Name: immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies
Uploaded: 2019-01-26T12:30:00
Duration: 5 min 27 s
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この作品は、健康の国民の協会 (P30GM103486) によって支えられました。

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ドクター ホワイトとハーシュ ケンタッキー大学であり、料金のサービスとしてアルパカで単一ドメイン抗体分子薬のための中心部のコアの動作します。

前述のように、安易な表現と安定性、単一ドメイン抗体の特異性と親和性の高い行いアプリケーションの理想的な試薬生物医学研究における重要な生化学試薬、診断ツール、または治療薬18。商用アプリケーションのための問題を知的に関連するプロパティに考慮しなければならないがあります。さらに、特定のマーカーまたはレポーター細胞アッセイまたは診断として使用することができますタグを格納する単一ドメイン抗体を設計することができます。これらの使用にキーは、特定の単一ドメイン興味の抗原に対する抗体を生成する能力です。メソッドは、ここで説明アルパカを使用して単一ドメイン抗体を生成するさまざまな蛋白質の抗原に対する強力な免疫応答を生成します。動物取扱および規制へのコンプライアンスに関する考慮事項を説明します。これらは、プロセスのこの部分で成功するための鍵です。
その他、予防接種を必要としないが、代わりに選択と親和性19,20 の反復最適化のさまざまなシステムと半合成ライブラリを使用する単一ドメイン抗体を生産戦略があります。.ただし、免疫動物から派生したライブラリを使用する利点は、高濃縮の多様かつ高親和性の単一ドメイン抗体を確実に分離する機能です。さらに、重要な変異が観察される、だけでなく分離された特定の単一ドメイン抗体の大部分は、ユニークな挿入および削除、特に CDR3。
さらに、単一のドメインのみこのプロセスの後、抗原の小さな注射を必要とする簡単なプロセスを介して抗体を作り出すことができる動物が群れに返されます。注記のうち、動物繊維の生産のため自由に使用することができますが、単一ドメイン抗体の生産の抗原テストと非 FDA 承認された補助の使用のため (人間の食物連鎖) の肉として使用から除外する必要があります。プロシージャが完了したら、動物獣医の試験を与えられた 1 週間、監視する必要があることがでくに自分のホームの農場に戻りましたか単一ドメイン抗体生産の別のラウンドの前に 6 ヶ月間の休養します。

