Name: immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies
Uploaded: 2019-01-26T12:30:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies at JoVE.com

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (P30GM103486) ने समर्थन दिया था.

<ol>
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डीआरएस. Whiteheart और Hersh केंटुकी के विश्वविद्यालय में है और आणविक दवा है कि अल्पाका में एक शुल्क के रूप में सेवा के लिए एक डोमेन एंटीबॉडी का उत्पादन के लिए केंद्र में एक कोर काम करते हैं ।

के रूप में उल्लेख किया है, उच्च समानता और एकल डोमेन एंटीबॉडी की विशिष्टता, उनके सतही अभिव्यक्ति और स्थिरता के साथ संयुक्त, जैव चिकित्सा अनुसंधान में अनुप्रयोगों के लिए उंहें आदर्श reagents बनाने, महत्वपूर्ण जैव रासायनिक एजेंट के रूप में, नैदानिक उपकरण, या चिकित्सकीय एजेंटों18। व्यावसायिक अनुप्रयोगों के लिए, बौद्धिक संपदा से संबंधित कुछ मुद्दे हैं, जिन पर विचार किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, एकल डोमेन एंटीबॉडी विशिष्ट मार्करों या टैग है कि सेलुलर परख में या निदान में पत्रकारों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है शामिल करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है । इन का उपयोग करता है की कुंजी के लिए ब्याज की एंटीजन के खिलाफ विशिष्ट एकल डोमेन एंटीबॉडी का उत्पादन करने की क्षमता है । एक विधि यहां वर्णित है alpacas, जो प्रोटीन एंटीजन की एक विस्तृत विविधता के खिलाफ एक मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा करता है का उपयोग कर एकल डोमेन एंटीबॉडी का उत्पादन । पशु हैंडलिंग और विनियामक अनुपालन के लिए विचार बताए गए हैं । इस प्रक्रिया के इस भाग में सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं ।
वहां एक डोमेन एंटीबॉडी कि प्रतिरक्षण की आवश्यकता नहीं है उत्पादन के लिए अंय रणनीतियों रहे हैं, लेकिन इसके बजाय चयन और समानताएं19,20 के चलने अनुकूलन के लिए विभिंन प्रणालियों के साथ semisynthetic पुस्तकालयों का उपयोग करें . हालांकि, प्रतिरक्षित पशुओं से व्युत्पंन पुस्तकालयों का उपयोग करने के लाभ के लिए मज़बूती से उच्च समृद्ध, विविध, और उच्च समानता एकल डोमेन एंटीबॉडी की क्षमता है । इसके अतिरिक्त, न केवल महत्वपूर्ण अनुक्रम रूपांतरों मनाया जाता है, लेकिन विशिष्ट एकल डोमेन एंटीबॉडी के एक महत्वपूर्ण बहुमत अलग अद्वितीय सम्मिलन और विलोपन, विशेष रूप से CDR3 में था.
इसके अलावा, एक डोमेन एंटीबॉडी एक सीधी प्रक्रिया है कि केवल प्रतिजन के छोटे इंजेक्शन की आवश्यकता के द्वारा उत्पादित किया जा सकता है, और इस प्रक्रिया के बाद, जानवरों के झुंड को वापस किया जा सकता है । नोट के, पशु मुक्त रूप से फाइबर उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन मांस के रूप में उपयोग से बाहर रखा जाना चाहिए (मानव खाद्य श्रृंखला) परीक्षण एंटीजन और गैर एफडीए के उपयोग के कारण एकल डोमेन एंटीबॉडी उत्पादन के लिए सहायक अनुमोदित. जब प्रक्रिया पूरी हो गई है, एक सप्ताह के लिए पशुओं की निगरानी की जानी चाहिए, एक अंतिम पशु चिकित्सा परीक्षा दी, और फिर या तो अपने घर खेत में लौट सकते है या छह महीने के लिए विश्राम किया एक डोमेन एंटीबॉडी उत्पादन के दूसरे दौर से पहले ।

