Name: large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

这项工作得到了西班牙创新大学 ciencia 部长的 BIO2017-83184-r 和 bio2017-91865-exp 赠款的支持。

1. 质粒结构
<ol><li>
通过 pcr (如果从 rna 模板开始, 通过逆转录酶 pcr) 放大与感兴趣的 rna 相对应的 cdna, 使用具有 5 ' 延伸的引物, 允许组装到表达质粒中。为避免不需要的突变, 请使用高保真 dna 聚合酶。
	<ol>
<li>要在 gibson 组装20的表达质粒中插入cdna, 请在 pcr 引物中添加以下5个扩展: 前进, 5 '-tccccccccccccccctcctccttxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx...

<ol>
	<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Research+on+Non-Coding+Ribonucleic+Acid+(RNA).">Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA).</a> Genes. 8 (12), (2017).</li><li>Hamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+approaches+to+RNA+aptamer+design.">In silico approaches to RNA aptamer design.</a> Biochimie. 145, 8-14 (2018).</li><li>Bobbin, M. L., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)-Based+Therapeutics:+Delivering+on+the+Promise?.">RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).</li><li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+for+Mosquito+and+Mosquito-Borne+Disease+Control.">RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control.</a> Insects. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expression+and+purification+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Methods. 54 (2), 267-273 (2011).</li><li>Kikuchi, Y., Umekage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nucleic+acids+of+the+marine+bacterium+Rhodovulum+sulfidophilum+and+recombinant+RNA+production+technology+using+bacteria.">Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+RNA+technology:+the+tRNA+scaffold.">Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold.</a> Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).</li><li>Batey, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+methods+for+native+expression+and+purification+of+RNA+for+structural+studies.">Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).</li><li>El Khouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+RNA-Protein+Complexes+in+Escherichia+coli.">Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli.</a> Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).</li><li>Ponchon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+RNA-protein+complexes+in+Escherichia+coli+and+applications+to+RNA+biology.">Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology.</a> Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).</li><li>Umekage, S., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+production+and+purification+of+circular+RNA+aptamer.">In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer.</a> Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).</li><li>Dar&#242;s, J. -. A., Aragon&#233;s, V., Cordero, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viroid-derived+system+to+produce+large+amounts+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids:+small+noncoding+infectious+RNAs+with+the+remakable+ability+of+autonomous+replication.">Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication.</a> Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).</li><li>Flores, R., Hern&#225;ndez, C., Mart&#237;nez de Alba, A. E., Dar&#242;s, J. A., Di Serio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+and+viroid-host+interactions.">Viroids and viroid-host interactions.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).</li><li>Di Serio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICTV+Virus+Taxonomy+Profile:+Avsunviroidae.">ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae.</a> The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).</li><li>Nohales, M. A., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroid+RNA+redirects+host+DNA+ligase+1+to+act+as+an+RNA+ligase.">Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).</li><li>Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+chloroplastic+isoform+of+tRNA+ligase+in+the+replication+of+viroids+belonging+to+the+family+Avsunviroidae.">Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggplant+latent+viroid:+a+friendly+experimental+system+in+the+family+Avsunviroidae.">Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).</li><li>Cordero, T., Ortol&#224;, B., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+Eggplant+Latent+Viroid+RNA+Circularization+by+the+Eggplant+tRNA+Ligase+in+Escherichia+coli.">Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li><li>Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-dimensional+electrophoretic+technique+for+the+detection+of+circular+viroids+and+virusoids.">A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids.</a> Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).</li><li>Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+electrophoretic+properties+of+solubilizable+disulfide+gels.">Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels.</a> Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).</li><li>Gigu&#232;re, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+structures+of+all+members+of+the+Avsunviroidae+family.">Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family.</a> Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).</li><li>L&#243;pez-Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+initiation+sites+of+eggplant+latent+viroid+strands+map+within+distinct+motifs+in+their+in+vivo+RNA+conformations.">The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations.</a> RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).</li></ol>

在研究茄子 trna 连接酶识别所涉及的 elvd 序列和结构要求时, 我们注意到, 这两种分子在非宿主大肠杆菌中的共同表达导致了病毒性循环的意外大量积累在细菌细胞19形成。据我们了解,大肠杆菌中病毒性 rna 的大量积累很可能是共同表达高度稳定的 rna 分子的结果, 例如相对较小 (333 nt)、高度基成对的圆形病毒, 以及一种蛋白质。特定的病毒性表现出很高的亲和力。elvd...

