Name: large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

أيد هذا العمل منح BIO2017-83184 آر واكسب-BIO2017-91865 من وزارة العلوم دي الإسبانية, Innovación y جامعات (FEDER صناديق التمويل المشترك).

1-بلازميد البناء
<ol><li>
تضخيم بكر (أو النسخ العكسي PCR إذا البدء من قالب الحمض النووي الريبي) كدنا المقابلة للجيش الملكي النيبالي للاهتمام باستخدام كبسولة تفجير 5 ' ملحق للسماح للجمعية إلى بلازميد التعبير. لتجنب حدوث طفرات غير مرغوب فيها، استخدام عالية دقة بوليميريز الحمض النووي.
	<ol...

<ol>
	<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Research+on+Non-Coding+Ribonucleic+Acid+(RNA).">Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA).</a> Genes. 8 (12), (2017).</li><li>Hamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+approaches+to+RNA+aptamer+design.">In silico approaches to RNA aptamer design.</a> Biochimie. 145, 8-14 (2018).</li><li>Bobbin, M. L., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)-Based+Therapeutics:+Delivering+on+the+Promise?.">RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).</li><li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+for+Mosquito+and+Mosquito-Borne+Disease+Control.">RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control.</a> Insects. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expression+and+purification+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Methods. 54 (2), 267-273 (2011).</li><li>Kikuchi, Y., Umekage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nucleic+acids+of+the+marine+bacterium+Rhodovulum+sulfidophilum+and+recombinant+RNA+production+technology+using+bacteria.">Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+RNA+technology:+the+tRNA+scaffold.">Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold.</a> Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).</li><li>Batey, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+methods+for+native+expression+and+purification+of+RNA+for+structural+studies.">Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).</li><li>El Khouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+RNA-Protein+Complexes+in+Escherichia+coli.">Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli.</a> Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).</li><li>Ponchon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+RNA-protein+complexes+in+Escherichia+coli+and+applications+to+RNA+biology.">Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology.</a> Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).</li><li>Umekage, S., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+production+and+purification+of+circular+RNA+aptamer.">In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer.</a> Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).</li><li>Dar&#242;s, J. -. A., Aragon&#233;s, V., Cordero, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viroid-derived+system+to+produce+large+amounts+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids:+small+noncoding+infectious+RNAs+with+the+remakable+ability+of+autonomous+replication.">Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication.</a> Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).</li><li>Flores, R., Hern&#225;ndez, C., Mart&#237;nez de Alba, A. E., Dar&#242;s, J. A., Di Serio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+and+viroid-host+interactions.">Viroids and viroid-host interactions.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).</li><li>Di Serio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICTV+Virus+Taxonomy+Profile:+Avsunviroidae.">ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae.</a> The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).</li><li>Nohales, M. A., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroid+RNA+redirects+host+DNA+ligase+1+to+act+as+an+RNA+ligase.">Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).</li><li>Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+chloroplastic+isoform+of+tRNA+ligase+in+the+replication+of+viroids+belonging+to+the+family+Avsunviroidae.">Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggplant+latent+viroid:+a+friendly+experimental+system+in+the+family+Avsunviroidae.">Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).</li><li>Cordero, T., Ortol&#224;, B., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+Eggplant+Latent+Viroid+RNA+Circularization+by+the+Eggplant+tRNA+Ligase+in+Escherichia+coli.">Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li><li>Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-dimensional+electrophoretic+technique+for+the+detection+of+circular+viroids+and+virusoids.">A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids.</a> Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).</li><li>Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+electrophoretic+properties+of+solubilizable+disulfide+gels.">Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels.</a> Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).</li><li>Gigu&#232;re, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+structures+of+all+members+of+the+Avsunviroidae+family.">Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family.</a> Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).</li><li>L&#243;pez-Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+initiation+sites+of+eggplant+latent+viroid+strands+map+within+distinct+motifs+in+their+in+vivo+RNA+conformations.">The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations.</a> RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).</li></ol>

أثناء البحث في تسلسل الفد ومتطلبات بنية المشاركة في الاعتراف بواسطة ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان، لاحظنا أن التعبير المشترك كل الجزيئات في غير المضيفة كولاي التي أدت إلى تراكم فرويد دائرية كبيرة غير متوقعة أشكال في الخلايا البكتيرية19. أننا فهمنا أن تراك?...