Alpacas, और camelid परिवार के अंय सदस्यों, जैव चिकित्सा अनुसंधान1,2,3के लिए एंटीबॉडी पैदा करने के लिए एक लोकप्रिय स्रोत बन गए हैं । Camelids में एक अद्वितीय प्रतिरक्षा प्रणाली है कि वे दोनों सामांय एंटीबॉडी उत्पादन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भारी श्रृंखला केवल एंटीबॉडी जो बहुत छोटे एकल डोमेन एंटीबॉडी के उत्पादन की अनुमति है, जबकि उच्च विशिष्टता और उच्च समानता को बनाए रखने । इस प्रकार, camelid एंटीबॉडी एक बहुमुखी एजेंट प्रयोजनों की एक किस्म के लिए उपयोगी प्रदान करते हैं । अल्पाका छुटकारा करने के लिए एक विधि और प्रोटीन एंटीजन की एक किस्म के लिए एकल डोमेन एंटीबॉडी का उत्पादन यहाँ वर्णित है. इन एंटीबॉडी camelids में एक अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया है कि केवल लक्ष्य प्रोटीन (प्रतिजन) और एक रक्त4ड्रा के छोटे इंजेक्शन के माध्यम से प्रतिरक्षण की आवश्यकता के माध्यम से उत्पादित किया जा सकता है । इसके बाद, पुस्तकालय निर्माण, M13 फेज प्रदर्शन5 और रिकॉमबिनेंट प्रतिजन6 बनाम panning अलग और वांछित विशेषताओं के साथ एक डोमेन एंटीबॉडी का उत्पादन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. क्योंकि इस प्रक्रिया फेज प्रदर्शन प्रौद्योगिकी की शक्ति का लाभ लेता है, पांच या अधिक एंटीजन एक साथ पशु प्रति उपयोग किया जा सकता है, जिससे जानवरों की संख्या में इस्तेमाल किया और संबद्ध लागत को कम करने ।
ठेठ स्तनधारी एंटीबॉडी या इम्युनोग्लोबुलिन बड़ी जंजीरों के दो प्रकार (2 भारी चेन और 2 प्रकाश श्रृंखला) है, जो एक साथ डाइसल्फ़ाइड बांड के माध्यम से जुड़े हुए है से मिलकर अणु हैं । ये एंटीबॉडी अपेक्षाकृत बड़े हैं, मनुष्यों, चूहों, बकरियों, और खरगोशों से अधिक प्रचुर मात्रा में आईजीजी प्रजातियों के लिए ~ 140-190 केडीए के आणविक भार का प्रदर्शन. उनके बहु-उप इकाई संरचना, उच्च आणविक वजन, और डाइसल्फ़ाइड बांड के कारण, इम्युनोग्लोबुलिन बल्कि बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है, उनकी लागत उच्च बना रही है । में 1990 है, यह पता चला था कि camelids, जो ऊंट, llamas और alpacas, ठेठ स्तनधारी प्रकार immunoglobulin, immunoglobulin के एक उपंयास के रूप में शामिल है कि संरचना में सरल है, केवल भारी श्रृंखला7रखने के अलावा । इन अद्वितीय camelid एंटीबॉडी विशेष रूप से उच्च अपनत्व के साथ विदेशी पदार्थों को बांधने के लिए एक ही क्षमता के अधिकारी लेकिन केवल एक प्रोटीन श्रृंखला8से बना रहे हैं । इसके अलावा, camelid एंटीबॉडी प्रयोग किया जा सकता है एक भी छोटे इकाई वीएचएच टुकड़ा, भी कहा जाता है एक एकल डोमेन एंटीबॉडी9करने के लिए काट दिया । उनके छोटे आकार के कारण, एकल डोमेन एंटीबॉडी जैव चिकित्सा अनुसंधान अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी होते हैं और शैक्षिक और वाणिज्यिक स्रोतों की एक किस्म से उपलब्ध हैं1,10. एक अपवाद पश्चिमी सोख्ता के बाद से एक डोमेन एंटीबॉडी अधिक बार अनुरूप निर्भर epitopes, जो आम तौर पर पश्चिमी दाग में इस्तेमाल किया denaturing शर्तों के तहत खो रहे है के खिलाफ निर्देशित कर रहे है प्रकट होता है ।
चूंकि वे एक एकल पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के बने होते हैं, विशिष्ट एकल डोमेन एंटीबॉडी का चयन किया जा सकता है और आसानी से बैक्टीरिया में रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के रूप में बड़ी मात्रा में उत्पादित. एकल डोमेन एंटीबॉडी भी आनुवंशिक रूप से विशिष्ट मार्करों या टैग है कि11रोगों के निदान के लिए "रिपोर्टर समूह" के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है शामिल इंजीनियर हो सकता है । उपयोग के अपने लचीलेपन के साथ युग्मित हेरफेर की यह आसानी एकल डोमेन एंटीबॉडी विश्वविद्यालयों में और कहीं पर शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण संसाधन बनाता है ।
स्वास्थ्य के एक राष्ट्रीय संस्थानों के भाग के रूप में समर्थित कोर, मौजूदा तरीकों को alpacas3,4से एकल डोमेन एंटीबॉडी का उत्पादन अनुकूलित किया गया है । Alpacas बड़ा camelid परिवार के सदस्यों के साथ ही पहुंच के सापेक्ष निपटने के दोनों आसानी में महत्वपूर्ण लाभ है । Alpacas व्यापक रूप से फाइबर और मांस के लिए उठाया जाता है और इस प्रकार स्थानीय अल्पाका किसानों, जो अपनी वेबसाइटों के माध्यम से या राज्य ब्रीडर संघों के माध्यम से पहचाना जा सकता से क्षेत्र प्राप्त किया जा सकता है । alpacas की दो नस्लें उपलब्ध हैं, सूरी और Huacaya । Huacaya अधिक आम है और इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन प्रोटोकॉल आम तौर पर या तो नस्लों और भी अधिक व्यापक रूप से लागू अंय camelids के लिए लागू है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:932px;" width="932">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">GERBU FAMA adjuvant</td>
			<td style="width:123px;">Biotechnik, Heidelberg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:344px;">3003,6001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serum collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacutainer blood collection set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Maxisorp Immuno plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HRP-conjugated goat anti-llama IgG antibody&#160;</td>
			<td>Bethyl Labs</td>
			<td>A160-100P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TMB reagent chromogenic peroxidase substrate&#160;</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-76-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plate Reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M5</td>
			<td>Any UV/VIS capable reader is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Uni-SepMAXI+ lyphocyte separation tube</td>
			<td>Novamed</td>
			<td>U-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAshredder column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Superscript IV reverse transcriptase&#160;&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AEBSF solution</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>A-5440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TG1 phage display competent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies

इस पांडुलिपि में, अल्पाका के प्रतिरक्षण के लिए एक विधि और आणविक जीवविज्ञान पद्धतियों के उपयोग के लिए प्रतिजन-विशिष्ट एकल डोमेन एंटीबॉडी का उत्पादन और वर्णन किया गया है. Camelids, जैसे alpacas और llamas, जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान संसाधन बन गए है क्योंकि वे भारी श्रृंखला के एक उपंयास प्रकार का उत्पादन केवल एंटीबॉडी जो एकल डोमेन एंटीबॉडी का उत्पादन किया जा सकता है । क्योंकि प्रतिरक्षा प्रणाली अत्यधिक लचीला है, एकल डोमेन एंटीबॉडी कई अलग प्रोटीन एंटीजन के लिए बनाया जा सकता है, और यहां तक कि प्रतिजन के विभिन्न संरचनाओं, विशिष्टता के एक बहुत ही उच्च डिग्री के साथ. इन सुविधाओं, दूसरों के बीच में, एक डोमेन एंटीबॉडी जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक अमूल्य उपकरण बनाते हैं । alpacas से एक डोमेन एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए एक विधि की सूचना दी है । प्रतिरक्षण, रक्त संग्रह और बी-सेल अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । बी-कोशिकाओं एक प्रतिरक्षित पुस्तकालय है, जो panning के माध्यम से विशिष्ट एकल डोमेन एंटीबॉडी के चयन में प्रयोग किया जाता है के निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है । ख्यात विशिष्ट एकल डोमेन एंटीबॉडी panning के माध्यम से प्राप्त खींच-नीचे, एलिसा, या जेल शिफ्ट परख द्वारा की पुष्टि कर रहे हैं । परिणामस्वरूप एक डोमेन एंटीबॉडी तो या तो सीधे या एक इंजीनियर एजेंट के एक भाग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । एकल डोमेन एंटीबॉडी और एकल डोमेन एंटीबॉडी-आधारित रीजेंट्स के उपयोग में शामिल है संरचनात्मक, जैव रासायनिक, सेलुलर, vivo में, और चिकित्सीय अनुप्रयोगों । एकल डोमेन एंटीबॉडी prokaryotic अभिव्यक्ति प्रणालियों में रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के रूप में बड़ी मात्रा में उत्पादित किया जा सकता, शुद्ध, और सीधे इस्तेमाल किया या विशिष्ट मार्करों या टैग कि सेलुलर अध्ययन में पत्रकारों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है या में शामिल करने के लिए इंजीनियर जा सकता है निदान.

