Name: immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies
Uploaded: 2019-01-26T12:30:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies at JoVE.com

Detta arbete stöds av National Institutes of Health (P30GM103486).

<ol>
	<li>Krah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-domain+antibodies+for+biomedical+applications.">Single-domain antibodies for biomedical applications.</a> Immunopharmacology and Immunotoxicology. 38 (1), 21-28 (2016).</li><li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+and+tracing+antigens+in+live+cells+with+fluorescent+nanobodies.">Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies.</a> Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).</li><li>Maass, D. R., Sepulveda, J., Pernthaner, A., Shoemaker, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpaca+(Lama+pacos)+as+a+convenient+source+of+recombinant+camelid+heavy+chain+antibodies+(VHHs).">Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs).</a> Journal of Immunological Methods. 324 (1-2), 13-25 (2007).</li><li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+protocol+for+the+generation+of+Nanobodies+for+structural+biology.">A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).</li><li>Hertveldt, K., Belien, T., Volckaert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+M13+phage+display:+M13+phage+display+in+identification+and+characterization+of+protein-protein+interactions.">General M13 phage display: M13 phage display in identification and characterization of protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 502, 321-339 (2009).</li><li>Kushwaha, R., Schafermeyer, K. R., Downie, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+phage+display+and+affinity+selection+using+recombinant+protein+baits.">A protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e50685 (2014).</li><li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains.">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).</li><li>Muyldermans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Camelid+immunoglobulins+and+nanobody+technology.">Camelid immunoglobulins and nanobody technology.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 128 (1-3), 178-183 (2009).</li><li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobodies:+natural+single-domain+antibodies.">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annu Rev Biochem. 82, 775-797 (2013).</li><li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments:+the+superfluous+luxury+of+paired+domains.">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanobody-derived+nanobiotechnology+tool+kits+for+diverse+biomedical+and+biotechnology+applications.">Nanobody-derived nanobiotechnology tool kits for diverse biomedical and biotechnology applications.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 3287-3303 (2016).</li><li>Van Saun, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+requirements+and+assessing+nutritional+status+in+camelids.">Nutritional requirements and assessing nutritional status in camelids.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 265-279 (2009).</li><li>Jones, M., Boileau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Camelid+herd+health.">Camelid herd health.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 239-263 (2009).</li><li>Daley, L. P., Gagliardo, L. F., Duffy, M. S., Smith, M. C., Appleton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+monoclonal+antibodies+in+functional+and+comparative+investigations+of+heavy-chain+immunoglobulins+in+new+world+camelids.">Application of monoclonal antibodies in functional and comparative investigations of heavy-chain immunoglobulins in new world camelids.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (3), 380-386 (2005).</li><li>Romao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Useful+Nanobodies+by+Phage+Display+of+Immune+Single+Domain+Libraries+Derived+from+Camelid+Heavy+Chain+Antibodies.">Identification of Useful Nanobodies by Phage Display of Immune Single Domain Libraries Derived from Camelid Heavy Chain Antibodies.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (43), 6500-6518 (2016).</li><li>Henry, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+TGF-beta-neutralizing+single-domain+antibodies+of+predetermined+epitope+specificity+using+next-generation+DNA+sequencing.">Isolation of TGF-beta-neutralizing single-domain antibodies of predetermined epitope specificity using next-generation DNA sequencing.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 29 (10), 439-443 (2016).</li><li>Burg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology.+Structural+basis+for+chemokine+recognition+and+activation+of+a+viral+G+protein-coupled+receptor.">Structural biology. Structural basis for chemokine recognition and activation of a viral G protein-coupled receptor.</a> Science. 347 (6226), 1113-1117 (2015).</li><li>Wesolowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+domain+antibodies:+promising+experimental+and+therapeutic+tools+in+infection+and+immunity.">Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity.</a> Medical Microbiology and Immunology. 198 (3), 157-174 (2009).</li><li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties,+production,+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments.">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77 (1), 13-22 (2007).</li><li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies.">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 25 (3), 289-296 (2018).</li></ol>

DRS. Whiteheart och Hersh är vid University of Kentucky och driva en kärna i centrum för molekylärmedicin som producerar enda domän antikroppar i alpacka som en avgift-for-service.