与 dna 和蛋白质相比, 用于轻松、高效且经济高效地生产大量 rna 的协议并不丰富。然而, 研究和工业对这些生物分子的需求越来越大, 以研究其独特的生物特性1, 或用于复杂的生物技术应用, 包括将其用作高度特异性的2、治疗剂3种, 或选择性农药4种。体外转录和化学合成是研究的常用, 以产生 rna。然而, 当需要大量产品时, 这些方法会带来重要的限制。合理的选择是使用活细胞的内源性转录机制, 然后是一个纯化过程, 将感兴趣的 rna 与细胞同伴分开。根据这一策略, 已经开发出在细菌细胞中产生重组 rna 的方法, 如实验室友好的大肠杆菌5或海洋紫色光养的α-α-天菌6. 在细菌中产生重组 rRNA 的大多数方法依赖于本地高度稳定的 rRNA 支架的表达, 如 rrna 或 rrna, 其中插入了感兴趣的 rRNA 7。这就要求有必要释放嵌合分子感兴趣的 rna, 如果额外的 rna 的存在是下游应用的一个问题8。重组 rna 生物技术的另一个概念是生产重组核糖核酸蛋白复合物, 这些复合物本身可能是所需的产物,也可能被用作保护策略, 以提高感兴趣的 rna 的稳定性9, 10个。同样, 还建议将生产圆形区域协定作为生产更稳定产品的战略 11。
我们最近开发了一种新的方法来产生大肠杆菌中的大量重组 rna , 该方法参与了上述三个概念: 将感兴趣的 rna 插入一个高度稳定的圆形 rna 支架, 以及重组 rna 与相互作用的蛋白质, 很可能产生一个稳定的核糖核酸蛋白复合物, 积累在显着的数量在细菌细胞12。与之前的发展不同的是, 我们使用了一个与大肠杆菌完全陌生的 rna 支架, 即病毒。病毒是一种非常特殊类型的高等植物的传染因子, 完全由相对较小 (246-401 nt) 高度基对圆形 rna13组成。有趣的是, 病毒是非编码的 rna, 在没有自己蛋白质帮助的情况下, 它们能够在受感染的宿主14 中完成复杂的感染周期。这些周期包括 rna-rna 在细胞核或叶绿体中的复制, 这取决于病毒科--分别是松足动物科或阿夫松弧虫科--通过受感染的植物移动和躲避宿主的防御反应。病毒必须被列为自然界中最稳定的 rna 之一, 因为它是一个赤裸的圆形 rna, 必须在植物感染细胞的恶劣环境中生存。这种特性可能使病毒体特别适合作为支架, 在生物技术方法中稳定重组 rna。此外, 新方法还基于病毒性支架与相互作用的植物蛋白的共表达。病毒通过滚动圈机制复制, 在这个机制中, 寄主酶被招募来催化这个过程的不同步骤。值得注意的是, 一些病毒, 更具体地说, 属于avsunviroidae 15家族的病毒体含有也参与复制的核酶。根据病毒种的不同, 病毒性 rna 的转录是由宿主 rna 聚合酶 ii 或氯塑核编码 rna 聚合酶 (nep) 介导的。病毒 rna 的处理似乎是由宿主 iii 型 rnase 催化的, 尽管在具有核酶寡聚 rna 的病毒中, 在复制过程中, 病毒的染色体是自裂的。最后, 所产生的病毒物单体是循环的, 这取决于病毒族, 由宿主 dna 连接酶1或氯乙烯基等形态的 trna 连接酶 16,17。这最后一种酶参与了黄曲霉家族中病毒体单体形式的结扎, 如茄子潜伏性病毒(elvd)18。
在分析茄子 (solanum melongena l.) trna 连接酶识别的 elvd 序列和结构要求的过程中, 我们建立了一个基于大肠杆菌中两种分子共表达的实验系统19. 我们注意到, 在大肠杆菌细胞中, 通过嵌入的锤头核酶有效地自我裂解, 由此产生的病毒性单体具有 5 '-羟基和 2 ', 3 '-磷酸二酯末端。通过共表达的茄子 trna 连接酶有效地循环。更重要的是, 产生的圆形病毒 rna 在大肠杆菌中达到了意想不到的高浓度, 超过了内源性 rnas12。复制中间体的缺乏表明这些细菌细胞中缺乏 elvd rna-rna 扩增。有趣的是, 在病毒分子的特定位置插入异源 rna 对圆形病毒性 rna rna 12 的积累有一定的影响.这些观察使我们设想了一种在细菌中产生大量重组 rna 的方法。在这种方法中 , 与感兴趣的 rna 相对应的 cDNAs 入 elvd cDNAs 中 , 由此产生的嵌合 rna 通过一个强大的本构启动子在大肠杆菌中表达。为了使系统发挥作用,大肠杆菌必须与质粒共同转化, 以表达茄子 trna 连接酶。elv 衍生的比单位长的转录是由嵌入锤头核酶处理的, 所产生的具有适当终点的单体由共同表达的 trna 连接酶识别和循环。这样 , 感兴趣的 rna 入到一个非常稳定的圆形支架组成的病毒性圆形分子。这种重组嵌合 rna 很可能通过与 trna 连接酶的相互作用而形成核糖核酸蛋白复合物, 从而在大肠杆菌细胞内进一步稳定。使用这种方法 (见下面的协议), rna 适配体, 发夹 rna 和其他结构性 rna 已很容易地产生的数量达几十毫克每升大肠杆菌培养在正常的实验室条件下, 并纯化到同质化采取循环12的优点.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bpi I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010</td>
			<td>D1 low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131008.1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>Ba2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>48045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>X1402.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131785.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucloSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>22740588.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69387-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115(DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref. Timmons et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C 0113.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1211</td>
			<td>87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131509.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122333.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131020.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>FE04791000</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3691,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap DEAE Sepharose FF column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5055-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTAprime plus liquid chromatography system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>11001313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamyde</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1089,1000</td>
			<td>2K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>146392.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2940,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0937,2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Bis(acryloyl)cystamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4929-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli

随着人们对 rna 生物学的兴趣越来越大, 以及 rna 分子在复杂的生物技术应用中的应用, 产生大量重组 rna 的方法是有限的。在这里, 我们描述了一种在大肠杆菌中产生大量重组 rna 的协议, 该协议基于嵌合分子的共表达, 其中含有病毒性支架和植物 trna 连接酶中感兴趣的 rna。病毒是相对较小的, 非编码, 高度基成的圆形 rna, 具有传染性较高的植物。宿主植物 trna 连接酶是一种由属于avsunviroidae 家族的病毒体 (如茄子潜伏性病毒体 (elvd)) 所吸收的酶, 用于在病毒复制过程中介导 rna 循环。虽然 elvd 不在大肠杆菌中复制, 但 elvd 前体被大肠杆菌rna 聚合酶有效转录, 并由细菌细胞中嵌入的锤头核酶进行处理, 由此产生的单体由共表达的 trna 连接酶达到显著浓度。将感兴趣的 rna 插入 elvd 支架, 可在常规实验室条件下每升细菌培养产生数十毫克的重组 rna。rna 产物的一个主要部分是圆形的, 这一特性有助于将重组 rna 纯化到虚拟同质性。在该协议中 , 与感兴趣的 rna 相对应的互补 dna ( cdna ) 入到 elvd cdna 的特定位置 , 在表达质粒中被用来 , 沿着质粒共同表达茄子 trna 连接酶 , 来转化大肠杆菌。在强本构启动子的控制下, 这两种分子的共表达导致大量重组 rna 的产生。重组 rna 可以从细菌细胞中提取, 并利用其循环性从大量细菌 rna 中分离出来。