、アルパカ、ラクダ科の家族の他のメンバー生物医学研究1,2,3のための抗体を生成するための人気の源となっています。ラクダ科動物は、重鎖高い特異性と親和性の高さを維持しながら、はるかに小さいの単一ドメイン抗体の生産を許可する唯一の抗体と同様、両方の従来の抗体を生成するのユニークな免疫システムを持ってください。したがって、ラクダ科動物抗体は、さまざまな目的に役立つ汎用性の高い試薬を提供します。アルパカを免疫し、単一ドメイン様々 な蛋白質の抗原に抗体を生成する方法は、ここで説明しました。これらの抗体は、のみターゲット蛋白質 (抗原) と血を描く4小さな注射で予防接種を必要とする比較的簡単なプロセスを介してラクダ科動物を作り出すことができます。その後、図書館の建設、M13 バクテリオファージ表示5と組換え抗原6対パンが分離し、所望の特性を持つ単一ドメイン抗体を生成する使用されます。プロセスでバクテリオファージの表示技術の力を活用しているので動物ごと 5 つ以上の抗原を同時に使用することができます、使用される動物の数を減らすとコストを関連付けられています。
典型的な哺乳類の抗体または免疫グロブリンがジスルフィド結合を一緒にリンクされている鎖 (2 重鎖および軽鎖の 2) の 2 種類から成る大規模な分子。これらの抗体が比較的大きく、140 ~ 190 の分子量を示す人間、マウス、ヤギ、ウサギからより豊かな IgG 種 kDa。それら複数のサブユニット構造、高分子量とジスルフィド結合のため免疫グロブリンは高い費用を作り、大量に生産するではなく挑戦することができます。1990 年代、典型的な哺乳類型免疫グロブリン、免疫グロブリンのみ重鎖7を有する構造で単純で、小説形式のほかに、ラクダ科動物は、ラクダ、ラマやアルパカが含まれています確認が発見されました。これらのユニークなラクダ科動物抗体高親和性異物をとりわけ結合する同じ能力を有するが、のみ 1 つの蛋白質鎖8から成っています。さらに、ラクダ科動物抗体は単一ドメイン抗体9とも呼ばれる、さらに小さい単位V Hフラグメントに実験的に切り捨てられます。サイズが小さいため単一ドメイン抗体生物医学研究用途の広い範囲のために役に立つ、様々 な学術および商業ソース1,10から利用できます。例外は、単一ドメイン抗体はより頻繁に通常使用される西部のしみの変性条件下で失われるコンフォメーション依存エピトープに対して指示されるので西部にしみが付くことに表示されます。
以来、彼らは単一のポリペプチドの鎖から成っている、特定の単一ドメイン抗体を選択し、簡単に細菌の遺伝子組換え蛋白質として大量に生産できます。単一のドメイン抗体には、特定のマーカーまたは11疾患を診断するため「記者グループ」として使用することができますタグを含む遺伝子組み換えできます。使用の柔軟性と相まって操作のしやすさは、大学や他の研究者の重要なリソース単一ドメイン抗体を作る。
健康の国民の協会の部分は、コアをサポート、従来アルパカ3,4から単一ドメイン抗体の生産に適応されています。アルパカは、大きいラクダ科の家族のメンバーだけでなく、アクセシビリティに対する処理の両方を容易に重要な利点を持っています。アルパカ繊維や肉の発生が広く、従ってローカル アルパカ農民は、自分のウェブサイトを通じて、または状態のブリーダー団体を通じて識別できますから地方得ることが。アルパカの 2 つの品種があります、スリ、Huacaya。Huacaya はより一般的であり、このプロトコルの使用されたが、プロトコルが一般的に適用されるいずれかの品種と他のラクダにもより広く適用されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:932px;" width="932">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">GERBU FAMA adjuvant</td>
			<td style="width:123px;">Biotechnik, Heidelberg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:344px;">3003,6001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serum collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacutainer blood collection set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Maxisorp Immuno plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HRP-conjugated goat anti-llama IgG antibody&#160;</td>
			<td>Bethyl Labs</td>
			<td>A160-100P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TMB reagent chromogenic peroxidase substrate&#160;</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-76-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plate Reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M5</td>
			<td>Any UV/VIS capable reader is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Uni-SepMAXI+ lyphocyte separation tube</td>
			<td>Novamed</td>
			<td>U-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAshredder column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Superscript IV reverse transcriptase&#160;&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AEBSF solution</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>A-5440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TG1 phage display competent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies

本稿では、アルパカの予防接種との抗原特異的単一ドメイン抗体を生産する分子生物学方法の使用法は説明し、実証します。ラクダ、アルパカやリャマなどとなっている生物医学研究のための貴重なリソース単一ドメイン抗体を生成する使用ことができます重いチェーン専用の抗体の新しいタイプを出すため。免疫システムは非常に柔軟な単一ドメイン抗体は特異性の非常に高度で多くの異なる蛋白質の抗原と抗原の異なる立体配座を作ることが。他の人の間で、これらの機能は、生物医学研究のための貴重なツール単一ドメイン抗体を作る。アルパカから単一ドメイン抗体の製造方法が報告されます。予防接種、血液のコレクション、および B 細胞の隔離のためのプロトコルを説明します。B 細胞は、パンを介して特定の単一ドメイン抗体の選択で使用される免疫ライブラリの構築に使用されます。プルダウン ・ メニューでパンを介して得られる推定上特定の単一ドメイン抗体を確認、elisa 法やゲル ゲルシフト試金。直接または設計された試薬の一部として、結果の単一ドメイン抗体を使用しできます。単一ドメイン抗体・単一ドメイン抗体を用いた試薬の使用には、構造、生化学、細胞、生体、および治療のアプリケーションが含まれます。原核生物の発現系で組み換えタンパク精製、および直接使用または特定のマーカーや細胞の研究や、記者として使用することができます。 タグを含めるために設計することができます。、単一ドメイン抗体を大量に生産することができます。診断。