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रोटीन एंटीजन की एक श्रृंखला के खिलाफ एकल डोमेन एंटीबॉडी उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया था. पांच एंटीजन प्रति अल्पाका का उपयोग किया गया । प्रतिरक्षा निगरानी संकेत दिया है कि एंटीजन के बहुमत तीन सप्ताह में शुरुआत मजबूत प्रतिक्रिया दिखाई (चित्रा 1). उत्पादन खून और पुस्तकालय निर्माण लगभग छह सप्ताह के बाद जानवरों है कि कई एंटीजन इंजेक्शन के लिए सबसे अच्छा संतुलन देता है । panning के दो दौर प्रत्येक प्रतिजन के लिए प्रदर्शन किया गया, और पृथक कालोनियों (चित्रा 2) दिखलाई । विभिन्न प्रतिजनों के लिए विविध एकल डोमेन एंटीबॉडी अनुक्रम की पहचान की सकारात्मक कालोनियों के अनुक्रमण । उदाहरण के लिए, तीन अद्वितीय क्लोन संदर्भ प्रतिजन माल्टोज़ बाइंडिंग प्रोटीन (MBP) (चित्रा 3ए) को अलग किया गया । अक्सर के रूप में मनाया जाता है, एक डोमेन एंटीबॉडी महत्वपूर्ण अनुक्रम विविधता और उच्च चर CDR3 लंबाई (चित्रा 3) होते हैं । इन सुविधाओं में एक डोमेन एंटीबॉडी/antigen इंटरैक्शन संदर्भ एकल डोमेन एंटीबॉडी/CX3CL1 परिसर17 (चित्र 3 बी) में देखा के रूप में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं ।
पूर्ण लंबाई एकल डोमेन एंटीबॉडी दृश्यों के बहुमत और व्यक्त किया जा सकता है 1-10 mg/L की संस्कृति (चित्र 4a) पर शुद्ध । CDR3 लंबाई में विविधता की वजह से, अलग एकल डोमेन एंटीबॉडी आणविक वजन में मामूली भिन्नता दिखा. प्रत्यक्ष बाइंडिंग और अनुप्रयोग विशिष्ट प्रदर्शन की पुष्टि महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, Antigen B के विरुद्ध चयन के दो राउंड के बाद, एकल डोमेन एंटीबॉडी के एक पैनल की पहचान की गई (चित्रा 2) । एकाधिक समान अनुक्रम की पहचान की गई, और एकल डोमेन एंटीबॉडी का उत्पादन और शुद्ध किया गया था । यह तो सीधे के माध्यम से परीक्षण किया गया था प्रतिजन संबंध राल के साथ नीचे खींच और मजबूत खुराक पर निर्भर बाध्यकारी (चित्रा 4B) दिखाया. महत्वपूर्ण बात, एकल डोमेन एंटीबॉडी राल को नियंत्रित करने के लिए कोई बाध्यकारी दिखाया । इन आंकड़ों को एक प्रत्यक्ष बाध्यकारी संपर्क, और एक है कि अच्छी तरह से दोनों पुल नीचे और एलिसा आधारित स्वरूपों में आत्मीयता पर कब्जा के लिए अनुकूल है प्रदर्शित करता है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig1.jpg"> चित्रा 1 : प्रतिनिधि प्रतिरक्षा निगरानी के दो अलग एंटीजन एक ही जानवर में अलग प्रतिजनों के लिए महत्वपूर्ण विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया दिखा. कई प्रतिजनों शुरू प्रतिरक्षण के बाद तीन सप्ताह के रूप में जल्दी के रूप में मजबूत प्रतिक्रिया दिखाने के छह सप्ताह के बाद अधिकतम प्रतिक्रिया दिखा बहुमत के साथ । छह सप्ताह भी संबंध परिपक्वता के लिए अनुमति देता है और उत्पादन खून और बी सेल अलगाव के लिए सिफारिश की समय है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig2.jpg"> चित्रा 2 : पीसीआर आधारित सकारात्मक क्लोन की पुष्टि । प्राइमरों pMES4 वेक्टर के MCS अवधि, और एक सकारात्मक nanobody क्लोन ~ ५०० bp (* के साथ चिह्नित) के एक amplicon पैदा करता है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig3.jpg"> चित्रा 3 : Antigen-विशिष्ट अनुक्रम हाइलाइट अल्पाका एकल डोमेन एंटीबॉडी विविधता । (एक) का चयन एकल डोमेन एंटीबॉडी अनुक्रम एक संदर्भ एकल डोमेन एंटीबॉडी 4XT1, फ्रेमवर्क और complementarity-निर्धारण क्षेत्रों (Kabat) के साथ के साथ MBP के लिए पृथक का संरेखण नीचे हाइलाइट । (ख) अल्पाका एकल डोमेन एंटीबॉडी 4XT1 की संरचना CX3CL1 करने के लिए बाध्य (PDB 4XT1), विशिष्ट प्रतिजन बंधन में चर सीडीआर छोरों की महत्वपूर्ण भूमिका पर बल. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig4.jpg"> चित्र 4 : शुद्धि और एकल डोमेन एंटीबॉडी के सत्यापन । (क) एसडीएस-IMAC के पृष्ठ एकल डोमेन एंटीबॉडी शुद्ध, विविध एकल डोमेन एंटीबॉडी की तुलना । विभिन्न आणविक भार मुख्य रूप से CDR3 पाश की लंबाई अलग करने के लिए कारण हैं. अभिव्यक्ति के भिंन स्तर भी एक डोमेन एंटीबॉडी के एक अल्पसंख्यक के साथ मनाया जाता है, शुद्ध प्रोटीन के गरीब पैदावार दिखा । (B) किसी antigen समानता pull-डाउन का उपयोग कर प्रत्यक्ष बाइंडिंग का सत्यापन । मजबूत खुराक-निर्भर एकल डोमेन एंटीबॉडी बाइंडिंग antigen-युग्मित राल के साथ नहीं बल्कि नियंत्रण राल के साथ मनाया जाता है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig4large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Alpacas (लामा pacos) का प्रतिरक्षण प्रोटीन एंटीजन और प्रतिजन-विशिष्ट एकल डोमेन एंटीबॉडी के उत्पादन के साथ