وعلى النقيض من الحمض النووي والبروتينات، بروتوكولات لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي سهلة وفعالة وفعالة من حيث التكلفة ليست وفيرة. ومع ذلك، متطورة الطلب البحوث والصناعة زيادة مبالغ هذه الجزيئات الحيوية للتحقيق عن الخصائص البيولوجية الفريدة1، أو استخدامها في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية، بما في ذلك استخدامها الابتامرات محددة للغاية 2أو3من العوامل العلاجية أو مبيدات انتقائية4. النسخ في المختبر والتوليف الكيميائية تستخدم عادة في البحوث لإنتاج الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، هذه الأساليب تستتبع القيود الهامة عندما يتطلب الأمر كميات كبيرة من المنتجات. البديل المنطقي لاستخدام آلات النسخ الذاتية من الخلايا الحية، تليها عملية تنقية لفصل الكشف لمصلحة من رفاقه الخلوية. وفي أعقاب هذه الاستراتيجية، وضعت أساليب لإنتاج الكشف المؤتلف في الخلايا البكتيرية، مثل المختبر الصديقة الإشريكيّة القولونية5 أو البحرية الأرجواني فوتوتروفيك ألفا-بروتيوباكتيريوم سولفيدوفيلوم رهودوفولوم 6-معظم الأساليب لإنتاج الحمض النووي الريبي المؤتلف في البكتيريا تعتمد على التعبير عن السقالة الحمض النووي الريبي مستقرة جداً الأصلي، مثل إدراج7الحمض الريبي النووي النقال أو الرنا الريباسي، التي يكون فيها الجيش الملكي النيبالي للفائدة. وهذا يفرض ضرورة الإفراج عن الجيش الملكي النيبالي للفائدة من جزيء تشيميريك، في حالة وجود الحمض النووي الريبي إضافي مشكلة بالنسبة للتطبيقات المصب8. مفهوم آخر في المؤتلف الحمض النووي الريبي التكنولوجيا الأحيائية هو إنتاج مجمعات ribonucleoprotein التوليفية التي قد تكون المنتج المطلوب في حد ذاتها أو تستخدم كاستراتيجية وقائية لزيادة الاستقرار في الجيش الملكي النيبالي للفائدة9، 10. وبالمثل، اقترحت أيضا كاستراتيجية لتوليد منتجات أكثر استقرارا11إنتاج الكشف دائرية.
قمنا مؤخرا بتطوير أسلوب جديد لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في كولاي التي تشارك في ثلاثة من المفاهيم المذكورة أعلاه: الإدراج من الجيش الملكي النيبالي للفائدة في سقالة الحمض النووي الريبي دائرية عالية مستقرة والتعبير المشترك عن رنا المؤتلف مع بروتين التفاعل المحتمل أن إنتاج ribonucleoprotein مستقرة معقدة التي تتراكم في المبالغ الملحوظة في البكتيريا خلايا12. على النقيض من التطورات السابقة، استخدمنا الحمض النووي الريبي سقالة غريبة تماما على كولاي، إلا وهي فرويد. فيرويدس هي نوع خاص جداً من العوامل المعدية من النباتات العليا التي تتألف حصرا من صغيرة نسبيا (nt 246-401) درجة عالية من إقران قاعدة التعميم الحمض النووي الريبي13. من المثير للاهتمام، فيرويدس هي غير الترميز الكشف، ومع أي مساعدة من البروتينات الخاصة بها، فقادرة على إكمال دورات المعدية المعقدة في المضيفين المصابة14. تشمل هذه الدورات تكرار الحمض النووي الريبي للجيش الملكي النيبالي في نوى أو المعايشة، اعتماداً على الأسرة فيرويد –بوسبيفيرويداي أو أفسونفيرويداي، على التوالي – الحركة عن طريق النباتات المصابة والتهرب من استجابة دفاعية المضيف. يجب أن يتم تصنيفهم فيرويدس بين الكشف الأكثر استقرارا في طبيعتها، ونتيجة ليجري الحمض النووي الريبي دائرية عارية، والحاجة إلى البقاء على قيد الحياة في بيئة معادية للخلايا النباتية المصابة. وقد جعل هذه الخاصية فيرويدس مناسبة خاصة السقالات على استقرار المؤتلف الحمض النووي الريبي في نهج التكنولوجيا الحيوية. وباﻹضافة إلى ذلك، أسلوب جديد يستند إلى التعبير المشارك من السقالة فرويد مع بروتين النباتي متفاعلة. فيرويدس نسخاً متماثلاً من خلال إليه دائرة المتداول في استضافة التي يجند الإنزيمات لتحفيز الخطوات المختلفة لهذه العملية. لا سيما بعض فيرويدس، وبشكل أكثر تحديداً تلك التي تنتمي إلى أفسونفيرويدايالأسرة15، تحتوي على ريبوزيميس التي تشارك أيضا في عملية النسخ المتماثل. تبعاً للأنواع الأحيائية فرويد، توسط نسخ فرويد الكشف المضيفة الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني أو بوليميريز الحمض النووي الريبي النووي ترميز تشلوروبلاستيك (NEP). معالجة فرويد الجيش الملكي النيبالي ويبدو أن تحفزها مضيف رناسي نوع-ثالثا، على الرغم من أن تنشق وسيطة في فيرويدس مع الحمض النووي الريبي أوليجوميريك ribozymes ذاتيا أثناء النسخ المتماثل. وأخيراً، مونومرات فرويد الناتجة هي سيركولاريزيد، اعتماداً على الأسرة، وفرويد ليجاسى الحمض النووي المضيف 1 أو isoform تشلوروبلاستيك الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى16،17. هذا الإنزيم الأخير تشارك في عملية ربط أحادي أشكال فيرويدس في الأسرة أفسونفيرويداي، مثل فرويد الكامنة الباذنجان (الفد)18.
