Name: immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies
Uploaded: 2019-01-26T12:30:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health (P30GM103486) unterstützt.

<ol>
	<li>Krah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibodies+for+biomedical+applications.">Single-domain antibodies for biomedical applications.</a> Immunopharmacology and Immunotoxicology. 38 (1), 21-28 (2016).</li><li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+tracing+antigens+in+live+cells+with+fluorescent+nanobodies.">Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies.</a> Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).</li><li>Maass, D. R., Sepulveda, J., Pernthaner, A., Shoemaker, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpaca+(Lama+pacos)+as+a+convenient+source+of+recombinant+camelid+heavy+chain+antibodies+(VHHs).">Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs).</a> Journal of Immunological Methods. 324 (1-2), 13-25 (2007).</li><li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+protocol+for+the+generation+of+Nanobodies+for+structural+biology.">A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).</li><li>Hertveldt, K., Belien, T., Volckaert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+M13+phage+display:+M13+phage+display+in+identification+and+characterization+of+protein-protein+interactions.">General M13 phage display: M13 phage display in identification and characterization of protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 502, 321-339 (2009).</li><li>Kushwaha, R., Schafermeyer, K. R., Downie, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+phage+display+and+affinity+selection+using+recombinant+protein+baits.">A protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e50685 (2014).</li><li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).</li><li>Muyldermans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Camelid+immunoglobulins+and+nanobody+technology.">Camelid immunoglobulins and nanobody technology.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 128 (1-3), 178-183 (2009).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annu Rev Biochem. 82, 775-797 (2013).</li><li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments:+the+superfluous+luxury+of+paired+domains.">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody-derived+nanobiotechnology+tool+kits+for+diverse+biomedical+and+biotechnology+applications.">Nanobody-derived nanobiotechnology tool kits for diverse biomedical and biotechnology applications.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 3287-3303 (2016).</li><li>Van Saun, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+requirements+and+assessing+nutritional+status+in+camelids.">Nutritional requirements and assessing nutritional status in camelids.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 265-279 (2009).</li><li>Jones, M., Boileau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Camelid+herd+health.">Camelid herd health.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 239-263 (2009).</li><li>Daley, L. P., Gagliardo, L. F., Duffy, M. S., Smith, M. C., Appleton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+monoclonal+antibodies+in+functional+and+comparative+investigations+of+heavy-chain+immunoglobulins+in+new+world+camelids.">Application of monoclonal antibodies in functional and comparative investigations of heavy-chain immunoglobulins in new world camelids.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (3), 380-386 (2005).</li><li>Romao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Useful+Nanobodies+by+Phage+Display+of+Immune+Single+Domain+Libraries+Derived+from+Camelid+Heavy+Chain+Antibodies.">Identification of Useful Nanobodies by Phage Display of Immune Single Domain Libraries Derived from Camelid Heavy Chain Antibodies.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (43), 6500-6518 (2016).</li><li>Henry, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+TGF-beta-neutralizing+single-domain+antibodies+of+predetermined+epitope+specificity+using+next-generation+DNA+sequencing.">Isolation of TGF-beta-neutralizing single-domain antibodies of predetermined epitope specificity using next-generation DNA sequencing.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 29 (10), 439-443 (2016).</li><li>Burg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology.+Structural+basis+for+chemokine+recognition+and+activation+of+a+viral+G+protein-coupled+receptor.">Structural biology. Structural basis for chemokine recognition and activation of a viral G protein-coupled receptor.</a> Science. 347 (6226), 1113-1117 (2015).</li><li>Wesolowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+domain+antibodies:+promising+experimental+and+therapeutic+tools+in+infection+and+immunity.">Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity.</a> Medical Microbiology and Immunology. 198 (3), 157-174 (2009).</li><li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+production,+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments.">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77 (1), 13-22 (2007).</li><li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies.">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (3), 289-296 (2018).</li></ol>

DRS. Whiteheart und Hersh sind an der University of Kentucky und betreiben einen Kern im Zentrum für Molekularmedizin, die einzelne Domäne Antikörper in Alpaka als eine Fee-for-Service produziert.

