Name: large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud BIO2017-83184-R og BIO2017-91865-EXP fra den spanske Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (samfinansierede FEDER midler).

1. plasmid konstruktion
<ol><li>
Forstærke ved PCR (eller reverse transkription PCR hvis start fra en RNA skabelon) cDNA svarende til RNA af interesse ved hjælp af primere med 5' forlængelse tillade forsamling i udtryk plasmid. For at undgå uønskede mutationer, bruge en high-fidelity DNA polymerase.
	<ol>
<li>Hvis du vil indsætte cDNA i udtryk plasmid af Gibson forsamling20, tilføje de følgende 5' udvidelser til PCR-primere: fremad, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXX...

<ol>
	<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Research+on+Non-Coding+Ribonucleic+Acid+(RNA).">Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA).</a> Genes. 8 (12), (2017).</li><li>Hamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+approaches+to+RNA+aptamer+design.">In silico approaches to RNA aptamer design.</a> Biochimie. 145, 8-14 (2018).</li><li>Bobbin, M. L., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)-Based+Therapeutics:+Delivering+on+the+Promise?.">RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).</li><li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+for+Mosquito+and+Mosquito-Borne+Disease+Control.">RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control.</a> Insects. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expression+and+purification+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Methods. 54 (2), 267-273 (2011).</li><li>Kikuchi, Y., Umekage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nucleic+acids+of+the+marine+bacterium+Rhodovulum+sulfidophilum+and+recombinant+RNA+production+technology+using+bacteria.">Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+RNA+technology:+the+tRNA+scaffold.">Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold.</a> Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).</li><li>Batey, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+methods+for+native+expression+and+purification+of+RNA+for+structural+studies.">Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).</li><li>El Khouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+RNA-Protein+Complexes+in+Escherichia+coli.">Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli.</a> Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).</li><li>Ponchon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+RNA-protein+complexes+in+Escherichia+coli+and+applications+to+RNA+biology.">Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology.</a> Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).</li><li>Umekage, S., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+production+and+purification+of+circular+RNA+aptamer.">In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer.</a> Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).</li><li>Dar&#242;s, J. -. A., Aragon&#233;s, V., Cordero, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viroid-derived+system+to+produce+large+amounts+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids:+small+noncoding+infectious+RNAs+with+the+remakable+ability+of+autonomous+replication.">Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication.</a> Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).</li><li>Flores, R., Hern&#225;ndez, C., Mart&#237;nez de Alba, A. E., Dar&#242;s, J. A., Di Serio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+and+viroid-host+interactions.">Viroids and viroid-host interactions.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).</li><li>Di Serio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICTV+Virus+Taxonomy+Profile:+Avsunviroidae.">ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae.</a> The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).</li><li>Nohales, M. A., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroid+RNA+redirects+host+DNA+ligase+1+to+act+as+an+RNA+ligase.">Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).</li><li>Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+chloroplastic+isoform+of+tRNA+ligase+in+the+replication+of+viroids+belonging+to+the+family+Avsunviroidae.">Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggplant+latent+viroid:+a+friendly+experimental+system+in+the+family+Avsunviroidae.">Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).</li><li>Cordero, T., Ortol&#224;, B., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+Eggplant+Latent+Viroid+RNA+Circularization+by+the+Eggplant+tRNA+Ligase+in+Escherichia+coli.">Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li><li>Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-dimensional+electrophoretic+technique+for+the+detection+of+circular+viroids+and+virusoids.">A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids.</a> Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).</li><li>Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+electrophoretic+properties+of+solubilizable+disulfide+gels.">Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels.</a> Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).</li><li>Gigu&#232;re, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+structures+of+all+members+of+the+Avsunviroidae+family.">Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family.</a> Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).</li><li>L&#243;pez-Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+initiation+sites+of+eggplant+latent+viroid+strands+map+within+distinct+motifs+in+their+in+vivo+RNA+conformations.">The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations.</a> RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).</li></ol>

Mens forsker ELVd sekvens og struktur krav involveret i anerkendelse af den aubergine tRNA ligase, bemærket vi, at fælles udtryk for begge molekyler i den ikke-vært E. coli førte til en uventet stor ophobning af viroid cirkulære former i bakterieceller19. Vi forstod, at den store ophobning af viroid RNA i E. coli sandsynligvis var konsekvensen af co udtrykker en yderst stabil RNA-molekyle, som de relativt små (333 nt), stærkt baseret-parret, cirkulær viroid, og et protein...