أثناء عمل تحليل متطلبات الفد تسلسل والهيكلية التي تحدد الاعتراف بالباذنجان (Solanum melongena L.) ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال، أنشأنا نظام تجريبي يستند إلى التعبير المشترك لكل الجزيئات في كولاي 19-لاحظنا أن تنشق ذاتية أطول من وحدة الفد النصوص كفاءة في الخلايا كولاي عن طريق ribozymes المطرقة جزءا لا يتجزأ، وأن مونومرات فرويد الناتجة مع 5 '-هيدروكسيل و 2'، 3 '-phosphodiester تيرميني كانت كفاءة سيركولاريزيد من ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان أعرب المشترك. بل أكثر من ذلك، رنا فرويد التعميم الناتج الذي تم التوصل إليه بتركيز عال غير متوقعة في كولاي، تتجاوز تلك التي ررناس الذاتية12. أظهرت عدم وجود وسيطة النسخ المتماثل عدم التضخيم الفد الحمض النووي الريبي للجيش النيبالي الملكي في هذه الخلايا البكتيرية. من المثير للاهتمام، الإدراج للكشف مغايرة في موقف معين للجزيء فرويد أثرا معتدلة في تراكم الكشف مشتقة فرويد-التعميم12. هذه الملاحظات جعلتنا نتصور طريقة لإنتاج كميات كبيرة من المؤتلف الكشف في البكتيريا. في هذا الأسلوب، يتم إدراج كدناس المقابلة للكشف الفائدة في كدنا الفد والجيش الملكي النيبالي تشيميريك الناتجة في كولاي عن طريق أحد المروجين تأسيسي قوية. لنظام العمل، يجب تحويل كولاي يشترك مع بلازميد للتعبير عن ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان. نسخة أطول من الوحدة المشتقة من الفد تتم معالجتها بواسطة ribozymes المطرقة جزءا لا يتجزأ ومعترف بها وسيركولاريزيد من ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال المشترك أعرب مونومرات الناتجة مع تيرميني المناسبة. بهذه الطريقة، يتم إدراج الجيش الملكي النيبالي لمصلحة سقالة دائرية مستقرة جداً يتألف من جزيء دائري فرويد. هذا الحمض النووي الريبي تشيميريك المؤتلف على الأرجح كذلك استقرت داخل الخلايا كولاي بتشكيل ribonucleoprotein المعقدة من خلال التفاعل مع الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى. باستخدام هذا الأسلوب (انظر البروتوكول أدناه)، الابتامرات الجيش الملكي النيبالي ودبوس الكشف وغيرها الكشف المنظم بسهولة أنتجت بكميات عشرات مليغرام للتر الواحد من الثقافة كولاي في الظروف المختبرية العادية وتنقيته للتجانس مع أخذ الاستفادة من تدوير12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bpi I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010</td>
			<td>D1 low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131008.1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>Ba2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>48045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>X1402.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131785.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucloSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>22740588.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69387-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115(DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref. Timmons et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C 0113.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1211</td>
			<td>87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131509.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122333.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131020.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>FE04791000</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3691,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap DEAE Sepharose FF column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5055-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTAprime plus liquid chromatography system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>11001313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamyde</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1089,1000</td>
			<td>2K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>146392.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2940,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0937,2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Bis(acryloyl)cystamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4929-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli

ومع تزايد الاهتمام بالبيولوجيا الجيش الملكي النيبالي، واستخدام جزيئات الحمض النووي الريبي في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية تطورا، الأساليب التي تنتج كميات كبيرة من الكشف المؤتلف محدودة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في الإشريكيّة القولونية يستند التعبير المشارك من جزيء تشيميريك التي تحتوي على الحمض النووي الريبي للفائدة في سقالة فرويد ومصنع للحمض الريبي النووي النقال ليجاسى. فيرويدس يتم الكشف دائرية صغيرة نسبيا، غير الترميز، درجة عالية من إقران قاعدة يتم المعدية على النباتات العليا. النباتات المضيفة الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى هو إنزيم جندهم فيرويدس التي تنتمي إلى الأسرة، أفسونفيرويدايمثل فرويد الكامنة الباذنجان (الفد)، للتوسط على الجيش الملكي النيبالي أثناء النسخ المتماثل فرويد. على الرغم من أن الفد لا النسخ المتماثل في كولايوكفاءة يتم نسخها من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي كولاي مؤشرا الفد ويتم معالجتها بواسطة ribozymes المطرقة المضمنة في الخلايا البكتيرية، وهي سيركولاريزيد مونومرات الناجمة عن ذلك شارك أعرب ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال التوصل إلى تركيز ملحوظ. إدراج الحمض النووي الريبي للفائدة في سقالة الفد يتيح إنتاج عشرات ملليغرام من المؤتلف الحمض النووي الريبي للتر الواحد من ثقافة البكتيرية في الظروف المختبرية العادية. جزء الرئيسي من المنتج الجيش الملكي النيبالي التعميم، ميزة تسهل على تطهير الجيش الملكي النيبالي المؤتلف إلى التجانس الظاهري. في هذا البروتوكول، يتم إدراج المقابلة الحمض النووي (كدنا) مكملة للجيش الملكي النيبالي للفائدة في موضع معين من كدنا الفد في تعبير بلازميد المستخدمة، على طول بلازميد لﻹعراب الباذنجان الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى، شاركت في تحويل كولاي. التعبير المشترك كلا الجزيئات تحت سيطرة المروجين التأسيسي قوي يؤدي إلى إنتاج كميات كبيرة من الجيش الملكي النيبالي المؤتلف. يمكن استخراجه من الخلايا البكتيرية الجيش الملكي النيبالي المؤتلف وفصلها عن الجزء الأكبر الكشف البكتيرية الاستفادة به دائرية.