alpacas से एकल डोमेन एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए एक विधि, जिसमें प्रतिरक्षण, रक्त संग्रह, बी-सेल अलगाव, और चयन का वर्णन किया गया है.

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

हम यहां जिन तरीकों का वर्णन करते हैं, वे हमारे NIH COBRE प्रायोजित, केंटकी विश्वविद्यालय प्रोटीन कोर फैसिलिटी द्वारा अपनाए गए थे ताकि शोधकर्ताओं को अल्पाका में एकल डोमेन एंटीबॉडी का उत्पादन करने में मदद मिल सके। एकल डोमेन एंटीबॉडी एक महत्वपूर्ण उपकरण है जो जैव चिकित्सा अनुसंधान में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने के लिए उपयोग किया जाता है। हमारे द्वारा प्रदर्शित की जाने वाली तकनीकों का मुख्य लाभ यह है कि यह एकल डोमेन एंटीबॉडी के उत्पादन को एक अल्पाका में पांच अलग-अलग प्रोटीन तक की अनुमति देता है।इस तकनीक के निहितार्थ मानव स्वास्थ्य और रोग उपचार के लिए विस्तार के बाद से इन एकल डोमेन एंटीबॉडी चिकित्सा के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, टीके के रूप में, और निदान के रूप में । सबसे स्थापित जैव चिकित्सा जांचकर्ताओं के लिए सबसे महत्वपूर्ण बाधा इस तरह के अल्पाका के रूप में बड़े जानवरों, संभाल रहा है । इन कमीडियन में एकल डोमेन एंटीबॉडी के सफल उत्पादन के लिए अल्पाका, एंटीजन के इंजेक्शन और रक्त के संग्रह को संभालने का दृश्य प्रदर्शन महत्वपूर्ण है।प्रक्रिया का प्रदर्शन डॉक्टर जेफ स्माइली, विश्वविद्यालय पशुचिकित्सा, सुश्री कैथी Boaz, पशु चिकित्सा तकनीशियन, और सुश्री आयन जोंस, प्रयोगशाला पशु तकनीशियन होगा । रक्त की हैंडलिंग डॉक्टर मार्टिन चाओ, रिसर्च एसोसिएट द्वारा प्रदर्शित किया जाएगा । इस उत्पादन की असली कहानियां नीली आंखें, बड़ा लड़का है, या प्यार से गोरिल्ला के रूप में जाना जाता है, और ईेडी, हमारे केंटकी अल्पाका ।शुरू करने के लिए, एक लगाम और सीसा के साथ जानवर को नियंत्रित करें। फिर कंधे से कंधे तक, गर्दन के आधार के साथ एक वर्धमान चंद्रमा पैटर्न में बिजली के क़ैंची के साथ अल्पाका के बालों को ट्रिम करें। सिर और गर्दन से अल्पाका को ध्यान से पकड़ें, और धीरे-धीरे धनुष लिम्फ नोड्स के पास गर्दन के आधार पर 22 गेज सुई के साथ एंटीजन को चमड़े के इंजेक्शन दें।लगभग 200 माइक्रोलीटर प्रत्येक के पांच इंजेक्शन, के बारे में पांच सेंटीमीटर के अलावा प्रदर्शन करते हैं। इसके बाद, एनाफिलैक्सिस के संकेतों के लिए लगभग 20 मिनट तक जानवर की निगरानी करें। इंजेक्शन साइटों पर साप्ताहिक रूप से स्थानीयकृत सूजन के लिए इंजेक्शन साइट का निरीक्षण करें।रक्त आकर्षित करने के लिए, अल्पाका के बालों को क्लिप करें और शराब झाड़ू के साथ संग्रह स्थल को कीटाणुरहित करें। अल्पाका को धीरे-धीरे नियंत्रित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि गर्दन सीधे और सीधे आयोजित की जाती है। कशेरुकी की ट्रांसवर्स प्रक्रिया के वेंट्रल अनुमानों को एक मील का पत्थर के रूप में उपयोग करना, वेंट्रल प्रक्रिया में सिर्फ मध्य दर्जे का दबाव लागू करके नस को ऑक्सीलेट करें।