Name: immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies
Uploaded: 2019-01-26T12:30:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies at JoVE.com

Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (P30GM103486).

<ol>
	<li>Krah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibodies+for+biomedical+applications.">Single-domain antibodies for biomedical applications.</a> Immunopharmacology and Immunotoxicology. 38 (1), 21-28 (2016).</li><li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+tracing+antigens+in+live+cells+with+fluorescent+nanobodies.">Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies.</a> Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).</li><li>Maass, D. R., Sepulveda, J., Pernthaner, A., Shoemaker, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpaca+(Lama+pacos)+as+a+convenient+source+of+recombinant+camelid+heavy+chain+antibodies+(VHHs).">Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs).</a> Journal of Immunological Methods. 324 (1-2), 13-25 (2007).</li><li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+protocol+for+the+generation+of+Nanobodies+for+structural+biology.">A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).</li><li>Hertveldt, K., Belien, T., Volckaert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+M13+phage+display:+M13+phage+display+in+identification+and+characterization+of+protein-protein+interactions.">General M13 phage display: M13 phage display in identification and characterization of protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 502, 321-339 (2009).</li><li>Kushwaha, R., Schafermeyer, K. R., Downie, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+phage+display+and+affinity+selection+using+recombinant+protein+baits.">A protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e50685 (2014).</li><li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).</li><li>Muyldermans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Camelid+immunoglobulins+and+nanobody+technology.">Camelid immunoglobulins and nanobody technology.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 128 (1-3), 178-183 (2009).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annu Rev Biochem. 82, 775-797 (2013).</li><li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments:+the+superfluous+luxury+of+paired+domains.">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody-derived+nanobiotechnology+tool+kits+for+diverse+biomedical+and+biotechnology+applications.">Nanobody-derived nanobiotechnology tool kits for diverse biomedical and biotechnology applications.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 3287-3303 (2016).</li><li>Van Saun, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+requirements+and+assessing+nutritional+status+in+camelids.">Nutritional requirements and assessing nutritional status in camelids.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 265-279 (2009).</li><li>Jones, M., Boileau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Camelid+herd+health.">Camelid herd health.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 239-263 (2009).</li><li>Daley, L. P., Gagliardo, L. F., Duffy, M. S., Smith, M. C., Appleton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+monoclonal+antibodies+in+functional+and+comparative+investigations+of+heavy-chain+immunoglobulins+in+new+world+camelids.">Application of monoclonal antibodies in functional and comparative investigations of heavy-chain immunoglobulins in new world camelids.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (3), 380-386 (2005).</li><li>Romao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Useful+Nanobodies+by+Phage+Display+of+Immune+Single+Domain+Libraries+Derived+from+Camelid+Heavy+Chain+Antibodies.">Identification of Useful Nanobodies by Phage Display of Immune Single Domain Libraries Derived from Camelid Heavy Chain Antibodies.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (43), 6500-6518 (2016).</li><li>Henry, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+TGF-beta-neutralizing+single-domain+antibodies+of+predetermined+epitope+specificity+using+next-generation+DNA+sequencing.">Isolation of TGF-beta-neutralizing single-domain antibodies of predetermined epitope specificity using next-generation DNA sequencing.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 29 (10), 439-443 (2016).</li><li>Burg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology.+Structural+basis+for+chemokine+recognition+and+activation+of+a+viral+G+protein-coupled+receptor.">Structural biology. Structural basis for chemokine recognition and activation of a viral G protein-coupled receptor.</a> Science. 347 (6226), 1113-1117 (2015).</li><li>Wesolowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+domain+antibodies:+promising+experimental+and+therapeutic+tools+in+infection+and+immunity.">Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity.</a> Medical Microbiology and Immunology. 198 (3), 157-174 (2009).</li><li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+production,+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments.">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77 (1), 13-22 (2007).</li><li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies.">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (3), 289-296 (2018).</li></ol>

DRS. Whiteheart и Hersh в университете Кентукки и работать ядро в центре молекулярной медицины, которая производит антитела один домен в Альпака как плату за службу.