لإنتاج المؤتلف الحمض النووي الريبي في كولاي استخدام نظام المستمدة من الفد12، هو المطعمة الجيش الملكي النيبالي للفائدة إلى سقالة "رنا الفد". هذا الجيش الملكي النيبالي تشيميريك أعرب عن المشاركة على طول ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان في كول...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

الإنتاج الواسع النطاق للكشف المؤتلف في سقالة دائرية باستخدام نظام المستمدة من فرويد في الإشريكيّة القولونية

نقدم هنا، بروتوكولا لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في الإشريكيّة القولونية بالإعراب شارك الجيش الملكي النيبالي تشيميريك التي تحتوي على الحمض النووي الريبي للفائدة في سقالة فرويد ومصنع للحمض الريبي النووي النقال ليجاسى. المنتج الرئيسي هو جزيء تعميم الذي يسهل تنقية للتجانس.

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة على إنتاج كميات كبيرة من RNAs المؤتلفة ذات الفائدة للتطبيق في مجال البحث أو الصناعة. الميزة الرئيسية هي أن يتم إنتاج الحمض النووي الريبي المؤتلف في Escherichia القولونية في عملية رخيصة التي يمكن توسيعها بسهولة. الأهم من ذلك، يتم إنتاج الجيش الملكي النيبالي على سقالة RNA دائرية، مما يسهل تنقية إلى التجانس.وعلى النقيض من الحمض النووي أو البروتينات، لا يتم إنتاج الحمض النووي الريبي النووي الذي يهمه بسهولة بكميات كبيرة في النظم الحيوية، مثل ثقافة الإشريكية القولونية. ويستند أسلوبنا على التعبير المشترك من الجيش الملكي النيبالي من الفائدة إدراجها في سقالة دائرية مستقرة للغاية وتطبيق الرباط الذي يتوسط تعميم الجيش الملكي النيبالي. السقالة RNA التعميم مستمدة من viroid براءة اختراع.Viroids هي صغيرة نسبيا، غير ملفوف، RNAs قاعدة عالية الاقتران التي هي المعدية لبعض النباتات أعلى. يمكننا إنتاج عشرات ملليغرام من الحمض النووي الريبي المؤتلف لكل لتر من الثقافة البكتيرية في ظروف المختبر العادية. لبدء هذا الإجراء، تضخيم cDNA بواسطة PCR كما هو موضح في بروتوكول النص.بعد ذلك، أضف 100 نانوجرام من pLELVd-BZB إلى أنبوب 0.5 ملليلتر. إضافة 10 يو من نوع IIS إنزيم تقييد BpiI و ما يكفي من G العازلة لإنشاء رد فعل ميكرولتر 20. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لهضم البلازميد.بعد هذا، فصل PCR ومنتجات الهضم عن طريق الكهرباء في هلام agarose واحد في المئة في عازلة TAE. وصمة هلام عن طريق هزه في بروميد ethidium 200 ملليلتر بتركيز 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر. باستخدام transilluminator الأشعة فوق البنفسجية، تصور الحمض النووي.استخدام مشرط لقطع العصابات المقابلة لcDNA تضخيم وBpiI هضم plasmid. باستخدام أعمدة هلام السيليكا، elute DNAs من شظايا هلام. كمّيّ تركيز الحمض النووي بواسطة التحليل الطيفي.إعداد رد فعل الجمعية جيبسون باستخدام cDNA تضخيم وplsmid هضمها. احتضان في 50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم، استخدم عمود هلام السيليكا لتنقية رد الفعل.بعد electroporating المختصة E.coli DH5-ألفا الخلايا، واختيار العديد من المستعمرات البيضاء ونقلها إلى السائل LB المتوسطة. تنمو المستعمرات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، استخدم مجموعة صغيرة لتنقية البلازميدات ، وتحليل أحجامها بواسطة الكهرباء في هلام agarose واحد في المائة في عازلة TAE.