इसके बाद, गर्दन के केंद्र की ओर, प्रक्षेपण के लिए थोड़ा मध्याढि़ए, 45 डिग्री कोण पर सुई डालें। सुई में हेरफेर तब तक करें जब तक खून नहीं बहता। सबसे पहले, पीबीएस के पांच मिलीलीटर के साथ एकत्र रक्त के 15 मिलीलीटर पतला ।फिर, घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र के माध्यम से परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स, या पीबीएलएस को अलग करने के लिए एक लिम्फोसाइट सेपरेशन ट्यूब में रक्त को पिपेट करें। धीरे-धीरे ऊपर प्लाज्मा परत को हटा दें, इसे एक अलग ट्यूब में सहेजें। फिर, धीरे-धीरे पीबीएल परत को हटा दें, और इसे बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें।पीबीएलएस में प्री-ठंडा पीबीएस के 45 मिलीलीटर जोड़ें और 800 बार जी, और चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ट्यूब स्पिन। लिम्फोसाइट्स युक्त गोली को छोड़कर, एक पिपेट के साथ सुपरनेट निकालें। आरएनए अलगाव के लिए पीबीएल तैयार करने के लिए पूर्व-ठंडा पीबीएस के पांच मिलीलीटर के साथ दो बार गोली धोएं।इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, प्रोटीन एंटीजन की एक श्रृंखला के खिलाफ एकल डोमेन एंटीबॉडी उत्पन्न हुए थे। प्रतिरक्षा निगरानी ने संकेत दिया कि अधिकांश एंटीजन ने तीन सप्ताह में शुरू होने वाली मजबूत प्रतिक्रिया दिखाई, और रक्त प्राप्त करने का इष्टतम समय छह सप्ताह में है। सकारात्मक उपनिवेशों को अनुक्रमित करने से विभिन्न एंटीजन के लिए विविध एकल-डोमेन एंटीबॉडी दृश्यों की पहचान की गई।उदाहरण के लिए, तीन अद्वितीय उपनिवेशों को संदर्भ एंटीजन माल्टोज-बाइंडिंग प्रोटीन के लिए अलग किया गया था। आम तौर पर, एकल डोमेन एंटीबॉडी में महत्वपूर्ण अनुक्रम विविधता और एंटीजन-बाध्यकारी छोरों की अत्यधिक परिवर्तनीय लंबाई होती थी। ये विशेषताएं एकल डोमेन एंटीबॉडी एंटीजन इंटरैक्शन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं।यह प्रक्रिया प्रति पशु पांच एंटीजन तक के लिए एकल डोमेन एंटीबॉडी के उत्पादन की अनुमति देती है। प्रत्येक जानवर के लिए एक ही रक्त संग्रह, और पुस्तकालय निर्माण का उपयोग किया जाता है। एंटीजन-विशिष्ट, एकल-श्रृंखला एंटीबॉडी की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले फैज डिस्प्ले-आधारित चयन के साथ।एंटीजन इंजेक्शन और ब्लड सैंपलिंग करते समय अल्पाका को एक ग्रुप में रखना जरूरी है, जो उन्हें शांत रखता है । यह हॉल्टर और लीड का उपयोग करके किया जा सकता है, और प्रक्रियाओं के दौरान उन्हें निकटता में बांधना।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