Как отмечалось, высокое сродство и специфичность антител одного домена, в сочетании с их легким выражение и стабильности, делают их идеальным реагентов для приложений в биомедицинских исследований, как критические биохимические реагенты, диагностические средства, или терапевтические18. Для коммерческих приложений есть некоторые вопросы, касающиеся интеллектуальной собственности, которые должны быть рассмотрены. Кроме того одного домена антитела могут быть спроектированы содержат конкретные маркеры или теги, которые могут использоваться в качестве репортеров в клеточном анализов или диагностики. Ключ для этих целей является способность производить конкретные один домен антител против антигенов интерес. Описан метод здесь производить антитела одного домена с помощью альпак, который производит надежные иммунный ответ против широкий спектр белков антигенов. Описываются вопросы для обработки животных и соответствия нормативным требованиям. Они являются ключевыми для успеха в этой части процесса.
Есть другие стратегии для производства одного домена антитела, которые не требуют иммунизации, но вместо этого использовать полусинтетические библиотеки с различными системами для отбора и итеративной оптимизации сходства19,20 . Однако преимущество использования библиотек, производный от привитых животных является способность надежно изолировать антитела высоко обогащенного, разнообразной и высокоспецифичные одного домена. Кроме того, не только наблюдаются значительные последовательности вариации, но значительное большинство конкретных одного домена антитела изолированные уникальный вставок и удалений, особенно в CDR3.
Кроме того, одного домена антитела могут быть произведены через простой процесс, который требует только малые инъекции антигена и после этого процесса, животные могут быть возвращены в стадо. Следует отметить животное может свободно использоваться для производства волокна, но должны быть исключены из использования как мясо (человека пищевой цепи) за счет использования теста антигены и не FDA утвержденных адъювант для производства антител одного домена. Когда процедура завершена, животных должны контролироваться на одну неделю, учитывая ветеринарный экзамен и затем можно вернуть их домой ферме или отдыхал за шесть месяцев до очередной раунд антител одного домена.

Альпаки и другие члены семьи животноводческие, стали популярным источником для создания антител для биомедицинских исследований1,2,3. Верблюдовых имеют уникальный иммунной системы в том, что они производят нормальных антител, а также тяжелые цепи только антитела, которые позволяют производство гораздо меньше одного домена антитела, сохраняя при этом высокую специфичность и высоким сродством. Таким образом животноводческие антитела обеспечивают универсальный реагента, полезная для различных целей. Здесь описан метод для иммунизации Альпака и производят антитела одного домена для различных белков антигенов. Эти антитела могут быть произведены в верблюдовых через относительно простой процесс, который требует только иммунизации через малые инъекции целевого белка (антиген) и дро крови4. Впоследствии строительство библиотеки, M13 Фаговые дисплей5 и панорамирование против антигена рекомбинантных6 используется для изолировать и производят антитела один домен с желаемыми характеристиками. Потому что процесс пользуется властью Фаговые технологии отображения, пять или более антигены могут быть одновременно использованы на животное, тем самым уменьшая количество животных, используемых и связанные с этим расходы.
Типичный млекопитающих антител или иммуноглобулины являются большие молекулы, состоящие из двух видов цепей (2 тяжелых цепей и 2 легкие цепи), которые связаны друг с другом через дисульфидными облигаций. Эти антитела относительно велики, экспонирование молекулярным весом ~ 140-190 кДа более обильные IgG видов от людей, мышей, коз и кроликов. Из-за их участием Субблок структуры, высокой молекулярной массой и дисульфидными облигаций иммуноглобулины может быть довольно сложной для производства в больших количествах, что делает их высокой стоимости. В 1990-х годов было обнаружено, что верблюдовых, которая включает в себя верблюдов, Лам и альпак сделать, помимо млекопитающих типичные иммуноглобулинов, роман форме иммуноглобулина, который проще в структуры, обладающие только тяжелые цепи7. Эти уникальные верблюдовые антитела обладают же возможность конкретно привязать инородных веществ с высоким сродством, но состоят только из одного белка цепи8. Кроме того животноводческие антител может быть экспериментально усечен даже меньше единицы VHH-фрагмент, также называется однодоменным антитела9. Из-за их малого размера одного домена антитела являются полезными для широкого круга применения биомедицинских исследований и доступны из различных научных и коммерческих источников1,10. Исключение, как представляется, быть Западный blotting, поскольку чаще всего одного домена антитела направлены против зависимых epitopes конформации, который обычно теряются под денатурируя условия, используемые в западной помарки.
Так как они состоят из одной полипептидной цепи, конкретные одного домена антитела могут быть выбраны и легко производятся в больших количествах как рекомбинантных белков в бактериях. Одного домена антитела также может быть генетически содержат конкретные маркеры или теги, которые могут использоваться как «репортер групп» для диагностики заболеваний11. Эта простота манипуляции, в сочетании с их гибкостью использования делает одного домена антитела важным ресурсом для исследователей в университетах и в других местах.
Как часть национальных институтов здравоохранения поддерживает ядро, существующие методы были адаптированы для производства антител одного домена из альпаки3,4. Альпаки имеют значительные преимущества в обоих легкость обработки относительно крупных животноводческих членов семьи, а также доступность. Альпаки широко выращиваются для волокна и мясо и таким образом могут быть получены на региональном уровне Альпака местных фермеров, которые могут быть определены через свои веб-сайты или через государственные заводчик ассоциации. Доступны две породы альпак, Сури и Huacaya. Huacaya являются более распространенными и были использованы для этого протокола, но протокол в целом применимы к любой породы и также более широко применяться для других верблюдовых.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:932px;" width="932">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">GERBU FAMA adjuvant</td>
			<td style="width:123px;">Biotechnik, Heidelberg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:344px;">3003,6001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serum collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacutainer blood collection set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Maxisorp Immuno plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HRP-conjugated goat anti-llama IgG antibody&#160;</td>
			<td>Bethyl Labs</td>
			<td>A160-100P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TMB reagent chromogenic peroxidase substrate&#160;</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-76-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plate Reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M5</td>
			<td>Any UV/VIS capable reader is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Uni-SepMAXI+ lyphocyte separation tube</td>
			<td>Novamed</td>
			<td>U-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAshredder column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Superscript IV reverse transcriptase&#160;&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AEBSF solution</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>A-5440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TG1 phage display competent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies

В этой рукописи метод для иммунизации Альпака и использования методов молекулярной биологии для производства одного домена антиген специфические антитела описано и продемонстрировано. Верблюдовых, альпак и Лам, стали ценным ресурсом для биомедицинских исследований, поскольку они производят Роман тип тяжелые цепи только антитела, которые могут использоваться для производства антител одного домена. Потому что иммунная система является очень гибкой, одного домена антитела можно сделать много различных белков антигенов, и даже различные конформации антигена, с очень высокой степенью конкретности. Эти особенности, среди прочего, сделать одного домена антитела бесценным инструментом для биомедицинских исследований. Метод для производства антител одного домена из альпаки сообщается. Протокол для иммунизации, сбора крови и B-клетки изоляции описан. B-клетки используются для строительства иммунизированной библиотеки, которая используется в выборе конкретных одного домена антитела через панорамирование. Предполагаемые конкретные одного домена антитела, полученные через панорамирование подтверждаются выпадающее, ELISA, или гель сдвиг анализов. Результате антител одного домена может использоваться либо непосредственно, либо как часть инженерных реагента. Использование одного домена антитела и один домен на основе антител регентов включают структурные, биохимические, сотовой, in vivo и терапевтического применения. Одного домена антитела могут производиться в больших количествах как рекомбинантных белков прокариот выражение систем, очищаются и использоваться напрямую или могут быть спроектированы содержат конкретные маркеры или теги, которые могут использоваться в качестве репортеров в сотовых исследования или Диагностика.