أولاً، شارك في نقل الكهرباء سلالة الإشريكية القولونية المختارة مع كل من مشتق pLELVd-BZB الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي (cDNA) المقابل للرنا الرنا ذات الاهتمام وp15LTRNISM للمشاركة في التعبير عن الباذنجان tRNA LIGAse. نقل SOC المتوسطة السائلة في cuvette الكهربائية لاستعادة الخلايا، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. ثم، لوحة البكتيريا على LB المتوسطة الصلبة التي تحتوي على 50 ميكروغرام لكل المليلتر أمبيسيلين، و 34 ميكروغرام لكل ملليلتر الكلورامفينيكول.احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، إضافة 250 ملليلتر من السل السائل المتوسطة، التي تحتوي على 50 ميكروغرام لكل المليلتر أمبيسيلين، و 34 ميكروغرام لكل ملليلتر الكلورامفينيكول، إلى لتر واحد حيرة قارورة إرلينماير. استرداد E.Coli المحتضنة، ومن ثم اختيار مستعمرة وتطعيم المتوسطة في القارورة.احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي في 180 دورة في الدقيقة لمدة 12 إلى 16 ساعة قبل حصاد البكتيريا. صب ثقافة E.Coli المحصودة في زجاجة جهاز طرد مركزي 250 ملليلتر وتدور أسفل الخلايا في 14، 000 G لمدة 10 دقائق. تخلص من السوبر و resuspend الخلايا في 30 ملليلتر من الماء.نقل هذا التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي، وتدور أسفل الخلايا مرة أخرى باستخدام الشروط السابقة. تجاهل عظمى وإضافة 10 ملليلتر من عازلة الكروماتوغرافيا إلى بيليه الخلية. دوامة لإعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت.إضافة حجم واحد من الفينول: الكلوروفورم ودوامة بقوة لكسر الخلايا. ثم، الطرد المركزي في 12،000 G لمدة 10 دقائق. استعادة المرحلة مائي، إضافة حجم واحد من الكلوروفورم، ودوامة بقوة.جهاز طرد مركزي في 12،000 G لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، قم بتصفية إعداد الحمض النووي الريبي من خلال فلتر حقنة ميكرومتر 45. تنقية الجيش الملكي النيبالي باستخدام ميلليلتر ثنائي الإيثانول أمين العمود متصلة نظام الكروماتوغرافيا السائل.اضبط معدل التدفق إلى ملليلتر واحد في الدقيقة، وقي التوازن في العمود مع 10 ملليلترات من عازلة الكروماتوغرافيا. ثم، قم بتحميل العينة وغسل العمود بـ 10 ملليلترات من عازلة الكروماتوغرافيا. Elute الجيش الملكي النيبالي مع 20 ملليلتر من العازلة elution، وجمع aliquots ملليلتر واحد.باستخدام ثنائي الأبعاد polyacrylamide جل الكهرباء، وفصل RNAs التعميم من نظرائهم الخطية. أولاً، إعداد هلام بوليكريلاميد خمسة في المئة في العازلة TBE وتحتوي على ثمانية اليوريا الضرس كما هو مبين في بروتوكول النص. مزيج 20 ميكرولترات من الاستعدادات RNA مع حجم واحد من العازلة التحميل.احتضان في 95 درجة مئوية في كتلة التدفئة لمدة 1.5 دقيقة، ومن ثم المفاجئة باردة على الجليد. تحميل العينات في هلام polyacrylamide وتشغيل الكهرباء في الظروف المناسبة لبعد هلام. بعد ذلك، وصمة عار في هلام 0.5 ميكروغرام لكل ملليلتر بروميد ethidium لمدة 15 دقيقة.غسل الجل الملون بالماء، ومن ثم تصور الجيش الملكي النيبالي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. التحليل الكهربائي لعدة plasmids المؤتلف الذي يتم إدراجها cDNAs مختلفة تظهر الهجرات المختلفة بالمقارنة مع pLELVd-BZB. لاحظ أن pLELVd-BZB يحتوي على علامة lacZ، والتي يتم استبدالها بـ cDNA المقابلة لـ RNA من الفائدة، لذلك بينما تعتمد الترحيل على حجم cDNA المدرجة، فإن plasmids المؤتلفة عادةً ما يتم ترحيل أسرع من بلازميد التحكم.