Wie bereits erwähnt, die hohe Affinität und Spezifität Einzeldomäne Antikörper, kombiniert mit ihrer oberflächlichen Ausdruck und Stabilität, machen sie ideale Reagenzien für die Anwendungen in der biomedizinischen Forschung als wichtige biochemische Reagenzien, Diagnose-Tools, oder Therapeutika18. Für kommerzielle Anwendungen gibt es einige Probleme im Zusammenhang mit geistigem Eigentum, der berücksichtigt werden müssen. Darüber hinaus können Einzeldomäne Antikörper entwickelt werden, um spezifische Marker oder Tags, die als Reporter in zelluläre Assays oder in der Diagnostik verwendet werden können enthalten. Der Schlüssel für diese Anwendungen ist die Fähigkeit, spezifische Einzeldomäne Antikörper gegen Antigene von Interesse. Eine Methode wird hier beschrieben um Einzeldomäne Antikörper mit Alpakas, zu produzieren, die eine robuste Immunantwort gegen eine Vielzahl von Protein-Antigene produziert. Überlegungen zum Umgang mit Tier und Einhaltung gesetzlicher Vorschriften sind beschrieben. Diese sind der Schlüssel für den Erfolg in diesem Teil des Prozesses.
Es gibt weitere Strategien für die Herstellung von Einzeldomäne Antikörper, die die Impfung nicht erforderlich, sondern verwenden Sie stattdessen vollsynthetisches Bibliotheken mit unterschiedlichen Systemen für die Auswahl und iterative Optimierung der Affinitäten19,20 . Der Vorteil der Verwendung von Bibliotheken von immunisierten Tieren stammen, ist jedoch die Fähigkeit, zuverlässig hoch angereicherten, vielfältig und qualitativ-Affinität Einzeldomäne Antikörper zu isolieren. Darüber hinaus nicht nur erhebliche Sequenzvariationen beobachtet werden, aber eine deutliche Mehrheit der spezifischen Einzeldomäne Antikörper isoliert hatte einzigartige Einfügungen und Löschungen, insbesondere CDR3.
Weitere, einzelne Domain, die Antikörper über ein einfaches Verfahren produziert werden können, die nur kleine Injektionen des Antigens und nach diesem Prozess erfordert, können die Tiere zur Herde zurückgegeben werden. Beachten Sie das Tier für die Faserproduktion frei nutzbar, sondern muss aufgrund der Verwendung der Testantigene und nicht-FDA zugelassenen Adjuvans für Einzeldomäne Antikörperproduktion durch Verwendung als Fleisch (menschliche Nahrungskette) ausgeschlossen werden. Wenn der Vorgang abgeschlossen ist, können die Tiere sollten für eine Woche, angesichts eine tierärztliche Abschlussprüfung überwacht werden und dann entweder kehrte in ihre heimatlichen Hof oder ruhte für sechs Monate vor einer weiteren Runde von Einzeldomäne Antikörperproduktion.