I modsætning til DNA og proteiner er protokoller for nem, effektiv og omkostningseffektiv produktion af store mængder af RNA ikke rigelige. Men forskning og industri efterspørgsel stigende mængder af disse biomolekyler at undersøge deres unikke biologiske egenskaber1, eller at være ansat i avancerede bioteknologiske applikationer, herunder deres brug som meget specifikke aptamers 2, terapeutiske agenter3eller selektiv pesticider4. In vitro transskription og kemisk syntese er almindeligt anvendt i forskning til at producere RNA. Men disse metoder indebærer vigtige begrænsninger når store mængder af produkterne, der er påkrævet. Den logiske alternativ er at bruge den endogene transskription maskiner af levende celler, efterfulgt af en rensningsproces at adskille RNA'er af interesse fra den cellulære ledsagere. Efter denne strategi metoder er blevet udviklet til at producere rekombinant RNA'er i bakterieceller, såsom lab-venlige Escherichia coli5 eller den marine lilla fototopiske alpha-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. de fleste metoder til at producere rekombinant RNA i bakterier stole på udtryk for en indfødt yderst stabil RNA stillads, såsom en tRNA eller en rRNA, hvor RNA af interesse er indsat7. Dette pålægger nødvendigheden af at frigive RNA af interesse fra de kimære molekyle, hvis tilstedeværelsen af ekstra RNA er et problem for downstream programmer8. Et andet koncept i rekombinant RNA bioteknologi er produktionen af rekombinante ribonucleoprotein komplekser, som kan være den ønskede vare i sig selv eller bruges som en beskyttende strategi til at øge stabiliteten i RNA interesse9, 10. På samme måde, er produktionen af cirkulære RNA'er også blevet foreslået som en strategi til at generere mere stabile produkter11.
Vi har for nylig udviklet en ny metode til at producere store mængder af rekombinant RNA i E. coli , der deltager i tre af de ovennævnte begreber: indsættelse af RNA af interesse i en yderst stabil cirkulært RNA stillads og co udtryk for den rekombinant RNA med en interagerende protein sandsynligvis producere en stabil ribonucleoprotein kompleks, der ophobes i bemærkelsesværdigt beløb i bakteriel celler12. I modsætning til tidligere udvikling brugte vi en RNA stillads helt fremmed for E. coli, nemlig en viroid. Viroider er en meget bestemt type af smitsomme agenser af højere planter, der er udelukkende udgøres af en relativt lille (246-401 nt) meget base-parret cirkulært RNA13. Interessant, viroider ikke-kodende RNA'er, og ingen hjælp fra deres egne proteiner, de er i stand til at fuldføre komplekse smitsomme cykler i inficerede værter14. Disse cyklusser omfatter RNA til RNA replikering i kerner eller grønkorn, afhængigt af familien viroid —Pospiviroidae eller Avsunviroidae, henholdsvis — bevægelse gennem de inficerede anlæg og unddragelse af vært defensive svar. Viroider skal være rangeret blandt de mest stabile RNA'er i naturen, som følge af at være en nøgen cirkulært RNA og skulle overleve i den barske miljø af inficeret planteceller. Denne egenskab kan gøre viroider især velegnet som stilladser til at stabilisere rekombinant RNA i bioteknologiske metoder. Desuden er den nye metode baseret på fælles udtryk for viroid stillads med en interagerende vegetabilske proteiner. Viroider replikere gennem en rullende cirkel mekanisme i hvilken vært enzymer er rekrutteret til at katalysere de forskellige trin i processen. Især nogle viroider, mere konkret dem, der tilhører familien Avsunviroidae15, indeholder ribozymer, der er også involveret i replikation. Dyrearten viroid er transskription af viroid RNA'er medieret af værten RNA polymerase II eller for chloroplastic nukleare-kodet RNA polymerase (NEP). Viroid RNA forarbejdning synes at blive katalyseret af et host type III RNase, selvom i viroider med ribozymer oligomere RNA mellemprodukter selvstændige spaltes under replikering. Endelig, de resulterende viroid monomerer er circularized, afhængigt af familien viroid af vært DNA ligase 1 eller den chloroplastic isoform af tRNA ligase16,17. Denne sidste enzym er involveret i ligatur af de monomere former for viroider i familien Avsunviroidae, såsom aubergine latent viroid (ELVd)18.