为了利用 elvd 衍生系统12在大肠杆菌中产生重组 rna, 将感兴趣的 rna 嫁接到 elvd rna 支架中。这种嵌合 rna 沿着大肠杆菌中的茄子 trna 连接酶共同表达。一旦加工、裂解和循环, 感兴趣的 rna 从其中突出的嵌合性圆形 rna, 很可能与共表达的茄子酶形成核糖核酸蛋白复合物, 在细菌细胞中达到显著的浓度 (图 1)。因此, 使用该?...

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Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

利用病毒衍生系统在大肠杆菌中大规模生产圆形脚手架上的重组 rna

在这里, 我们提出了一个协议, 通过共同表达一个嵌合 rna, 其中包含对病毒性支架和植物 trna 连接酶感兴趣的 rna, 在大肠杆菌中产生大量的重组 rna。主要产品是一个圆形分子, 有利于纯化到均匀性。

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

此方法有助于产生大量感兴趣的重组RNA，用于研究或工业。主要优点是重组RNA在大肠杆菌中产生，其成本低廉，易于放大。重要的是，RNA产生于圆形RNA支架上，有助于纯化到同质性。与DNA或蛋白质相比，感兴趣的RNA在生物工厂系统中不容易产生大量，例如大肠杆菌培养。我们的方法基于将感兴趣的RNA的共表达插入到高度稳定的圆形基架中，并应用一种连接RNA循环的连体。圆形RNA支架源自获得专利的振动机器人。病毒是相对较小的，非线圈，高度基对对的圆形RNA，对一些更高的植物具有传染性。我们可以在常规的实验室条件下，每公升细菌培养产生几十毫克的重组RNA。要开始此过程，请按文本协议中概述的 PCR 放大 cDNA。接下来，在0.5毫升管中加入100毫微克质粒pLELVd-BZB。加入10U型IIS限制酶BpiI和足够的缓冲G，形成20微升反应。在37摄氏度下孵育一小时，消化质粒。在此之后，在TAI缓冲液中用1%的阿加糖凝胶中电泳分离PCR和消化产品。以每毫升0.5微克的浓度摇动200毫升溴化乙基基，将凝胶染色。使用紫外线转光器，可视化DNA。使用手术刀切出与放大的cDNA和BpiI消化质粒对应的带子。使用硅胶柱，从凝胶片段中分出DNA。通过分光光度测量分析量化DNA的浓度。使用放大的 cDNA 和消化的质粒建立吉布森组装反应。在50摄氏度下孵育一小时。然后，使用硅胶柱来净化反应。电选合格的大肠杆菌DH5-Alpha细胞后，选择几个白色菌落，并转移到液体LB介质。在37摄氏度下过夜生长的殖民地。接下来，使用迷你预发套件来净化质粒，并在 TAE 缓冲液中用 1% 的 agarose 凝胶通过电泳分析其大小。首先，使用含有与感兴趣的RNA对应的cDNA和质粒P15LTRNISM共同表达茄子tRNA连结酶的pLELVd-BZB导数，共同对选定的大肠杆菌菌株进行共电。将S、C液体介质转移到电穿孔中以回收细胞，并在37摄氏度下孵育一小时。然后，将细菌板在LB固体介质上，每毫升安他西林含有50微克，每毫升氯霉素含有34微克。一夜之间在37摄氏度下孵育。第二天，在一升的Erlenmeyer烧瓶中加入250毫升的液体TB介质，每毫升含有50微克的安皮西林，每毫升氯霉素含有34微克。取回孵化的大肠杆菌，然后挑选一个菌落，在烧瓶中接种介质。在37摄氏度下孵育，在180 RPM下剧烈摇晃12至16小时，然后采集细菌。将收获的E.Coli培养剂倒入250毫升的离心瓶中，以14000G的基转10分钟。丢弃上一杯，将细胞重新在30毫升水中。将此悬浮液转移到离心管中，并使用以前的条件再次旋转电池。丢弃上流剂，向细胞颗粒中加入10毫升色谱缓冲液。漩涡以重新填充缓冲器中的细胞。大力加入一卷酚：氯仿和涡流，以破坏细胞。然后，在12，000G下离心10分钟。恢复水相，加入一卷氯仿，并大力涡流。在12，000G下离心10分钟。