hier beschreven voor de productie van één domein antilichamen met behulp van alpaca's, die een robuuste immuunrespons tegen een breed scala aan eiwit antigenen produceert. Overwegingen bij het dier verwerking en naleving van regelgeving worden beschreven. Dit zijn de sleutel tot het succes in dit deel van het proces.
Er zijn andere strategieën voor het produceren van één domein antilichamen die vereisen geen de immunisatie, maar in plaats daarvan semisynthetic bibliotheken gebruiken met verschillende systemen voor de selectie en iteratieve optimalisatie van affiniteiten19,20 . Het voordeel van het gebruik van bibliotheken die zijn afgeleid van geïmmuniseerde dieren is echter de mogelijkheid om op een betrouwbare manier isoleren zeer verrijkt, divers, en hoge-affiniteit enkel domein antilichamen. Daarnaast, niet alleen aanzienlijke reeks variaties wordt voldaan, maar een aanzienlijke meerderheid van specifieke enkel domein antilichamen geïsoleerd had unieke ingevoegde en verwijderde items, met name in CDR3.
Verder, enkel domein antilichamen geproduceerd kunnen worden via een eenvoudig proces dat alleen kleine injecties van het antigeen en na dit proces vereist, de dieren kunnen worden teruggebracht naar de kudde. Van de nota, het dier kan vrij worden gebruikt voor de productie van de vezel, maar moet worden uitgesloten van het gebruik als vlees (menselijke voedselketen) als gevolg van het gebruik van de test antigenen en niet-FDA goedgekeurde hulpstof voor de productie van het antilichaam van de één domein. Nadat de procedure is voltooid, kunnen de dieren moeten worden gecontroleerd voor één week, gegeven een veterinaire eindexamen, en vervolgens worden keerde terug naar hun huis boerderij of rustte gedurende zes maanden voorafgaand aan een andere ronde van de productie van het antilichaam van de één domein.

Alpaca's, en andere leden van de familie kameelachtige geworden een populaire bron voor het genereren van antilichamen voor biomedisch onderzoek1,2,3. Kameelachtigen hebben een unieke immuunsysteem dat zij produceren zowel normale antilichamen evenals de enige antilichamen zware-keten, waardoor de productie van veel kleinere enkel domein antilichamen, met behoud van hoge specificiteit en hoge affiniteit. Dus, kameelachtige antistoffen bieden een veelzijdige reagens nuttig is voor allerlei doeleinden. Een methode om te immunizeren alpaca en enkel domein antilichamen aan een verscheidenheid van eiwit antigenen produceren wordt hier beschreven. Deze antilichamen kunnen worden geproduceerd in kameelachtigen via een relatief eenvoudig proces dat alleen de immunisatie via kleine injecties van de doel-eiwitten (antigeen) en een bloed trekken4 vereist. Vervolgens wordt bibliotheek bouw, M13 phage display5 en panning versus de recombinante antigeen6 gebruikt om te isoleren en enkel domein antilichamen met de gewenste kenmerken te produceren. Omdat het proces maakt gebruik van de kracht van de technologie van de vertoning van de bacteriofaag, vijf of meer antigenen kunnen gelijktijdig worden gebruikt per dier, waardoor het aantal dieren gebruikt en daarmee verband houdende kosten.