ここで提示されたプロトコルは、単一ドメイン抗体蛋白質の抗原の範囲を生成するために利用されました。アルパカあたり 5 つの抗原が活かされています。免疫監視には、抗原の大半が 3 週間 (図 1) で頑健な応答の初めを示したことが示されます。生産の裁ち落とし位置および図書館の建設後約 6 週間、動物の最適なバランスを与える複数の抗原注入があります。パンの 2 つのラウンドを行った各抗原のためと分離したコロニー上映 (図 2)。肯定的なコロニーのシーケンスには、異なった抗原の多様な単一ドメイン抗体シーケンスが識別されます。例については、3 つのユニークなクローンを参照抗原マルトース結合タンパク質 (MBP) (図 3 a) を分離した.多く認められ, 単一ドメイン抗体を含む重要な配列の多様性と非常に可変 CDR3 長さ (図 3)。これらの機能は、単一のドメイン抗体/抗原相互作用参照単一ドメイン抗体/CX3CL1 複雑な17 (図 3 b) に見られるように特に重要です。
フルレングスの単一ドメイン抗体シーケンスの大半を表現し、1-10 mg/L の文化 (図 4 a) で精製できます。CDR3 長さの多様性のため異なる単一ドメイン抗体は分子量のわずかな変化を示します。直接バインド、アプリケーション固有のパフォーマンスの確認が重要です。たとえば、抗原 B に対して選択の 2 つのラウンドの後抗体が単一ドメインのパネルには (図 2) が識別されます。複数の同じシーケンスが識別された、単一ドメイン抗体は生産し精製します。それはし抗原親和性の樹脂を直接プル経由でテストされた、堅牢な用量依存的結合 (図 4 b) を示しました。重要なは、単一のドメイン抗体は、樹脂を制御するバインドを示さなかった。これらのデータは、直接結合相互作用と 1 つのプルダウンと elisa 法ベースの両方の形式で親和性をキャプチャに適していますを示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig1.jpg"> 図 1: 同じ動物の異なる抗原に対する重要な特定の免疫反応を示す 2 つの異なる抗原の代表的な免疫監視します。多くの抗原は 3 週間 6 週間後最大応答を示す多数の予防接種を開始後に早くも頑健な応答を表示します。6 週間も親和性成熟でき生産出血と B 細胞の分離の推奨時間です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig2.jpg"> 図 2: 肯定的なクローンの PCR に基づく確認します。プライマー pMES4 ベクトルの MCS にまたがるし、肯定的な生物学: ナノボディでクローン生成 ~ 500 の私アンプリコン bp (付いている *)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig3.jpg"> 図 3: 抗原特異的シーケンス アルパカ単一ドメイン抗体の多様性を強調表示します。(A) フレームワークと相補性決定領域 (Kabat) 下記参照単一ドメイン抗体 4XT1 と、MBP に分離された [単一ドメイン抗体配列のアライメント。CX3CL1 に結合したアルパカ単一ドメイン抗体 4XT1 の (B) 構造 (PDB 4XT1) が特定の抗原の結合のループ変数 CDR の重要な役割を強調しました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig4.jpg"> 図 4: 精製および単一ドメイン抗体検証します。(A) の SDS-PAGE IMAC 精製した単一ドメイン抗体多様な単一ドメイン抗体を比較します。異なる分子量は CDR3 ループのさまざまな長さのために主にあります。またこの式の異なるレベルが浄化された蛋白質の低収率を示す単一ドメイン抗体の少数で観察します。(B) 抗原親和性プルダウンを使用して直接バインディングを検証します。抗原結合樹脂とレジンではなく、堅牢な用量依存単一ドメイン抗体の結合が観察されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