I løbet af et værk til at analysere sekvens og strukturelle krav til ELVd der bestemmer anerkendelse af aubergine (Solanum melongena L.) tRNA ligase, vi oprette en eksperimentel system baseret på fælles udtryk for begge molekyler i E. coli 19. vi bemærket at længere end enhed ELVd transkripter selv kløver effektivt i E. coli celler gennem integrerede hammerhead ribozymer og at de resulterende viroid monomerer med 5'-hydroxyl og 2', 3'-phosphodiester termini var effektivt circularized af co udtrykt aubergine tRNA ligase. Endnu mere nået den resulterende cirkulære viroid RNA en uventet høj koncentration i E. coli, overstiger de endogene rRNAs12. Fravær af replikering mellemprodukter angivet manglende ELVd RNA til RNA forstærkning i disse bakterieceller. Interessant, havde indsættelse af heterolog RNA'er i en bestemt stilling af viroid molekyle en moderat effekt på ophobning af den cirkulære viroid-afledte RNA'er12. Disse observationer gjort os forestiller en metode til at producere store mængder af rekombinant RNA'er i bakterier. I denne metode, cDNAs svarende til RNA'er af interesse er indsat i ELVd cDNA og den resulterende kimære RNA er udtrykt i E. coli gennem en stærk konstitutive promoter. For at systemet kan fungere, skal E. coli omdannes sammen med et plasmid at udtrykke den aubergine tRNA ligase. ELVd-afledte længere end enhed udskrift er behandlet af integrerede hammerhead ribozymer og de deraf følgende monomerer med de passende termini er anerkendt og circularized af de Co udtrykt tRNA ligase. På denne måde er RNA af interesse indsat i en meget stabil cirkulære stillads bestående af viroid cirkulære molekyle. Denne rekombinant kimære RNA er sandsynligvis yderligere stabiliseret inde i E. coli cellerne ved dannelsen af et komplekst samspil med tRNA ligase ribonucleoprotein. Ved hjælp af denne metode (se protokollen nedenfor), RNA aptamers, hårnål RNA'er og andre strukturerede RNA'er er let produceres i mængder af snesevis af E. coli kultur i regelmæssig laboratorieforhold mg pr. liter og renset til homogenitet tager fordel af cirkularitet12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bpi I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010</td>
			<td>D1 low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131008.1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>Ba2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>48045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>X1402.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131785.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucloSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>22740588.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69387-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115(DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref. Timmons et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C 0113.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1211</td>
			<td>87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131509.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122333.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131020.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>FE04791000</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3691,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap DEAE Sepharose FF column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5055-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTAprime plus liquid chromatography system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>11001313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamyde</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1089,1000</td>