से बाहरी झिल्ली Vesicles भीतर निर्देशित प्रोटीन पैकेजिंग<em&gt; कोलाई</em&gt;: डिजाइन, उत्पादन और शोधन

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

एक परमाणु बल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एकल प्रोटीन अणुओं के बल स्पेक्ट्रोस्कोपी

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Chemoreceptor Ligand बाइंडिंग डोमेन के कुशल रिसामने और शुद्धिकरण के लिए विधि

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए प्रोटीन की आबंध स्थिरीकरण

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

एन के क्रिस्टल संरचना-टर्मिनल डोमेन के Ryanodine रिसेप्टर से Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

प्रोटीन तह, परिवहन, और रेडियोधर्मी पल्स चेस द्वारा जीवित कोशिकाओं में क्षरण का विश्लेषण

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

अभिव्यक्ति, शुद्धि, क्रिस्टलीकरण, और फ्जाइम परख के Fumarylacetoaceate hydrolase डोमेन युक्त प्रोटीन

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

एनईएमओ के आईकेके-बाध्यकारी डोमेन का उत्पादन, क्रिस्टलीकरण और संरचना निर्धारण

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

एकल अणु अवलोकन के लिए डीएनए Origami Nanostructures पर Dynein और Kinesin मोटर एनसेंबल्स का उत्पादन

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...