アルパカ (ラーマ pacos) 蛋白質の抗原と抗原特異的単一ドメイン抗体産生の予防接種

アルパカから単一ドメイン抗体の生産のための法、予防接種、血のコレクション、B 細胞の分離、および選択を含む、説明します。

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

ここで説明する方法は、研究者がアルパカで単一ドメイン抗体を産生するのを助けるために、NIH COBRE主催のケンタッキー大学プロテインコア施設によって採用されました。単一ドメイン抗体は、生物医学研究における重要な質問に答えるために使用される重要なツールです。我々が実証する技術の主な利点は、単一のアルパカ内で最大5つの異なるタンパク質に単一ドメイン抗体を産生できることである。これらの単一ドメイン抗体は、治療薬として、ワクチンとして、そして診断として使用することができるので、この技術の意味は、人間の健康と疾患治療に及ぶ。最も確立された生物医学研究者にとって最も重要なハードルは、アルパカのような大型動物の取り扱いです。アルパカの取り扱い、抗原の注入、血液の採取の視覚的実証は、これらのラクダ中の単一ドメイン抗体の産生を成功させるために重要である。この手順のデモンストレーションは、ジェフ・スマイリー博士、大学獣医、キャシー・ボアズ氏、獣医技術者、エリン・ジョーンズさん(ラボ動物技術者)です。血液の取り扱いは、ドクター・マーティン・チャオ、リサーチアソシエイトによって実証されます。この作品の本当の物語は、ブルーアイズ、ビッグボーイズ、または愛情を込めてゴリラとして知られている、とフレディ、私たちのケンタッキー州のアルパカです。まず、ホルターとリードで動物を拘束します。その後、肩から肩まで、首のベースに沿って三日月のパターンで電気バリカンでアルパカの髪をトリミングします。頭頸部でアルパカを慎重に保持し、首の基部に沿って、弓リンパ節の近くに22ゲージ針を用いて皮下にゆっくりと抗原を注入する。約200マイクロリットル、約5センチメートル離れて5回の注射を行います。この後、アナフィラキシーの兆候について約20分間動物を監視します。注射部位の局所的な炎症を毎週注射部位で検査する。血液を引き出すために、アルパカの髪をクリップし、アルコール綿棒でコレクションサイトを消毒します。アルパカを軽く拘束し、首が直立してまっすぐに保持されるようにします。脊椎の横方向のプロセスの腹側の投影をランドマークとして使用して、腹側プロセスにちょうど内側の圧力を適用することによって静脈を閉塞させる。次に、針を45度の角度で挿入し、突起にわずかに内側を向き、首の中心に向かって挿入する。血液が流れるまで針を操作します。まず、採取した血液の15ミリリットルを5ミリリットルのPBSで希釈する。次いで、ピペットの血液をリンパ球分離チューブに入れ、密度勾配遠心分離を介して末梢血リンパ球、またはPDLを単離する。上のプラズマ層を静かに取り外し、別のチューブに保存します。次にPBL層を軽く取り出し、滅菌50ミリリットルチューブに移します。PPBに45ミリリットルの冷蔵PBSを加え、800倍Gで20分間、摂氏4度でチューブを回転させます。上清をピペットで取り出し、リンパ球を含むペレットを残します。ペレットを5ミリリットルのプレチルドPBSでさらに2回洗浄し、RNA分離のためのPMLを準備します。このプロトコルを用いて、一ドメイン抗体は、タンパク質抗原の範囲に対して生成された。免疫モニタリングは、抗原の大半が3週から始まる堅牢な応答を示し、血液を得るのに最適な時間が6週間であることを示した。正のコロニーをシーケンシングすると、異なる抗原に対する多様な単一ドメイン抗体配列が同定された。例えば、3つのユニークなコロニーを、参照抗原マルトース結合タンパク質に単離した。一般に、単一ドメイン抗体は、抗原結合ループの有意な配列多様性および非常に可変長を含んでいた。これらの特徴は、単一ドメイン抗体抗原相互作用において特に重要である。この手順により、1匹の動物につき最大5つの抗原に対する単一ドメイン抗体の産生が可能になります。単一の採血、およびライブラリーの構造は、各動物のために利用される。ファージディスプレイベースの選択により、抗原特異的な単鎖抗体を同定するために利用される。抗原注射と血液サンプリングを行っている間、アルパカをグループに保つことが重要であり、彼らを穏やかに保ちます。これは、ホルターとリードを使用して行い、手順中に近接してそれらを結び付けることができます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;：デザイン、生産および精製

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

コナガからのリアノジン受容体の N 末端ドメインの結晶構造

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMOのIKK結合ドメインの生産・結晶化・構造決定

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

単一分子観測のためのDNA折り紙ナノ構造に関するダインとキネシンモーターアンサンブルの製造

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...