يتم رصد إنتاج الحمض النووي الريبي المؤتلف في الثقافات البكتيرية المشتركة من خلال كسر الخلايا وتحليل الحمض النووي الريبي عن طريق DENATURING PAGE. يمكن رؤية نطاقات قوية ، والتي تتوافق مع أشكال ELVd وchimeric ELVd الفارغة ، والتي تم إدراج RNAs مختلفة من الفائدة. ومن المثير للاهتمام، وينظر إلى جزء كبير من الحمض النووي الريبي المؤتلف على أنه شكل دائري.ويلاحظ أن اتّراء الكسر الرئيسي هو استخدام مزيج من اثنين من PAGEs في ظل ظروف الديساتر في قوة الأيونية العالية والمنخفضة. يمكن تنقية إعداد الحمض النووي الريبي (RNA) عن طريق إجراء تبادل اللوني. كما رأينا هنا ، يتم الاحتفاظ بـ E.Coli RNA بكفاءة في قوة أيونية منخفضة ، ثم يتم الحصول عليها في قوة أيونية عالية ، مع معظم الحمض النووي الريبي الذي يتم جمعه في الكسور الثانية والثلاثة.يمكن تنقية الحمض النووي الريبي المؤتلف إلى التجانس بواسطة 2-D electrophoresis. يسمح هذا البروتوكول بإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في الإشريكية القولونية وتنقيتها إلى التجانس بفضل دائرية المنتج النهائي. تذكر أن الحمض النووي الريبي من نتائج الفائدة جزءا لا يتجزأ من سقالة الجيش الملكي النيبالي دائرية مستمدة من viroid النبات.إذا كنت ترغب في فصل كلا moieties، تحتاج إلى استخدام استراتيجية قياسية، مثل ريبوزيميس، DNAzymes، أو العائد H.The RNase من هذا البروتوكول يعتمد على الحمض النووي الريبي خاصة من الفائدة، كما RNAs الصغيرة من المرجح أن تنتج بكميات أكبر من تلك أكبر. للتعبيرات على نطاق أوسع، تأخذ في الاعتبار أن الوقت الأمثل لحصاد البكتيريا يعتمد على العديد من العوامل بما في ذلك سلالة الإشريكية القولونية، متوسط الثقافة، وظروف النمو. نوصي بإجراء فحص الدورة التدريبية في الوقت الأولي للعثور على نافذة الإنتاج الأمثل في ظروفك الخاصة.تذكر أن الرنا المؤتلف تتراكم في الخلايا البكتيرية بشكل عابر ، وأنها تختفي تمامًا في مرحلة النمو المتأخر.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

توجه التغليف البروتين داخل الخارجي غشاء الحويصلات من<em&gt; كولاي</em&gt;: تصميم وإنتاج وتنقية

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من<em&gt; كولاي</em&gt; الوصيفة HdeB<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

التحديد الكمي للوفرة وفرض مستويات نقل الكشف في الإشريكيّة القولونية

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

الطفرات موقع الموجه لفي المختبر وفي فيفو التجارب المتمثلة بالتفاعلات الحمض النووي الريبي في الإشريكيّة القولونية

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

استخدام عنصر Alu الذي يحتوي على جينات صغيرة لتحليل الحمض النووي الريبي الدائري

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

إعادة تشكيل المستحضرات المؤتلفة Drosophila Atlastin في Liposomes لفحوصات خلط الدهون

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

موقع محدد ليسين أسيتيل الهستونات لإعادة تشكيل النوكليوسوم باستخدام توسيع الشفرة الوراثية في الإشريكية القولونية

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...