Протокола, представленные здесь, была использована для создания одного домена антитела против ряда белков антигенов. Пяти антигенам использовались за Альпака. Иммунные мониторинг указал, что большинство антигенов показал начала надежный ответ на три недели (рис. 1). Кровоточит производство и строительство библиотеки после примерно шесть недель дает наилучший баланс для животных, имеют несколько антигенов вводили. Два раунда панорамирование были выполнены для каждой антигена и изолированные колонии экранированные (рис. 2). Последовательность положительных колоний выявлены антитела последовательности различных одного домена для различных антигенов. Для примеров три уникальных клоны были изолированы для ссылки антигена мальтоза привязки белка (MBP) (рис. 3A). Как часто отмечалось, антител одного домена содержат значительные последовательности разнообразия и высоко переменной длины CDR3 (рис. 3). Эти возможности особенно важны в один домен антитела/antigen взаимодействия как в ссылку одного домена антитела/CX3CL1 комплекс17 (рис. 3B).
Большинство из полнометражных один домен антитела последовательностей можно выразил и очищенная на 1-10 мг/Л культуры (рис. 4A). В силу разнообразия CDR3 длиной различные одного домена антитела показывают небольшие различия в молекулярном весе. Подтверждение о прямой привязки и производительности конкретного приложения имеет решающее значение. Например после двух раундов выделения против антигена B, группа одного домена антитела были определены (рис. 2). Были выявлены несколько идентичных последовательностей, и антитела один домен был подготовлен и очищается. Затем была протестированы через прямой тянуть вниз с антигена сродство смолы и показал надежную дозозависимый привязки (рис. 4B). Важно отметить, что одного домена антитела показал не привязки для управления смолы. Эти данные свидетельствуют о прямой привязки взаимодействия и один, который хорошо подходит для захвата сходства в раскрывающемся списке и на основе ELISA форматах.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig1.jpg"> Рисунок 1 : Представитель иммунной наблюдения двух различных антигенов, показывая значительные специфического иммунного ответа на различные антигены в то же самое животное. Многие антигены показывают надежный ответ через три недели после начала иммунизации, с большинством показаны максимальные ответ после шести недель в кратчайшие сроки. Шесть недель также позволяет для созревания близость и рекомендуемое время для производства обрез и B-клетки изоляции. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig2.jpg"> Рисунок 2 : На основе ПЦР подтверждение позитивного клонов. Праймеры охватывают MCS pMES4 вектора, и позитивные наночастицы клон производит ампликон ~ 500 bp (отмеченные *). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig3.jpg"> Рисунок 3 : Антиген специфические последовательности выделить Альпака одного домена антитела разнообразия. (A) выравнивание выберите один домен антитела последовательности изолированных к MBP с ссылкой одного домена антитела 4XT1, рамки и взаимодополняемости определение регионов (Kabat) ниже. (B) структура Альпака одного домена антитела 4XT1 привязан к CX3CL1 (PDB 4XT1), подчеркивая важнейшую роль переменной CDR петли в привязке специфического антигена. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig4.jpg"> Рисунок 4 : Очистка и проверка одного домена антител. (A) SDS-PAGE IMAC очищенного однодоменная антител, сравнивая различные одного домена антитела. Различных молекулярных масс, главным образом из-за различной длины CDR3 цикла. Также наблюдаются различные уровни выражения, с меньшинством антител одного домена, показаны плохие урожаи очищенный протеин. (B) проверка прямой привязки с помощью сродство антигена раскрывающемся списке. Надежные дозозависимый одного домена антитела связывая наблюдается с антигеном в сочетании смолы, но не с управления смолы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies at JoVE.com

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Иммунизации альпаки (лама pacos) с белков антигенов и производства антиген специфические антитела одного домена

Метод для производства антител одного домена из альпаки, включая иммунизацию, сбора крови, изоляция B-клетки и выбор описан.