在此之后，通过 45 微米注射器过滤器过滤 RNA 制备。使用连接到液相色谱系统的一毫升二乙基乙醇胺柱净化RNA。将流速调整为每分钟 1 毫升，并用 10 毫升色谱缓冲液平衡柱。然后，加载样品，用 10 毫升色谱缓冲液清洗柱。用20毫升洗脱缓冲液洗取RNA，并收集1毫升等同。使用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，将圆形RNA与线性RNA分离。首先，在TBE缓冲液中准备5%的聚丙烯酰胺凝胶，并含有8个摩尔尿素，如文本协议中所述。将 20 微升RNA制剂与一卷加载缓冲液混合。在95摄氏度的加热块中孵育1.5分钟，然后在冰上捕捉冷却。将样品装在聚丙烯酰胺凝胶中，并在凝胶尺寸的适当条件下运行电泳。在此之后，将凝胶染色为每毫升0.5微克溴化乙基，15分钟。用水清洗染色凝胶，然后在紫外线下将RNA可视化。与pLEVd-BZB相比，对插入不同cDNA的几种重组质粒进行电泳分析，显示迁移情况不同。请注意，pLELVd-BZB 包含 lacZ 标记，该标记由与感兴趣的 RNA 对应的 cDNA 替换，因此，虽然迁移确实取决于插入的 cDNA 的大小，但重组质粒的迁移速度通常比控制质粒快。通过破坏细胞和通过变性页面分析RNA来监测共电分培养物中重组RNA的产生。可以看到强频带，它们对应于空的ELVd和嵌合ELVd形式，其中插入了不同的感兴趣的RNA。有趣的是，重组RNA的主要部分被视为圆形。在高离子强度和低离子强度的变性条件下，使用两个PAGEs的组合来观察主要分数的循环性。RNA制剂可以通过腺质交换色谱进一步纯化。如这里所见，E.Coli RNA在低离子强度下有效保留，随后在高离子强度下洗出，大部分RNA以第二和三分数收集。重组RNA可以通过二维电泳进一步纯化为均匀性。该协议允许通过最终产品的循环性，在大肠杆菌中轻松生产大量重组RNA，并纯化为均匀性。请记住，感兴趣的RNA结果嵌入到从植物振动机器人衍生的圆形RNA支架中。如果您希望分离这两种生物，则需要使用标准策略，如核糖核素、DNAzymes 或 RNase H. 此协议的产生取决于感兴趣的特定 RNA，因为小型RNA的生成量可能高于较大的RNA。对于较大规模的表达，考虑到收获细菌的最佳时间取决于许多因素，包括大肠杆菌菌株、培养基和生长条件。我们建议进行初步时间测试，以找到特定条件下的最佳生产窗口。请记住，重组RNA在细菌细胞中短暂积累，并在生长后期完全消失。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

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从外膜囊泡内蛋白质导演包装<em&gt;大肠杆菌</em&gt;：设计，生产和纯化

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

科研

生物化学

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

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的pH依赖性活性的检测<em&gt;大肠杆菌</em&gt;陪护HdeB<em&gt;体外</em&gt;和<em&gt;在体内</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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使用脚手架脂质体重构脂质近端蛋白质 - 蛋白质相互作用<em&gt;体外</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

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