Typische zoogdieren antilichamen of immunoglobulinen zijn grote moleculen bestaande uit twee soorten kettingen (2 zware kettingen en 2 lichte kettingen), die met elkaar zijn verbonden via disulfide bindingen. Deze antilichamen zijn relatief groot, exposeren molecuulgewicht van ~ 140-190 kDa voor de meer overvloedig IgG-soorten van mensen, muizen, geiten en konijnen. Als gevolg van hun meerdere subeenheid structuur ultrahoog moleculair gewicht en disulfide bindingen kunnen immunoglobulinen vrij uitdagend om te produceren in grote hoeveelheden, waardoor hun hoge kosten. In de jaren negentig, werd ontdekt dat kameelachtigen, waaronder kamelen, Lama's en Alpaca's maken, naast de typische zoogdieren type immunoglobuline, een nieuwe vorm van immunoglobuline dat is eenvoudiger in structuur, bezitten alleen zware kettingen7. Deze unieke kameelachtige antilichamen beschikken over het zelfde vermogen te specifiek vreemde stoffen met hoge affiniteit binden, maar slechts zijn samengesteld uit één eiwit ketting8. Bovendien kunnen kameelachtige antilichamen experimenteel worden afgekapt tot een nog kleinere eenheid de VHH-fragment, een afkorting voor een enkel domein antilichamen9. Vanwege hun kleine omvang, enkel domein antilichamen zijn nuttig voor een brede waaier van toepassingen van biomedisch onderzoek en zijn verkrijgbaar bij verschillende academische en commerciële bronnen1,10. Een uitzondering schijnt te zijn westelijke bevlekken aangezien enkel domein antilichamen vaker gericht zijn tegen conformatie afhankelijke epitopes, die meestal onder het denatureren voorwaarden gebruikt in Western blots verloren zijn.
Omdat ze zijn samengesteld uit een één polypeptide ketting, kunnen specifieke enkel domein antilichamen worden geselecteerd en gemakkelijk in grote hoeveelheden geproduceerd als recombinant eiwitten bij bacteriën. Enkel domein antilichamen kunnen ook worden genetisch gemanipuleerde bevatten specifieke markers of tags die kunnen worden gebruikt als 'verslaggever groepen' voor de diagnose van ziekten11. Dit gemak van manipulatie in combinatie met hun flexibiliteit van gebruik maakt enkel domein antilichamen een belangrijke hulpbron voor onderzoekers aan universiteiten en elders.
Als onderdeel van een National Institutes of Health ondersteund kern, zijn bestaande methoden aangepast om enkel domein antilichamen van alpaca's3,4te produceren. Alpaca's hebben aanzienlijke voordelen in beide gebruiksgemak ten opzichte van grotere kameelachtige familieleden evenals toegankelijkheid. Alpaca's zijn sterk verhoogd voor vezels en vlees en aldus kunnen regionaal worden verkregen van lokale alpaca boeren, die kunnen worden geïdentificeerd via hun websites of via staat Fokker verenigingen. Twee rassen van alpaca's zijn beschikbaar, Suri en Huacaya. Huacaya komen vaker voor en werden gebruikt voor dit protocol, maar het protocol is algemeen toepasbaar voor beide rassen en ook meer algemeen van toepassing op andere kameelachtigen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:932px;" width="932">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">GERBU FAMA adjuvant</td>
			<td style="width:123px;">Biotechnik, Heidelberg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:344px;">3003,6001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serum collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacutainer blood collection set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Maxisorp Immuno plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HRP-conjugated goat anti-llama IgG antibody&#160;</td>
			<td>Bethyl Labs</td>