Som nämnts, den hög affinitet och specificitet av enda domän antikroppar, kombinerat med deras lättköpt uttryck och stabilitet, göra dem idealiska reagenser för applikationer i biomedicinsk forskning, som kritiska biokemiska reagenser, diagnosverktyg, eller terapeutiska medel18. För kommersiella tillämpningar finns det några problem relaterade till intellektuell egendom som måste beaktas. Dessutom kan enda domän antikroppar vara konstruerad för att innehålla specifika markörer eller taggar som kan användas som reportrar i cellulära analyser eller diagnostik. Nyckeln till dessa användningsområden är förmågan att producera specifika enda domän antikroppar mot antigenerna av intresse. En metod är beskrivs här för att producera enstaka domän antikroppar med alpackor, som producerar en robust immunsvar mot en mängd proteinantigener. Överväganden för djurhantering och regelefterlevnad beskrivs. Detta är nyckeln till framgång i denna del av processen.
Det finns andra strategier för att producera enstaka domän antikroppar som inte kräver immunisering, utan istället använda semisyntetiskt bibliotek med olika system för urval och iterativ optimering av tillhörighet19,20 . Fördelen med att använda bibliotek från immuniserade djur är dock möjligheten att på ett tillförlitligt sätt isolera mycket berikad, varierande och hög affinitet enda domän antikroppar. Dessutom inte bara betydande sekvens variationer observerats, men en betydande majoritet av specifika enda domän antikroppar isolerade hade unika infogningar och borttagningar, särskilt i CDR3.
Ytterligare, enda domän antikroppar kan produceras via en enkel process som endast kräver små injektioner av antigenet och efter denna process, djuren kan återföras till besättningen. Notera, djuret kan användas fritt för fiber produktion, men måste undantas från användning som kött (livsmedelskedjan) på grund av användningen av de antigener som test och icke-FDA godkända adjuvant för enda domän antikroppsproduktion. När proceduren är klar, kan djuren ska övervakas för en vecka, får en veterinär tentamen, och sedan antingen återvände till sina hem gård eller vilade för sex månader före ytterligare en runda av enda domän antikroppsproduktion.