			<td>2K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>146392.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2940,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0937,2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Bis(acryloyl)cystamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4929-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli

Med stigende interesse i RNA biologi og brugen af RNA molekyler i avancerede bioteknologiske applikationer, er metoder til at producere store mængder af rekombinant RNA'er begrænset. Her, vi beskriver en protokol til at producere store mængder af rekombinant RNA i Escherichia coli baseret på fælles udtryk for en kimære molekyle, der indeholder RNA interesse i en viroid stillads og en plante tRNA ligase. Viroider er relativt små, ikke-kodende, stærkt base-parret cirkulære RNA'er, der er smittefarlige til højere planter. Værten plante tRNA ligase er et enzym, der er ansat af viroider, der tilhører familien Avsunviroidae, såsom aubergine latent viroid (ELVd), for at mægle RNA circularization under viroid replikering. Selv om ELVd ikke replikerer i E. coli, en ELVd forløber effektivt er transskriberet af E. coli RNA polymerase og behandles af integrerede hammerhead ribozymer i bakterieceller, og de deraf følgende monomerer er circularized af den Co udtrykt tRNA ligase at nå frem til en bemærkelsesværdig koncentration. Indføjelsen af et RNA interesse i ELVd stillads muliggør fremstilling af snesevis af rekombinant RNA pr. liter bakteriekulturen regelmæssig laboratoriegodkendte mg. En vigtigste brøkdel af RNA produkt er cirkulær, en funktion, der letter rensning af af rekombinante RNA til virtuelle homogenitet. I denne protokol, er en supplerende DNA (cDNA) svarende til RNA af interesse indsat i en bestemt stilling af ELVd cDNA i et udtryk plasmidet, som langs plasmid Co udtrykke aubergine tRNA ligase, bruges til at omdanne E. coli. Co udtryk for begge molekyler under kontrol af stærke konstitutiv projektledere fører til produktion af store mængder af af rekombinante RNA. Den rekombinante RNA kan udvindes fra de bakterieceller og adskilt fra hovedparten af bakteriel RNA'er udnytter sin cirkularitet.

For at producere rekombinant RNA i E. coli ved hjælp af ELVd-afledte system12, er RNA af interesse podet ind en ELVd RNA stillads. Denne kimære RNA er co udtrykt langs den aubergine tRNA ligase i E. coli. Når forarbejdet, kløvet og circularized, danner de kimære cirkulært RNA, som stikker RNA af interesse, sandsynligvis en kompleks med co udtrykt aubergine enzymet, der når bemærkelsesværdige koncentration i bakterieceller (<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Storproduktion af rekombinant RNA'er på en cirkulær stillads ved hjælp af en Viroid-afledte System i Escherichia coli

Vi præsenterer her, en protokol til at producere store mængder af rekombinant RNA i Escherichia coli co udtrykke en kimære RNA, der indeholder RNA interesse i en viroid stillads og en plante tRNA ligase. Det vigtigste produkt er en cirkulær molekyle, der letter rensning til ensartethed.