			<td>A160-100P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TMB reagent chromogenic peroxidase substrate&#160;</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-76-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plate Reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M5</td>
			<td>Any UV/VIS capable reader is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Uni-SepMAXI+ lyphocyte separation tube</td>
			<td>Novamed</td>
			<td>U-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAshredder column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Superscript IV reverse transcriptase&#160;&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AEBSF solution</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>A-5440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TG1 phage display competent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies

In dit manuscript, is een methode voor de immunisatie van alpaca en het gebruik van moleculaire biologiemethodes om één domein van antigeen-specifieke antilichamen te produceren beschreven en gedemonstreerd. Kameelachtigen, zoals alpacas en lamas, zijn uitgegroeid tot een waardevolle bron voor biomedisch onderzoek aangezien zij produceren een nieuwe soort zware alleen-keten antilichamen die kan worden gebruikt om enkel domein antilichamen te produceren. Omdat het immuunsysteem zeer flexibel is, kunnen één domein antilichamen aan vele verschillende eiwit antigenen, en zelfs verschillende conformaties van het antigeen, worden gemaakt met een zeer hoge mate van specificiteit. Deze functies, o.a. maken enkel domein antilichamen een waardevol instrument voor biomedisch onderzoek. Een methode voor de productie van één domein antilichamen van alpaca's is gemeld. Een protocol voor immunisatie, bloedinzameling, en isolatie van de B-cel wordt beschreven. De B-cellen worden gebruikt voor de bouw van een geïmmuniseerde library, die wordt gebruikt bij de selectie van specifieke enkel domein antilichamen via de pannen. Vermeende specifieke enkel domein antilichamen verkregen via pannen worden bevestigd door de pull-down, ELISA, of gel-shift testen. De resulterende enkel domein antilichamen kunnen vervolgens rechtstreeks of als onderdeel van een gemanipuleerde reagens worden gebruikt. Het gebruik van één domein antilichaam en enkel domein antilichamen gebaseerde regenten bevatten structurele, biochemische, cellulaire, in vivo en therapeutische toepassingen. Enkel domein antilichamen kunnen in grote hoeveelheden worden geproduceerd zoals recombinante eiwitten in prokaryotische expressiesystemen, gezuiverd, en direct gebruikt of kan worden ontworpen om specifieke markers of tags die kunnen worden gebruikt als verslaggevers in cellulaire studies of bevatten diagnostiek.

Het hier gepresenteerde protocol werd gebruikt voor het genereren van één domein antilichamen tegen een aantal eiwit antigenen. Vijf antigenen werden gebruikt per alpaca. Immuun toezicht aangegeven dat de meerderheid van de antigenen robuuste reactie vanaf drie weken (Figuur 1 toonde). Productie aflopen en bibliotheek bouw na ongeveer zes weken geeft de beste balans voor de dieren dat hebben meerdere antigenen geïnjecteerd. Twee rondes van pannen werden uitgevoerd voor elk antigeen en geïsoleerde kolonies gescreend (Figuur 2). Sequentiebepaling van positieve kolonies geïdentificeerd divers enkel domein antilichamen sequenties voor de verschillende antigenen. Bijvoorbeeld werden drie unieke klonen geïsoleerd voor het referentieantigeen Maltose bindend proteïne (MBP) (figuur 3A). Zoals vaak wordt waargenomen, wordt de enkel domein antilichamen bevatten aanzienlijke reeks diversiteit en zeer variabele CDR3 lengte (Figuur 3). Deze functies zijn vooral belangrijk in één domein antilichaam/antigeen interacties zoals gezien in de verwijzing enkel domein antilichamen/CX3CL1 complexe17 (figuur 3B).