Alpackor och andra medlemmar av familjen kameldjur, har blivit en populär källa för att skapa antikroppar för biomedicinsk forskning1,2,3. Kameldjur har ett unikt immunsystem genom att de producerar både normala antikroppar samt tung-kedjan bara antikroppar som gör att produktionen av mycket mindre enda domän antikroppar, bibehållen hög specificitet och hög affinitet. Kameldjur antikroppar ger därmed, en mångsidig reagens som är användbara för olika ändamål. Här beskrivs en metod för att vaccinera alpacka och producera enda domän antikroppar mot en mängd proteinantigener. Dessa antikroppar kan produceras i kameldjur via en relativt enkel process som endast kräver immunisering via små injektioner av målproteinet (antigen) och blod draw4. Därefter används bibliotek konstruktion, M13 phage display5 och panorering kontra den rekombinanta antigen6 för att isolera och enda domän antikroppar med de önskade egenskaperna. Eftersom processen tar fördel av kraften i phage displayteknik, fem eller fler antigener kan utnyttjas samtidigt per djur, vilket minskar antalet djur som används och tillhörande kostnader.
Typiska däggdjurs antikroppar eller immunoglobuliner är stora molekyler som består av två typer av kedjor (2 tunga kedjor och 2 lätta kedjor), som är sammankopplade genom disulfide obligationer. Dessa antikroppar är relativt stor, uppvisar molekylvikter av ~ 140-190 kDa för rikligare IgG arter från människor, möss, getter och kaniner. På grund av deras flera subenhet struktur, hög molekylvikt och disulfide obligationer, kan immunglobuliner vara ganska utmanande att producera i stora kvantiteter, gör deras höga kostnad. På 90-talet upptäcktes det att kameldjur, som inkluderar kameler, lamor och alpackor göra, förutom den typiska däggdjur typ immunglobulin, en ny form av immunglobulin som är enklare i struktur, som har endast tunga kedjor7. Dessa unika kameldjur antikroppar ha samma förmåga till specifikt binder främmande ämnen med hög affinitet men endast består av ett protein kedjan8. Dessutom kan kameldjur antikroppar trunkeras experimentellt till en ännu mindre enhet VHH fragment, även kallad en enda domän antikropp9. På grund av sin storlek, domän antikroppar är användbara för ett brett användningsområde biomedicinsk forskning och är tillgängliga från en mängd olika akademiska och kommersiella källor1,10. Ett undantag verkar vara Western blotting eftersom enda domän antikroppar riktas oftare mot konformation beroende epitoper, som vanligtvis försvinner de denatureringen villkor som används i Western blotting.
Eftersom de består av en enda polypeptidkedja, kan specifika enda domän antikroppar väljas och enkelt produceras i stora mängder som rekombinanta proteiner i bakterier. Enda domän antikroppar kan också vara genetiskt konstruerade för att innehålla specifika markörer eller taggar som kan användas som ”reporter grupper” för att diagnostisera sjukdomar11. Denna användarvänlighet manipulation i kombination med deras flexibilitet att använda antikroppar enda domän en viktig resurs för forskare på universiteten och annorstädes.
Som en del av en National Institutes of Health stöds core, har befintliga metoder anpassats till producera enda domän antikroppar från alpackor3,4. Alpackor har betydande fördelar i både enkel hantering i förhållande till större kameldjur familjemedlemmar samt tillgänglighet. Alpackor höjs kraftigt för fiber och kött och således kan erhållas regionalt från lokala alpacka bönder, som kan identifieras genom sina webbplatser eller genom staten uppfödare föreningar. Det finns två raser av alpackor, Suri och Huacaya. Huacaya är vanligare och användes för detta protokoll, men protokollet är allmänt tillämpliga på antingen raser och även mer allmänt tillämpliga på andra kameldjur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:932px;" width="932">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:299px;">GERBU FAMA adjuvant</td>
			<td style="width:123px;">Biotechnik, Heidelberg, Germany&#160;</td>
			<td style="width:344px;">3003,6001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serum collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blood collection tube</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>366643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacutainer blood collection set</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>368652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Maxisorp Immuno plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HRP-conjugated goat anti-llama IgG antibody&#160;</td>
			<td>Bethyl Labs</td>
			<td>A160-100P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TMB reagent chromogenic peroxidase substrate&#160;</td>
			<td>KPL</td>
			<td>50-76-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plate Reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M5</td>
			<td>Any UV/VIS capable reader is acceptable</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Uni-SepMAXI+ lyphocyte separation tube</td>
			<td>Novamed</td>
			<td>U-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAshredder column</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Superscript IV reverse transcriptase&#160;&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18064014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AEBSF solution</td>
			<td>Biosynth</td>
			<td>A-5440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TG1 phage display competent cells</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>60502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunization of alpacas (lama pacos) with protein antigens and production of antigen-specific single domain antibodies

I detta manuskript, är en metod för immunisering av alpacka och molekylärbiologiska metoder producera antigen-specifika enda domän antikroppar beskrivs och visat. Kameldjur, har såsom alpackor och lamor, blivit en värdefull resurs för biomedicinsk forskning eftersom de producerar en ny typ av tunga kedja-bara antikroppar som kan användas för att producera enstaka domän antikroppar. Eftersom immunförsvaret är mycket flexibel, kan enkel domän antikroppar göras till många olika proteinantigener, och även olika konformationer av antigenet, med en mycket hög grad av specificitet. Dessa funktioner, bland annat gör enda domän antikroppar ett ovärderligt verktyg för biomedicinsk forskning. En metod för framställning av enda domän antikroppar från alpackor rapporteras. Ett protokoll för immunisering, blodinsamling och B-cell isolering beskrivs. B-cellerna används för byggande av en immuniserade bibliotek, som används i valet av specifika enda domän antikroppar via panorering. Förmodad specifika enda domän antikroppar erhållits via panorering bekräftas av pull-down, ELISA eller gel-shift analyser. De resulterande enda domän-antikropparna kan sedan användas antingen direkt eller som en del av en konstruerad reagens. Användningar av enda domän antikropp och enda domän antikroppsbaserade regents omfatta strukturella, biokemiska, cellulär, in vivo, och terapeutiska tillämpningar. Enda domän antikroppar kan produceras i stora mängder rekombinanta proteiner i prokaryota uttryck system, renat, och använda direkt eller kan vara konstruerad för att innehålla specifika markörer eller taggar som kan användas som reportrar i cellulära studier eller i diagnostik.