Alpakas und andere Mitglieder der Familie Kameliden sind eine beliebte Quelle für die Erzeugung von Antikörpern für biomedizinische Forschung1,2,3geworden. Kameliden haben eine einzigartige Immunsystem, da sie produzieren sowohl normale Antikörper als auch schwere Kette nur Antikörper, die die Produktion von viel kleineren Einzeldomäne Antikörpern unter Beibehaltung hoher Spezifität und hohe Affinität zu ermöglichen. So bieten Kameliden Antikörper eine vielseitige Reagenz nützlich für eine Vielzahl von Zwecken. Eine Methode zur Alpaka zu immunisieren und produzieren Einzeldomäne Antikörper gegen eine Vielzahl von Protein-Antigene ist hier beschrieben. Diese Antikörper können in Camelids über ein relativ einfacher Prozess hergestellt werden, die nur die Immunisierung über kleine Injektionen an das Zielprotein (Antigen) und eine Blut zeichnen4erfordert. Anschließend Bibliotheksbau, M13 Phage Display5 und panning versus rekombinante Antigen6 dient zum isolieren und Einzeldomäne Antikörper mit den gewünschten Eigenschaften zu produzieren. Da der Prozess nutzt die Kraft des Phagen-Display-Technologie, fünf oder mehr Antigene gleichzeitig genutzt werden pro Tier, wodurch die Anzahl der Tiere verwendet und damit verbundene Kosten.
Typische Säugetier-Antikörper oder Immunglobuline sind große Moleküle, bestehend aus zwei Arten von Ketten (2 schweren Ketten und 2 leichten Ketten), die durch Disulfid-Bindungen miteinander verknüpft sind. Diese Antikörper sind relativ groß, ausstellenden Molekulargewichte von ca. 140-190 kDa für die reichlicher IgG-Spezies von Menschen, Mäusen, Ziegen und Kaninchen. Immunglobuline kann aufgrund ihrer Multi-Untereinheit Struktur, hohes Molekulargewicht und Disulfid-Bindungen sehr anspruchsvoll, in großen Mengen, so dass ihre hohen Kosten zu produzieren. In den 1990er Jahren wurde entdeckt, dass Kameliden, Kamele, Lamas und Alpakas umfasst neben Säugetieren typische Immunglobulin, eine neuartige Form von Immunglobulin, die in Struktur machen, besitzen nur schweren Ketten7einfacher ist. Diese einzigartige Kameliden-Antikörper besitzen die gleiche Fähigkeit, insbesondere fremde Substanzen mit hoher Affinität binden, sondern bestehen nur aus einem Protein Kette8. Darüber hinaus können Kameliden Antikörper experimentell eine noch kleinere Einheit V-H-H-Fragment, auch genannt eine Einzeldomäne Antikörper9abgeschnitten werden. Aufgrund ihrer geringen Größe Einzeldomäne Antikörper eignen sich für vielfältige Anwendungen in der biomedizinischen Forschung und finden Sie aus einer Vielzahl von akademischen und kommerziellen Quellen1,10. Eine Ausnahme scheint Western blotting da Einzeldomäne Antikörper häufiger gegen Konformation abhängigen Epitope gerichtet sind, die in der Regel unter denaturierenden Bedingungen in Western Blots verwendet verloren sind.
Da sie aus einer einzigen Polypeptidkette bestehen, können bestimmte Einzeldomäne Antikörper werden ausgewählt und leicht in großen Mengen als rekombinante Proteine in Bakterien hergestellt. Einzeldomäne Antikörper können auch genetisch entwickelt werden, um spezifische Marker oder Tags, die als "Reporter-Gruppen" verwendet werden können, für die Diagnose von Krankheiten11enthalten. Diese einfache Handhabung gepaart mit ihrer Flexibilität in der Anwendung bildet Einzeldomäne Antikörper eine wichtige Ressource für Forscher an Universitäten und anderswo.
Als Bestandteil einer National Institutes of Health Kern unterstützt, wurden bestehende Methoden Einzeldomäne Antikörper von Alpakas3,4angepasst. Alpakas haben deutliche Vorteile sowohl einfache Handhabung im Vergleich zu größeren Kameliden Familienmitglieder sowie Barrierefreiheit. Alpakas sind weit verbreitet für Faser- und Fleisch angehoben und somit erhalten Sie regional bei lokalen Alpaka Landwirte, die über ihre Websites oder durch Züchter Landesverbände identifiziert werden können. Stehen zwei Arten von Alpakas, Suri und Huacaya. Huacaya treten häufiger auf und wurden für dieses Protokoll verwendet, aber das Protokoll ist generell für beide Rassen und auch allgemein anwendbar auf andere Camelids.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:932px;" width="932">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">GERBU FAMA adjuvant</td>
			<td style="width:123px;">Biotechnik, Heidelberg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:344px;">3003,6001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serum collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacutainer blood collection set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Maxisorp Immuno plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HRP-conjugated goat anti-llama IgG antibody&#160;</td>
			<td>Bethyl Labs</td>
			<td>A160-100P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TMB reagent chromogenic peroxidase substrate&#160;</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-76-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plate Reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M5</td>
			<td>Any UV/VIS capable reader is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Uni-SepMAXI+ lyphocyte separation tube</td>
			<td>Novamed</td>
			<td>U-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAshredder column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Superscript IV reverse transcriptase&#160;&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AEBSF solution</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>A-5440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TG1 phage display competent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies

In diesem Manuskript ist eine Methode für die Immunisierung von Alpaka und den Einsatz von molekularbiologischen Methoden Einzeldomäne Antigen-spezifische Antikörper produzieren beschrieben und gezeigt. Kameliden, sind wie Alpakas und Lamas, eine wertvolle Ressource für die biomedizinische Forschung geworden, da sie eine neue Art von schweren Kette nur Antikörper produzieren, die verwendet werden, um einzelne Domäne Antikörper produzieren können. Weil das Immunsystem sehr flexibel ist, können mit sehr hoher Spezifität Einzeldomäne Antikörper zu vielen verschiedenen Protein-Antigene und sogar verschiedene Konformationen des Antigens, erfolgen. Diese Eigenschaften, unter anderem machen Einzeldomäne Antikörper ein unschätzbares Werkzeug für die biomedizinische Forschung. Eine Methode für die Produktion von Antikörpern Einzeldomäne von Alpakas wird berichtet. Ein Protokoll für die Immunisierung, Blutentnahme und B-Zell-Isolation wird beschrieben. Die B-Zellen werden für den Bau einer immunisierten Bibliothek verwendet, die bei der Auswahl der spezifischen Einzeldomäne Antikörper über schwenken verwendet wird. Vermeintliche spezifische Einzeldomäne Antikörper per schwenken werden bestätigt von Pulldown-ELISA oder Gel-Schicht-Assays. Die daraus resultierende Einzeldomäne Antikörper können dann entweder direkt oder als Teil einer veränderter Reagens verwendet werden. Die Verwendung von Einzeldomäne Antikörper und Einzeldomäne Antikörper-basierten Regenten gehören strukturelle, biochemische, zelluläre, in vivo und therapeutische Anwendungen. Einzeldomäne Antikörper können in großen Mengen produziert werden, als rekombinante Proteine in prokaryotischen Expressionssysteme, gereinigt, und direkt verwendet oder entwickelt werden kann, um enthalten spezifische Marker oder Tags, die als Reporter in zelluläre Studien oder verwendet werden können Diagnostik.

Das Protokoll hier vorgestellten wurde eingesetzt, um einzelne Domäne Antikörper gegen eine Reihe von Protein-Antigene zu generieren. Fünf Antigene wurden pro Alpaka eingesetzt. Immune Überwachung angegeben, dass die Mehrheit der Antigene starke Reaktion ab drei Wochen (Abbildung 1 zeigte). Produktion blutet und Bibliotheksbau nach etwa sechs Wochen gibt der besten Balance für die Tiere, die haben mehrere Antigene injiziert. Zwei Runden der Verschiebung für jedes Antigen durchgeführt wurden, und isoliert Kolonien gezeigt (Abbildung 2). Sequenzierung der positiven Kolonien identifiziert verschiedene Einzeldomäne Antikörper Sequenzen für verschiedene Antigene. Zum Beispiel wurden drei einzigartige Klone auf der Referenz-Antigen Maltose Binding Protein (MBP) (Abbildung 3A) isoliert. Wie häufig zu beobachten ist, enthalten die Einzeldomäne Antikörper erhebliche Sequenz Vielfalt und sehr variabel CDR3 Länge (Abbildung 3). Diese Eigenschaften sind besonders wichtig in Einzeldomäne Antikörper/Antigen Interaktionen wie in der Referenz Einzeldomäne Antikörper/CX3CL1 komplexe17 (Abb. 3 b) zu sehen.