De meerderheid van de full-length enkel domein antilichamen sequenties kan worden uitgedrukt en gezuiverd op 1-10 mg/L van cultuur (figuur 4A). Vanwege de diversiteit in CDR3 lengte, heeft verschillende enkel domein antilichamen lichte variatie in moleculair gewicht weergeven. Bevestiging van directe binding en toepassing bestaan specifieke prestatie is van cruciaal belang. Bijvoorbeeld na twee rondes van de selectie tegen antigeen B, een panel van één domein antilichamen werden geïdentificeerd (Figuur 2). Meerdere identieke sequenties werden geïdentificeerd, en het antilichaam van één domein werd geproduceerd en gezuiverd. Het was vervolgens getest via directe pull down met antigeen affiniteit hars en toonde robuuste dosisafhankelijk bindende (figuur 4B). Nog belangrijker is, toonde het antilichaam van één domein geen binding met het controleren van de hars. Deze gegevens tonen een direct bindende interactie, en dat is zeer geschikt voor het vastleggen van de affiniteit in zowel pull-down en ELISA gebaseerde formaten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig1.jpg"> Figuur 1 : Representatief immuun toezicht op twee verschillende antigenen, tonen de belangrijke specifieke immuunrespons aan verschillende antigenen in hetzelfde dier. Veel antigenen Toon robuust antwoord zo spoedig drie weken na het begin van immunisatie, met de meerderheid die het weergeven van maximale reactie na zes weken. Zes weken ook zorgt voor affiniteit rijping en is de aanbevolen tijd voor de afloop van de productie en de B-cel isolatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig2.jpg"> Figuur 2 : Bevestiging van positieve klonen PCR-gebaseerde. Inleidingen omspannen de MCS-server van het pMES4 vector, en een positieve nanobody kloon produceert een amplicon van ~ 500 bp (gemarkeerd met *). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig3.jpg"> Figuur 3 : Antigeen-specifieke opeenvolgingen Markeer alpaca enkel domein antilichamen diversiteit. (A) aanpassing van Selecteer één domein antilichaam sequenties geïsoleerd te MBP met een referentie één domein antilichaam 4XT1, met kader en complementariteit-bepalen regio's (Kabat) hieronder. (B) structuur van alpaca één domein antilichaam 4XT1 gebonden aan CX3CL1 (VOB 4XT1), nadruk op de cruciale rol van variabele CDR loops in specifieke antigeen bindende. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig4.jpg"> Figuur 4 : Zuivering en validatie van één domein antilichamen. (A) SDS-pagina van IMAC gezuiverd enkel domein antilichamen, divers enkel domein antilichamen te vergelijken. Verschillende molecuulgewichten zijn voornamelijk te wijten aan de wisselende lengte van de lus van de CDR3. Verschillende niveaus van meningsuiting zijn ook waargenomen, met een minderheid van één domein antilichamen tonen van slechte oogsten van de gezuiverde eiwit. (B) keuring van directe binding met behulp van een antigeen affiniteit pull-down. Robuuste dosisafhankelijk enkel domein antilichamen bindende wordt waargenomen met antigeen-coupled hars maar niet met het besturingselement hars. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies at JoVE.com

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunisatie van alpaca's (Lama pacos) met eiwit antigenen en productie van antigeen-specifieke enkel domein antilichamen

Een methode voor de productie van één domein antilichamen van alpaca's, met inbegrip van immunisatie, bloedinzameling, B-cel isolatie en selectie wordt beschreven.

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

De methoden die we hier beschrijven werden overgenomen door onze NIH COBRE gesponsord, University of Kentucky Protein Core Facility om onderzoekers te helpen produceren single-domein antilichamen in alpaca's. Single-domain antilichamen zijn een belangrijk instrument dat wordt gebruikt om belangrijke vragen in biomedisch onderzoek te beantwoorden. Het belangrijkste voordeel van de technieken die we aantonen is dat het de productie van single-domein antilichamen tot vijf verschillende eiwitten in een enkele alpaca mogelijk maakt.De implicaties van deze techniek gelden voor de menselijke gezondheid en behandeling van ziekten, aangezien deze single-domein antilichamen kunnen worden gebruikt als therapeutica, als vaccins, en als diagnostiek. De belangrijkste hindernis voor de meeste gevestigde biomedische onderzoekers is het hanteren van grote dieren, zoals de alpaca. Visuele demonstratie