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

Методы, которые мы описываем здесь, были приняты нашим спонсором NIH COBRE, Основным фондом Университета Кентукки, чтобы помочь исследователям производить однолейнные антитела в альпаках. Одно доменные антитела являются важным инструментом, используемым для ответа на ключевые вопросы в биомедицинских исследованиях. Основным преимуществом методов, которые мы демонстрируем, является то, что он позволяет производство одно доменных антител до пяти различных белков в одной альпаке.Последствия этого метода распространяются на здоровье человека и лечение заболеваний, поскольку эти одно доменные антитела могут быть использованы в качестве терапевтических средств, в качестве вакцин и в качестве диагностики. Наиболее значительным препятствием для большинства установленных биомедицинских исследователей является обращение с крупными животными, такими как альпака. Визуальная демонстрация обработки альпаки, инъекции антигенов и сбор крови имеют решающее значение для успешного производства однодомальных антител в этих верблюдах.Демонстрация процедуры будет доктор Джефф Смайли, университет ветеринар, г-жа Кэти Боаз, ветеринарный техник, и г-жа Эрин Джонс, Лаборатория животных техник. Обработка крови будет продемонстрирована доктор мартин Чао, научный сотрудник. Реальные истории этой продукции Голубые глаза, Big Boy, или ласково известный как горилла, и Фредди, наши Альпаки Кентукки.Для начала сдерживайте животное недоуздок и свинцом. Затем обрезать волосы альпаки с электрическими клиперами в полумесяце картины вдоль основания его шеи, с плеча на плечо. Тщательно держите альпаку за голову и шею, и медленно вводить антигены подкожно с 22 калибровочных иглы вдоль основания шеи, вблизи носовых лимфатических узлов.Выполните пять инъекций примерно по 200 микролитров каждый, примерно на пять сантиметров друг от друга. После этого, контролировать животное в течение 20 минут на наличие признаков анафилаксии. Еженедельно осматривать место инъекции для локализованного воспаления на местах инъекций.Чтобы извлечь кровь, обрезать волосы альпаки и дезинфицировать место сбора с спиртом тампоны. Сдерживайте альпаку осторожно, гарантируя, что шея удерживается вертикально и прямо. Используя вентральные проекции поперечного процесса позвонков в качестве ориентира, затмить вену, применяя давление только медиальный для брюшного процесса.Затем вставьте иглу под углом 45 градусов, слегка медиальный к проекции, к центру шеи. Манипулируйте иглой до тех пор, пока кровь не течет. Во-первых, разбавить 15 миллилитров собранной крови пятью миллилитров PBS.Затем, пипетка крови в лимфоцитов разделения трубки для изоляции периферических лимфоцитов крови, или ПБЛ, через градиентной центрифугации плотности. Аккуратно удалите верхний плазменный слой, сохранив его в отдельной трубке. Затем аккуратно удалите слой PBL и перенесите его в стерильную 50-миллилитровую трубку.Добавить 45 миллилитров предварительно охлажденных PBS в ПБЛ и спина трубки в течение 20 минут при 800 раз G, и четыре градуса по Цельсию. Удалите супернатант с пипеткой, оставляя гранулы, содержащие лимфоциты. Вымойте гранулы еще два раза с пятью миллилитров предварительно охлажденных PBS, чтобы подготовить ПБЛ для изоляции РНК.Используя этот протокол, одно доменные антитела были созданы против ряда белковых антигенов. Иммунный мониторинг показал, что большинство антигенов показали надежную реакцию, начиная с трех недель, и что оптимальное время для получения крови составляет шесть недель. Секвенирование положительных колоний выявило различные последовательности антител одного домена для различных антигенов.Например, три уникальные колонии были изолированы от эталонного антигенного мальтозного связывающего белка. Как правило, однолейнные антитела содержали значительное разнообразие последовательности и весьма переменную длину антиген-связывающих петель. Эти функции особенно важны при одно доменных антителах антигенных взаимодействий.Эта процедура позволяет вырабатывать одно доменные антитела до пяти антигенов на животное. Для каждого животного используется единая коллекция крови и библиотечное строительство. С фагом на основе выбора используется для выявления антиген-специфических, одноко цепных антител.Делая инъекции антигена и взятия проб крови, важно держать альпаки в группе, которая сохраняет их спокойнее. Это может быть сделано с помощью недоуздок и приводит, и связывая их в непосредственной близости во время процедур.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Направленный Белок Упаковка в везикул наружной мембраны из<em&gt; Кишечная палочка</em&gt;: Проектирование, производство и очистка

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Спектроскопия силы одного белковых молекул с помощью атомно-силового микроскопа

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Метод эффективного складывая и очистки Хеморецепция лигандом привязки домена

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Ковалентной иммобилизации белков для одной молекулы силой спектроскопии

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Кристаллическая структура N-концевой домен рианодиновыми рецепторов от Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Выражение, очищение, кристаллизация и ферментные анализы Fumarylacetoacetate Hydrolase Домен-содержащих белков

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Производство, кристаллизация и структурное определение мкножеского домена NEMO, имеющего обязательную силу IKK

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Производство динамовских и кинезинских моторных ансамблей на наноструктурах ДНК оригами для наблюдения за одной молекулой

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...