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Denne metode kan bidrage til at producere store mængder af rekombinant RNA'er af interesse for anvendelse i forskning eller industri. Den største fordel er, at rekombinant RNA produceres i Escherichia coli i en billig proces, der let kan skaleres op. Det er vigtigt, at RNA produceres på et cirkulært RNA-stillads, hvilket letter rensning til homogenitet.I modsætning til DNA eller proteiner, RNA'er af interesse er ikke let produceres i store mængder i biofabrik systemer, sådan en Escherichia coli kultur. Vores metode er baseret på co-udtryk af RNA af interesse indsat i en meget stabil cirkulær stillads og anvende en ligase, der formidler RNA rundføring. Det cirkulære RNA-stillads stammer fra en patenteret viroid.Viroider er relativt små, ikke-coiling, meget base-parret cirkulære RNA'er, der er smitsom for nogle højere planter. Vi kan producere snesevis af milligram af rekombinant RNA per liter bakteriekultur i regelmæssige laboratorieforhold. For at starte denne procedure skal du forstærke cDNA med PCR som beskrevet i tekstprotokollen.Dernæst tilsættes 100 nanogram af plasmid pLELVd-BZB til et 0,5 milliliterrør. Tilføj 10 U af typen IIS begrænsning enzym BpiI og nok af buffer G til at skabe en 20 microliter reaktion. Inkubere ved 37 grader Celsius i en time for at fordøje plasmid.Derefter skal PCR- og fordøjelsesprodukterne adskilles ved elektroforese i en agarosegel på én procent i TAE-bufferen. Pletten gelen ved at ryste den i 200 milliliter ethidiumbromid ved en koncentration på 0,5 mikrogram pr. milliliter. Ved hjælp af en UV transilluminator, visualisere DNA.Brug en skalpel til at skære de bånd, der svarer til den forstærkede cDNA og BpiI fordøjet plasmid. Ved hjælp af silica gel kolonner, elute DNAs fra gel fragmenter. Kvantificer koncentrationen af DNA'et ved spektrofotometrisk analyse.Opret en Gibson Assembly reaktion ved hjælp af forstærket cDNA og fordøjet plasmid. Inkubere ved 50 grader Celsius i en time. Brug derefter en silicagelsøjle til at rense reaktionen.Efter elektroporering kompetente E.coli DH5-Alpha celler, vælge flere hvide kolonier og overføre dem til flydende LB medium. Dyrk kolonierne natten over ved 37 grader Celsius. Dernæst skal du bruge en miniprep kit til at rense plasmider, og analysere deres størrelser ved elektroforese i en en procent agarose gel i TAE buffer.Først co-electroporate den valgte E.coli stamme med både pLELVd-BZB derivat, der indeholder cDNA svarende til RNA af interesse og plasmid P15LTRNISM at co-udtrykke aubergine tRNA ligase. Overfør SOC flydende medium i elektroporation cuvette at inddrive cellerne, og inkubere ved 37 grader Celsius i en time. Derefter plade bakterierne på LB fast medium, der indeholder 50 mikrogram pr. milliliter ampicillin, og 34 mikrogram pr. milliliter chloramphenicol.Inkubere ved 37 grader Celsius natten over. Den næste dag tilsættes 250 milliliter flydende TB-medium, indeholdende 50 mikrogram pr. milliliterampicillin, og 34 mikrogram pr. milliliterchloramphenicol, til en en liter forvirret Erlenmeyerkolbe. Den inkuberede E.Coli hentes, og derefter plukkes en koloni, og mediet inokuleres i kolben.Inkubere ved 37 grader Celsius med kraftig omrystning ved 180 RPM i 12 til 16 timer før høst af bakterierne. Hæld den høstede E.Coli-kultur i en 250 millilitercentrifugeflaske, og drej cellerne ned ved 14.000 g i 10 minutter. Kassér supernatanten og opsvar cellerne igen i 30 milliliter vand.Overfør denne suspension til et centrifugerør, og drej cellerne ned igen ved hjælp af de tidligere forhold. Kassér supernatanten og tilsæt 10 milliliter kromatografibuffer til cellepellet. Vortex til at resuspendere cellerne i bufferen.Tilsæt et volumen af phenol: chloroform og vortex kraftigt at bryde cellerne. Derefter centrifuge ved 12,000 G i 10 minutter. Gendan den vandige fase, tilsæt et volumen af chloroform, og vortex kraftigt.Centrifuge ved 12,000 G i 10 minutter. Derefter filtreres RNA-præparatet gennem et 45 mikrometersprøjtefilter. Rengør RNA ved hjælp af en en milliliter diethyl ethanolamin kolonne forbundet til en flydende kromatografi system.Strømningshastigheden justeres til en milliliter pr. minut, og kolonnen skal ligevægte med 10 milliliter kromatografibuffer. Derefter indlæses prøven, og kolonnen vaskes med 10 milliliter kromatografibuffer. Eluter RNA med 20 milliliter elution buffer, og indsamle en milliliter aliquots.Ved hjælp af to-dimensionelle polyacrylamid gel elektroforese, adskille de cirkulære RNA'er fra deres lineære kolleger. Først forberede en fem procent polyarylamid gel i TBE buffer og indeholder otte molar urea som skitseret i tekstprotokollen. Bland 20 mikroliter af RNA-præparaterne med en volumen af læssebuffer.Inkubere ved 95 grader Celsius i en varmeblok i 1,5 minutter, og derefter snap-cool på is. Prøverne indlæses i polyakrylamidgelen, og elektroforesen køres under de rette betingelser for geldimensionen. Derefter plette gelen i 0,5 mikrogram per milliliter ethidium bromid i 15 minutter.Vask den farvede gel med vand, og visualiser derefter RNA under UV-lys. Elektrophoretic analyse af flere rekombinant plasmider, hvor forskellige cDNAs indsættes viser forskellige migrationer i forhold til pLELVd-BZB. Bemærk, at pLELVd-BZB indeholder lacZ-markøren, som erstattes af cDNA svarende til det relevante RNA, så mens migrationen afhænger af størrelsen af den indsatte cDNA, vil de rekombinant plasmider normalt migrere hurtigere end kontrolplasmid.Produktion af rekombinant RNA i co-elektroporated bakteriekulturer overvåges ved at bryde cellerne og analysere RNA ved at denaturere PAGE. Stærke bånd kan ses, hvilket svarer til tomme ELVd og kimære ELVd former, hvor forskellige RNA'er af interesse blev indsat. Interessant, en stor brøkdel af rekombinant RNA ses som en cirkulær form.Den cirkularitet af de vigtigste fraktion er observeret ved hjælp af en kombination af to PAGEs under denaturering betingelser ved høj og lav ionisk styrke. RNA-præparatet kan renses yderligere ved anionbytterkromatografi. Som det ses her, er E.Coli RNA effektivt bevaret ved lav ionisk styrke, og efterfølgende eluted ved høj ionisk styrke, med de fleste af RNA indsamles i fraktioner to og tre.Rekombinant RNA kan renses yderligere til homogenitet ved 2-D elektroforese. Denne protokol gør det nemt at få produktion af store mængder rekombinant RNA i Escherichia coli og rensning til homogenitet takket være det endelige produkts cirkularitet. Husk, at RNA af interesse resultater indlejret i en cirkulær RNA stillads stammer fra en plante viroid.Hvis du ønsker at adskille begge moieties, skal du bruge en standard strategi, såsom ribozymes, DNAzymes, eller RNase H.Udbyttet af denne protokol afhænger af den særlige RNA af interesse, som små RNAs sandsynligvis vil blive produceret i højere mængder end større. For større udtryk, tage hensyn til, at optimal tid til at høste bakterier afhænger af mange faktorer, herunder E.Coli stamme, kultur medium, og vækstbetingelser. Vi anbefaler en indledende tidskursusanalyse for at finde det optimale produktionsvindue under særlige forhold.Husk, at de rekombinante RNA'er ophobes i bakterieceller transgående, og at de helt forsvinder i den sene vækstfase.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Instrueret Protein Emballage inden ydermembranvesikler fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produktion og oprensning

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Påvisning af pH-afhængige aktivitet af<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In vitro</em&gt; og<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantificering af overfloden og opladning niveauer af overførsel RNA'er i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed mutagenese for In Vitro og i Vivo eksperimenter eksemplificeret med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Brug af Alu Element, der indeholder Minigenes til at analysere cirkulære RNA'er

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Vaskemiddel-assisteret rekonstitution af rekombinant Drosophila Atlastin til Liposomer til lipid-blanding assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specifik lysin acetylering af Histoner for nukleosom rekonstitution ved hjælp af genetisk kode ekspansion i Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...