Die Mehrheit der in voller Länge Einzeldomäne Antikörper Sequenzen kann zum Ausdruck gebracht und bei 1-10 mg/L der Kultur (Abb. 4A) gereinigt werden. Aufgrund der Vielfalt in CDR3 Länge zeigen verschiedene Einzeldomäne Antikörper Abwandlung im Molekulargewicht. Bestätigung der direkten Bindung und spezifische Anwendungsleistung ist von entscheidender Bedeutung. Z. B. nach zwei Runden der Selektion gegen Antigen B identifiziert ein Gremium von Einzeldomäne waren Antikörper (Abbildung 2). Mehrere identische Sequenzen wurden identifiziert, und der Einzeldomäne Antikörper hergestellt und gereinigt wurde. Es war dann über direkten Zug nach unten mit Antigen Affinität Harz getestet und zeigte solide Dosis-abhängige Bindung (Abbildung 4 b). Wichtig ist, zeigte der Einzeldomäne Antikörper keine Bindung an das Harz zu kontrollieren. Diese Daten zeigen eine direkte Bindung Interaktion und derjenige, der gut für Affinität Capture im Pulldown-Menü und ELISA-basierten Formate geeignet ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig1.jpg"> Abbildung 1 : Repräsentative immun Überwachung von zwei unterschiedlichen Antigene zeigen deutliche spezifische Immunantwort gegen verschiedene Antigene im gleichen Tier. Viele Antigene zeigen starke Reaktion bereits drei Wochen nach Beginn der Immunisierung, die meisten zeigen maximale Reaktion nach sechs Wochen. Sechs Wochen auch Affinität Reifung ermöglicht und ist die empfohlene Zeit für die Produktion bluten und B-Zell-Isolation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig2.jpg"> Abbildung 2 : PCR-basierter Bestätigung von positiven Klonen. Primer überspannen die MCS des pMES4 Vektors, und ein positiven gemeinnützige Klon produziert eine Amplifikate von ~ 500 bp (markiert mit *). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig3.jpg"> Abbildung 3 : Antigen-spezifische Sequenzen hervorheben Alpaka Einzeldomäne Antikörper Vielfalt. (A) Ausrichtung wählen Sie einzelne Domäne Antikörper Sequenzen isoliert an MBP mit einer Referenz Einzeldomäne Antikörper 4XT1, Rahmen und Komplementarität bestimmen Regionen (Kabat) unten hervorgehoben. (B) Struktur des Alpaka Einzeldomäne Antikörper 4XT1 an CX3CL1 gebunden (PDB 4XT1), betont die wichtige Rolle der Variable CDR Schleifen in spezifischen Antigen-Bindung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig4.jpg"> Abbildung 4 : Reinigung und Validierung von Einzeldomäne Antikörper. (A) SDS-PAGE IMAC gereinigt Einzeldomäne Antikörper, diverse Einzeldomäne Antikörper zu vergleichen. Unterschiedlichen Molekulargewichte sind in erster Linie aufgrund unterschiedlicher Länge der CDR3-Schleife. Unterschiedlichen Ebenen des Ausdrucks sind auch mit einer Minderheit von Einzeldomäne Antikörpern zeigt schlechte Erträge der gereinigten Protein beobachtet. (B) Prüfung der direkten Bindung mit Affinität Antigen Pulldown-Menü. Robuste dosisabhängig Einzeldomäne Antikörperbindung wird mit Antigen-gekoppelten Harz aber nicht mit Kontrolle Harz beobachtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies at JoVE.com