van de behandeling van een alpaca, de injectie van antigenen, en de verzameling van bloed, zijn van cruciaal belang voor de succesvolle productie van single-domein antilichamen in deze cameliden.Het aantonen van de procedure zal doctor Jeff Smiley, Universiteit Dierenarts, Ms.Kathy Boaz, Veterinaire Technicus, en Ms.Erin Jones, Lab Animal Technician. De behandeling van het bloed zal worden aangetoond door Doctor Martin Chao, Research Associate. De echte verhalen van deze productie zijn Blue Eyes, Big Boy, of liefkozend bekend als de Gorilla, en Freddie, onze Kentucky alpaca's.Om te beginnen, beteugelen het dier met een halter en lood. Knip vervolgens het haar van de alpaca met elektrische tondeuse in een maanpatroon langs de basis van zijn nek, van schouder tot schouder. Houd de alpaca voorzichtig bij het hoofd en de nek vast en injecteer de antigenen langzaam onderhuids met een 22-meterige naald langs de basis van de nek, in de buurt van de lymfeklieren.Voer vijf injecties uit van ongeveer 200 microliters per stuk, ongeveer vijf centimeter uit elkaar. Controleer hierna het dier ongeveer 20 minuten op tekenen van anafylaxie. Inspecteer de injectieplaats wekelijks op gelokaliseerde ontsteking op de injectieplaatsen.Om bloed te trekken, klem de alpaca's haar en desinfecteren de collectie site met alcohol wattenstaafjes. Houd de alpaca voorzichtig vast en zorg ervoor dat de nek rechtop en recht wordt gehouden. Met behulp van de ventrale projecties van het transversale proces van de wervels als een mijlpaal, occlude de ader door het toepassen van druk gewoon mediaal aan het ventrale proces.Steek vervolgens de naald in een hoek van 45 graden, iets mediaal aan de projectie, in de richting van het midden van de nek. Manipuleer de naald tot het bloed stroomt. Verdun eerst 15 milliliter van het verzamelde bloed met vijf milliliter PBS.Vervolgens pipette bloed in een lymfocyten scheiding buis te isoleren perifere bloedlymfocyten, of PCL's, via dichtheid gradiënt centrifugatie. Verwijder voorzichtig de bovenste plasmalaag en bewaar deze in een aparte buis. Verwijder vervolgens voorzichtig de PBL-laag en breng deze over naar een steriele buis van 50 milliliter.Voeg 45 milliliter voorgekoelde PBS toe aan de PBLs en draai de buis gedurende 20 minuten op 800 keer G en vier graden Celsius. Verwijder de supernatant met een pipet, waardoor de pellet met de lymfocyten. Was de pellet nog twee keer met vijf milliliter voorgekoelde PBS om de PBLs klaar te maken voor RNA isolatie.Met behulp van dit protocol werden antilichamen met één domein gegenereerd tegen een reeks eiwitantigenen. Immuunmonitoring gaf aan dat de meerderheid van de antigenen vanaf drie weken een robuuste respons vertoonde en dat de optimale tijd om bloed te verkrijgen zes weken is. Sequencing de positieve kolonies geïdentificeerd diverse single-domein antilichaam sequenties voor verschillende antigenen.Zo werden drie unieke kolonies geïsoleerd van het referentieantigeen maltosebind eiwit. Over het algemeen bevatten de antilichamen met één domein een significante sequentiediversiteit en een zeer variabele lengte van antigeenbindende lussen. Deze functies zijn vooral belangrijk in single-domain antilichaam antigeen interacties.Deze procedure maakt de productie van single-domein antilichamen voor maximaal vijf antigenen per dier. Een enkele bloedafname, en bibliotheek constructie, wordt gebruikt voor elk dier. Met faag display-gebaseerde selectie gebruikt om antigeen-specifieke, single-chain antilichamen te identificeren.Tijdens het doen van de antigeen injecties en bloedafname, is het belangrijk om de alpaca's in een groep te houden, waardoor ze rustiger. Dit kan worden gedaan met behulp van halters en leads, en koppelverkoop ze in de nabijheid tijdens de procedures.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Geregisseerd Protein Packaging binnen Outer membraanvesicles uit<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Ontwerp, Productie en zuivering

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Kristalstructuur van de N-terminale domein van Ryanodine Receptor vanaf Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Productie, kristallisatie en structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Het creëren van zeer specifieke chemisch geïnduceerde eiwit Dimerization systemen door stepwise Phage selectie van een Combinatoriale één-domein antilichamen bibliotheek