Det protokoll som presenteras här utnyttjades för att generera enda domän antikroppar mot en rad proteinantigener. Fem antigener utnyttjades per alpacka. Immun övervakning anges att majoriteten av antigener visade robust svar början på tre veckor (figur 1). Produktion utfall och bibliotek konstruktion efter ca sex veckor ger bästa balans för djur som har flera antigener injiceras. Två rundor av panorering var utfört för varje antigen och isolerade kolonier skärmad (figur 2). Sekvensering av positiva kolonier identifieras olika enda domän antikropp sekvenser för de olika antigenerna. För exempel isolerades tre unika kloner till referensantigen maltos bindande Protein (MBP) (figur 3A). Som är frekvent, innehåller enda domän antikropparna betydande sekvens mångfald och mycket varierande CDR3 längd (figur 3). Dessa funktioner är särskilt viktigt i enda domän antikropp/antigen interaktioner som kan ses i referens enda domän antikropp/CX3CL1 komplexa17 (figur 3B).
Majoriteten av fullängds enda domän antikropp sekvenser kan uttryckt och renas på 1-10 mg/L av kultur (figur 4A). På grund av mångfalden i CDR3 längd Visa olika enda domän antikroppar liten variation i molekylvikt. Bekräftelse direkt bindande och programmets specifika prestanda är kritisk. Exempelvis efter två rundor av urval mot Antigen B identifierade en panel av enda domän antikroppar var (figur 2). Flera identiska sekvenser identifierades och enda domän antikroppen producerades och renas. Det var sedan testade via direkt dra ner med antigen affinitet harts och visade robust dosberoende bindande (figur 4B). Ännu viktigare, visade den enda domän antikroppen ingen bindning till styra harts. Dessa data visar ett riktaband interaktion, och en som är väl lämpad för affinitet fånga både pull-down och ELISA-baserade format.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig1.jpg"> Figur 1 : Representativa immun övervakning av två distinkta antigener visar betydande specifika immunsvaret mot olika antigener på samma djur. Många antigener Visa robust svar så tidigt som tre veckor efter påbörjandet immunisering, med de flesta visar maximalt svar efter sex veckor. Sex veckor också möjliggör samhörighet mognad och är rekommenderad tid för produktion utfall och B-cell isolering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig2.jpg"> Figur 2 : PCR-baserade bekräftelse av positiva kloner. Primers spänner MCS vektorns pMES4, och en positiv nanobody klon producerar en amplikon på ~ 500 bp (markerade med *). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig3.jpg"> Figur 3 : Antigen-specifika sekvenser Markera alpacka enda domän antikropp mångfald. (A) anpassning av Välj domän antikropp sekvenser isolerat till MBP med en referens enda domän antikropp 4XT1, ram och komplementaritet-bestämma regioner (Kabat) markerade nedan. (B) struktur av alpacka enda domän antikropp 4XT1 bunden till CX3CL1 (PDB 4XT1), betonar den kritiska rollen av variabel CDR loopar i specifika antigen bindande. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig4.jpg"> Figur 4 : Rening och validering av enda domän antikroppar. (A) SDS-PAGE av IMAC renat enda domän antikroppar, jämföra olika enda domän antikroppar. Olika molekylvikter beror främst på varierande längd av CDR3 slingan. Olika nivåer av uttryck observeras också, med en minoritet av enda domän antikroppar visar dålig avkastning av renat protein. (B) kontroll av riktaband använder en antigen affinitet nedrullningsbara. Robust dosberoende enda domän antikropp bindande observeras med antigen-kopplade harts men inte med kontroll harts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies at JoVE.com

Immunization of Alpacas Lama pacos with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Immunisering av alpackor (Lama pacos) med proteinantigener och produktion av Antigen-specifika enda domän antikroppar

En metod för framställning av enda domän antikroppar från alpackor, inklusive immunisering, blodinsamling, B-cell isolering och urval är beskrivna.

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

De metoder vi beskriver här antogs av vår NIH COBRE sponsrade, University of Kentucky Protein Core Facility för att hjälpa forskare att producera endo antikroppar i alpackor. Endomänantikroppar är ett viktigt verktyg som används för att besvara viktiga frågor inom den biomedicinska forskningen. Den största fördelen med de tekniker vi visar är att det möjliggör produktion av endomänantikroppar till upp till fem distinkta proteiner i en enda alpacka.Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig till människors hälsa och sjukdom behandling eftersom dessa enda domän antikroppar kan användas som therapeutics, som vacciner, och som diagnostik. Det största hindret för de mest etablerade biomedicinska utredare är att hantera stora djur, såsom alpacka. Visuell demonstration av hantering av en alpacka, injektion av antigener, och insamling av blod, är avgörande för en framgångsrik produktion av en-domän antikroppar i dessa camelids.Demonstrera förfarandet kommer att doktor Jeff Smiley, universitetsveterinär, Ms.Kathy Boaz, veterinärtekniker, och Ms.Erin Jones, Lab Animal Technician. Hantering av blodet kommer att demonstreras av doktor Martin Chao, forskningsassistent. De verkliga berättelserna om denna produktion är Blue Eyes, Big Boy, eller kärleksfullt känd som Gorilla, och Freddie, vår Kentucky alpackor.Till att börja med hålla fast djuret med en grimma och bly. Sedan trimma alpacka hår med elektriska clippers i en halvmåne mönster längs basen av sin nacke, från axel till axel. Håll försiktigt alpackan i huvud och hals, och injicera långsamt antigenerna subkutant med en 22 gauge nål längs basen av halsen, nära fören lymfkörtlar.Utför fem injektioner på cirka 200 mikroliter vardera, cirka fem centimeter från varandra. Efter detta, övervaka djuret i ca 20 minuter för tecken på anafylaxi. Inspektera injektionsstället för lokaliserad inflammation vid injektionsställena varje vecka.För att dra blod, klipp alpacka hår och desinficera uppsamlingsplatsen med sprit svabbprover. Begränsa alpackan försiktigt, se till att halsen hålls upprätt och rak. Använda den ventrala prognoser av den tvärgående processen av kotorna som ett landmärke, occlude venen genom att tillämpa tryck bara mediala till ventrala processen.Därefter för in nålen i 45 graders vinkel, något mediala mot projektionen, mot mitten av halsen. Manipulera nålen tills blodet flödar. Först späd 15 milliliter av det insamlade blodet med fem milliliter PBS.Sedan, pipetter blod i en lymfocyt separationsrör för att isolera perifert blod lymfocyter, eller PBLs, via densitet gradient centrifugation. Ta försiktigt bort det översta plasmaskiktet, spara det i ett separat rör. Sedan, försiktigt bort PBL skiktet, och överföra den till en steril 50 milliliter rör.Tillsätt 45 milliliter prekylda PBS till PBLs och snurra röret i 20 minuter vid 800 gånger G, och fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten med en pipett och lämna pelleten som innehåller lymfocyterna. Tvätta pelleten ytterligare två gånger med fem milliliter prekyld PBS för att göra färdigt PBLs för RNA-isolering.Med hjälp av detta protokoll genererades endomänantikroppar mot en rad proteinantigener. Immun övervakning anges att majoriteten av antigener visade robust svar börjar på tre veckor, och att den optimala tiden för att få blod är på sex veckor. Sekvensering av de positiva kolonierna identifierade olika endoarkroppssekvenser för olika antigener.Till exempel isolerades tre unika kolonier till referensantogen maltose-bindande proteinet. Generellt innehöll de endomän antikroppar betydande sekvens mångfald och mycket varierande längd av antigen-bindande loopar. Dessa funktioner är särskilt viktiga i en-domän antikropp antigen interaktioner.Detta förfarande möjliggör produktion av endomänantikroppar för upp till fem antigener per djur. En enda blodinsamling, och bibliotekskonstruktion, utnyttjas för varje djur. Med display-baserade urval utnyttjas för att identifiera antigen-specifika, single-chain antikroppar.Medan du gör antigen injektioner och blodprov, Det är viktigt att hålla alpackorna i en grupp, vilket håller dem lugnare. Detta kan göras med hjälp av grimma och leder, och binda dem i närheten under förfarandena.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Riktad Protein Förpackning inom yttre membranvesiklar från<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produktion och rening

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi av enda proteinmolekyler genom en Atomic Force Mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Metod för effektiv vika och rening av Chemoreceptor Ligand bindande domän

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalent immobilisering av proteiner för den enda molekyl kraft spektroskopin

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Kristallstrukturen av N-terminala domänen av ryanodinreceptorn från Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttryck, rening, kristallisering, och enzym analyser av Fumarylacetoacetat Hydrolase Domain-innehållande proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Produktion, kristallisering och strukturbestämning av IKK-bindande domän för NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Produktion av dynein och Kinesin motor ensembler på DNA origami nanostrukturer för enkel molekyl observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...