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunisierung von Alpakas (Lama Pacos) mit Protein-Antigene und Antigen-spezifische einzelne Domain Antikörperproduktion

Eine Methode für die Produktion von Antikörpern Einzeldomäne von Alpakas, einschließlich Immunisierung, Blutentnahme, B-Zellen isoliert und Auswahl wird beschrieben.

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Die Methoden, die wir hier beschreiben, wurden von unserem nIH COBRE gesponserten, University of Kentucky Protein Core Facility übernommen, um Forschern zu helfen, Einzel-Domänen-Antikörper in Alpakas zu produzieren. Einzel-Domänen-Antikörper sind ein wichtiges Instrument, um Schlüsselfragen in der biomedizinischen Forschung zu beantworten. Der Hauptvorteil der Von uns demonstrierten Techniken besteht darin, dass sie die Produktion von Einzeldomänen-Antikörpern an bis zu fünf verschiedene Proteine in einem einzigen Alpaka ermöglichen.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die menschliche Gesundheit und die Behandlung von Krankheiten, da diese ein-Domänen-Antikörper als Therapeutika, als Impfstoffe und als Diagnostik verwendet werden können. Die größte Hürde für die meisten etablierten biomedizinischen Forscher ist der Umgang mit großen Tieren wie dem Alpaka. Visuelle Demonstration des Umgangs mit einem Alpaka, die Injektion von Antigenen, und die Sammlung von Blut, sind entscheidend für die erfolgreiche Produktion von Ein-Domänen-Antikörper in diesen Kameliden.Demonstriert wird das Verfahren von Doktor Jeff Smiley, Universitätstierärztin, Frau Kathy Boaz, Veterinärtechnikerin, und Frau Erin Jones, Labortiertechnikerin. Der Umgang mit dem Blut wird von Doktor Martin Chao, Research Associate, demonstriert. Die wahren Geschichten dieser Produktion sind Blue Eyes, Big Boy oder liebevoll als Gorilla bekannt, und Freddie, unsere Kentucky Alpakas.Zunächst halten Sie das Tier mit einem Halfter und Blei. Dann trimmen Sie das Haar des Alpakas mit elektrischen Clippers in einem Halbmondmuster entlang der Basis seines Halses, von Schulter zu Schulter. Halten Sie das Alpaka vorsichtig an Kopf und Hals und injizieren Sie die Antigene langsam subkutan mit einer 22-Meter-Nadel entlang der Basis des Halses, in der Nähe der Lymphknoten des Bogens.Führen Sie fünf Injektionen von jeweils etwa 200 Mikrolitern durch, die etwa fünf Zentimeter voneinander entfernt sind. Danach, überwachen Sie das Tier für etwa 20 Minuten auf Anzeichen einer Anaphylaxie. Überprüfen Sie die Injektionsstelle wöchentlich auf lokalisierte Entzündungen an den Injektionsstellen.Um Blut zu ziehen, schneiden Sie die Haare des Alpakas und desinfizieren Sie die Sammelstelle mit Alkoholtupfern. Halten Sie das Alpaka sanft zurück, um sicherzustellen, dass der Hals aufrecht und gerade gehalten wird. Verwenden Sie die ventralen Projektionen des Transverendes der Wirbel als Landmark, verschließen Sie die Vene, indem Sie Druck nur medial auf den ventralen Prozess anwenden.Als nächstes legen Sie die Nadel in einem 45-Grad-Winkel, leicht medial zur Projektion, in Richtung der Mitte des Halses. Manipulieren Sie die Nadel, bis das Blut fließt. Zuerst 15 Milliliter des gesammelten Blutes mit fünf MilliliterPBS verdünnen.Dann, Pipettenblut in eine Lymphozyten-Trennröhre, um periphere Blutlymphozyten zu isolieren, oder PBLs, über Dichte Gradient Zentrifugation. Entfernen Sie vorsichtig die obere Plasmaschicht und speichern Sie sie in einem separaten Rohr. Entfernen Sie dann vorsichtig die PBL-Schicht und übertragen Sie sie in ein steriles 50-Milliliter-Rohr.Fügen Sie 45 Milliliter vorgekühlten PBS zu den PBLs hinzu und drehen Sie die Röhre 20 Minuten bei 800 mal G und vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, so dass das Pellet die Lymphozyten enthält. Waschen Sie das Pellet noch zwei Mal mit fünf Millilitern vorgekühltem PBS, um die PBLs für die RNA-Isolierung vorzubereiten.Mit diesem Protokoll wurden Einzeldomänen-Antikörper gegen eine Reihe von Proteinantigenen erzeugt. Die Immunüberwachung zeigte, dass die Mehrheit der Antigene ab drei Wochen eine robuste Reaktion zeigte und dass die optimale Zeit, um Blut zu erhalten, bei sechs Wochen liegt. Die Sequenzierung der positiven Kolonien identifizierte verschiedene Einzel-Antikörper-Sequenzen für verschiedene Antigene.Zum Beispiel wurden drei einzigartige Kolonien zum Referenzantigen Maltose-bindendes Protein isoliert. Im Allgemeinen enthielten die Einzeldomänen-Antikörper eine signifikante Sequenzvielfalt und eine sehr variable Länge von Antigen-Bindungsschleifen. Diese Eigenschaften sind besonders wichtig bei Single-Domain-Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen.Dieses Verfahren ermöglicht die Herstellung von Einzel-Antikörpern für bis zu fünf Antigene pro Tier. Für jedes Tier wird eine einzige Blutentnahme und Bibliotheksbau genutzt. Mit phagendisplay-basierter Auswahl verwendet, um antigenspezifische, einkettige Antikörper zu identifizieren.Während der Antigen-Injektionen und Blutentnahme, Es ist wichtig, die Alpakas in einer Gruppe zu halten, die sie ruhiger hält. Dies kann mit Halfter und Leads erfolgen und sie während der Prozeduren in unmittelbarer Nähe binden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Entwurf, Herstellung und Reinigung

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Forschung

Biochemie

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Kristallstruktur des N-terminale Domäne des Ryanodin-Rezeptoren von Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expression, Reinigung, Kristallisation und Enzym-Assays von Fumarylacetoacetat-Hydrolase-Domänen-haltigen Proteinen

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek