Name: large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door subsidies BIO2017-83184-R en BIO2017-91865-EXP uit de Spaanse Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (medegefinancierd FEDER-fondsen).

1. plasmide bouw
<ol><li>
Versterken door PCR (of omgekeerde transcriptie PCR als vanaf een sjabloon van RNA) overeenkomt met de RNA van belang gebruikend inleidingen met 5' extensie toe vergadering in de expressie plasmide cDNA. Om te voorkomen dat ongewenste mutaties, gebruikt u een hifi-polymerase van DNA.
	<ol>
<li>Als u wilt invoegen de cDNA in het plasmide expressie door Gibson vergadering20, de volgende 5' extensies toevoegen aan de PCR inleidingen: forward, 5'-tctccccct...

<ol>
	<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Research+on+Non-Coding+Ribonucleic+Acid+(RNA).">Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA).</a> Genes. 8 (12), (2017).</li><li>Hamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+approaches+to+RNA+aptamer+design.">In silico approaches to RNA aptamer design.</a> Biochimie. 145, 8-14 (2018).</li><li>Bobbin, M. L., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)-Based+Therapeutics:+Delivering+on+the+Promise?.">RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).</li><li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+for+Mosquito+and+Mosquito-Borne+Disease+Control.">RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control.</a> Insects. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expression+and+purification+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Methods. 54 (2), 267-273 (2011).</li><li>Kikuchi, Y., Umekage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nucleic+acids+of+the+marine+bacterium+Rhodovulum+sulfidophilum+and+recombinant+RNA+production+technology+using+bacteria.">Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+RNA+technology:+the+tRNA+scaffold.">Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold.</a> Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).</li><li>Batey, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+methods+for+native+expression+and+purification+of+RNA+for+structural+studies.">Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).</li><li>El Khouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+RNA-Protein+Complexes+in+Escherichia+coli.">Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli.</a> Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).</li><li>Ponchon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+RNA-protein+complexes+in+Escherichia+coli+and+applications+to+RNA+biology.">Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology.</a> Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).</li><li>Umekage, S., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+production+and+purification+of+circular+RNA+aptamer.">In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer.</a> Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).</li><li>Dar&#242;s, J. -. A., Aragon&#233;s, V., Cordero, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viroid-derived+system+to+produce+large+amounts+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids:+small+noncoding+infectious+RNAs+with+the+remakable+ability+of+autonomous+replication.">Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication.</a> Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).</li><li>Flores, R., Hern&#225;ndez, C., Mart&#237;nez de Alba, A. E., Dar&#242;s, J. A., Di Serio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+and+viroid-host+interactions.">Viroids and viroid-host interactions.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).</li><li>Di Serio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICTV+Virus+Taxonomy+Profile:+Avsunviroidae.">ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae.</a> The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).</li><li>Nohales, M. A., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroid+RNA+redirects+host+DNA+ligase+1+to+act+as+an+RNA+ligase.">Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).</li><li>Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+chloroplastic+isoform+of+tRNA+ligase+in+the+replication+of+viroids+belonging+to+the+family+Avsunviroidae.">Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggplant+latent+viroid:+a+friendly+experimental+system+in+the+family+Avsunviroidae.">Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).</li><li>Cordero, T., Ortol&#224;, B., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+Eggplant+Latent+Viroid+RNA+Circularization+by+the+Eggplant+tRNA+Ligase+in+Escherichia+coli.">Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li><li>Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-dimensional+electrophoretic+technique+for+the+detection+of+circular+viroids+and+virusoids.">A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids.</a> Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).</li><li>Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+electrophoretic+properties+of+solubilizable+disulfide+gels.">Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels.</a> Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).</li><li>Gigu&#232;re, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+structures+of+all+members+of+the+Avsunviroidae+family.">Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family.</a> Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).</li><li>L&#243;pez-Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+initiation+sites+of+eggplant+latent+viroid+strands+map+within+distinct+motifs+in+their+in+vivo+RNA+conformations.">The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations.</a> RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).</li></ol>

Hoewel het onderzoek naar de ELVd volgorde en structuur eisen die betrokken zijn bij de erkenning door de aubergine tRNA ligase, merkten we dat mede expressie van beide moleculen in de niet-host E. coli leidde tot een onverwachte grote opeenstapeling van Viroïde circulaire formulieren in bacteriecellen19. We begrepen dat de grote opeenstapeling van Viroïde RNA in E. coli waarschijnlijk het gevolg was van mede uiting van een zeer stabiele RNA-molecuul, zoals de relatief kleine (...

In tegenstelling tot DNA en proteïnen zijn protocollen voor eenvoudige, efficiënte en rendabele productie van grote hoeveelheden van RNA niet overvloedig. Echter, onderzoek en industrie vraag steeds grotere hoeveelheden van deze biomoleculen te onderzoeken hun unieke biologische eigenschappen1, of om te worden gebruikt geavanceerde biotechnologische toepassingen, waaronder hun gebruik als zeer specifieke aptamers 2, therapeutische agenten3of selectieve pesticiden4. In vitro transcriptie en chemische synthese worden vaak gebruikt in onderzoek voor de productie van RNA. Deze methoden leiden echter tot belangrijke beperkingen wanneer grote hoeveelheden van de producten nodig zijn. De logische alternatief is het gebruik van de machines van de endogene transcriptie van levende cellen, gevolgd door een zuiveringsproces te scheiden van de RNAs van belang van de cellulaire metgezellen. Naar aanleiding van deze strategie, zijn methoden ontwikkeld voor de productie van recombinante RNAs in bacteriële cellen, zoals de lab-vriendelijke Escherichia coli5 of de marine paarse fototrofe alpha-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. de meeste methoden voor de productie van recombinante RNA bij bacteriën is afhankelijk van de expressie van een inheemse zeer stabiele RNA steiger, zoals een tRNA of een rRNA, waarin RNA van belang is ingevoegd7. Dit legt de noodzaak van het vrijgeven van het RNA van belang uit het chimeer molecuul, als de aanwezigheid van extra RNA een probleem voor de downstream toepassingen8 is. Een ander concept in recombinant RNA biotechnologie is de productie van recombinante ribonucleoprotein complexen die mogelijk het gewenste product per se of gebruikt als een beschermende strategie om te verhogen de stabiliteit van het RNA van belang9, 10. Ook is de productie van circulaire RNAs ook voorgesteld als een strategie voor het genereren van meer stabiele producten11.
We hebben onlangs een nieuwe methode voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNA in E. coli die deelneemt aan drie van de bovenstaande concepten ontwikkeld: de invoeging van het RNA van belang in een zeer stabiele cirkelvormige RNA steiger en de co uitdrukking van de recombinante RNA met een interactie eiwit waarschijnlijk tot een stabiele ribonucleoprotein complex dat zich in opmerkelijke bedragen in bacteriële ophoopt cellen12. In tegenstelling tot eerdere ontwikkelingen gebruikten we een volkomen vreemd is aan E. coli, namelijk een Viroïde RNA-steiger. Viroïden zijn een bijzonder soort infectieuze agentia van hogere planten die zijn uitsluitend gevormd door een relatief klein (246-401 nt) zeer base-gepaarde circulaire RNA13. Interessant, viroïden zijn niet-coderende RNAs en met geen hulp van hun eigen eiwitten, ze zijn in staat om het volledige complex besmettelijke cycli in de geïnfecteerde hosts14. Deze cycli opnemen de replicatie van RNA-RNA-in de kernen of chloroplasten, afhankelijk van de familie Viroïde —Pospiviroidae of Avsunviroidae, respectievelijk — verkeer via de besmette plant en -ontduiking van de defensieve reactie van de gastheer. Viroïden moeten worden gerangschikt onder de meest stabiele RNAs in de natuur, als gevolg van een naakte circulaire RNA en om te overleven in de vijandige omgeving van plantencellen besmet. Deze eigenschap kan maken viroïden bijzonder geschikt als steigers te stabiliseren recombinant RNA in biotechnologische benaderingen. Bovendien is de nieuwe methode gebaseerd op co uitdrukking van de Viroïde steiger met een interactie plantaardige eiwitten. Viroïden gerepliceerd via een mechanisme van de rolling-circle in welke host enzymen zijn gerekruteerd om te katalyseren van de verschillende stappen van het proces. Met name sommige viroïden, meer in het bijzonder degenen die tot de familie Avsunviroidae15 behoren, bevatten ribozymes die ook bij de replicatie zijn betrokken. Afhankelijk van de soort Viroïde, is transcriptie van Viroïde RNAs gemedieerd door de host RNA polymerase II of de chloroplastic nucleaire-gecodeerd RNA polymerase (NEP). Viroïde RNA verwerking lijkt te worden gekatalyseerd door een host type III RNase, hoewel in viroïden met ribozymes oligomere RNA tussenproducten zelf tijdens de replicatie klieven. Tot slot, de resulterende Viroïde monomeren zijn circularized, afhankelijk van de familie Viroïde door de host DNA ligase 1 of de chloroplastic isovorm van tRNA ligase16,17. Dit laatste enzym is betrokken bij Afbinding van de monomere vormen van de viroïden in de familie Avsunviroidae, zoals aubergine latente Viroïde (ELVd)18.
In de loop van een werk voor het analyseren van de volgorde en de structurele eisen van ELVd die bepalen van erkenning door de aubergine (Solanum melongena L.) tRNA ligase, wij stellen een experimenteel systeem gebaseerd op co expressie van beide moleculen in E. coli 19. Wij merkten dat langer-dan-unit ELVd afschriften zelf efficiënt in E. coli cellen via de ingesloten hammerhead ribozymes klieven en dat de resulterende Viroïde monomeren met 5'-hydroxyl en 2', 3'-phosphodiester termini efficiënt circularized door de mede uitgedrukt aubergine tRNA ligase. Sterker nog, bereikt de resulterende circulaire Viroïde RNA een onverwachte hoge concentraties in E. coli, dan die van de endogene rRNAs12. Afwezigheid van replicatie tussenproducten aangegeven gebrek ELVd RNA-RNA-amplificatie in deze bacteriële cellen. Interessant, had invoeging van heterologe RNAs in een bepaalde stand van het molecuul Viroïde een matig effect op de accumulatie van de circulaire Viroïde afkomstige RNAs12. Deze opmerkingen maakte ons voorzien van een methode om grote hoeveelheden recombinant RNAs in bacteriën produceren. Bij deze methode wordt de cDNAs overeenkomt met de RNAs van belang worden ingevoegd in de cDNA ELVd en de resulterende chimeer RNA wordt uitgedrukt in E. coli via een sterke constitutieve promotor. Voor het systeem te werken, moet de E. coli samen met een plasmide wil de aubergine tRNA ligase worden omgevormd. Het langer-dan-unit ELVd-afgeleide transcript is verwerkt door de ingesloten hammerhead ribozymes en de resulterende monomeren met de juiste termini zijn erkend en circularized door de mede uitgedrukt tRNA ligase. Op deze manier is de RNA van belang een zeer stabiele cirkelvormige steiger bestaande uit het Viroïde circulaire molecuul ingevoegd. Deze recombinante chimeer RNA is waarschijnlijk verder gestabiliseerd in de cellen van E. coli door vorming van een complexe door interactie met tRNA ligase ribonucleoprotein. Met behulp van deze methode (zie protocol hieronder), RNA aptamers, haarspeld RNAs en andere gestructureerde RNAs zijn gemakkelijk geproduceerd in hoeveelheden van tientallen milligram per liter voor E. coli cultuur in normale laboratoriumomstandigheden en gezuiverd tot homogeniteit nemen voordeel van cirkelvormigheid12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bpi I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010</td>
			<td>D1 low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131008.1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>Ba2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>48045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>X1402.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131785.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucloSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>22740588.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69387-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115(DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref. Timmons et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C 0113.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1211</td>
			<td>87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131509.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122333.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131020.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>FE04791000</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3691,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap DEAE Sepharose FF column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5055-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTAprime plus liquid chromatography system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>11001313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamyde</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1089,1000</td>
			<td>2K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>146392.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2940,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0937,2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Bis(acryloyl)cystamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4929-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli

Met de toenemende belangstelling voor RNA biologie en het gebruik van de molecules van RNA in geavanceerde biotechnologische toepassingen, zijn de methoden voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNAs beperkt. Hier beschrijven we een protocol voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNA in Escherichia coli gebaseerd op co expressie van een chimeer molecuul waarin het RNA van belang in een Viroïde steiger en een plant tRNA ligase. Viroïden zijn relatief kleine, niet-coderende, zeer base-gepaarde circulaire RNAs die besmettelijk tot hogere planten zijn. De host plant tRNA ligase is een enzym gerekruteerd door viroïden die tot de familie Avsunviroidae, zoals aubergine latente Viroïde (ELVd), behoren om te bemiddelen RNA circularization tijdens Viroïde replicatie. Hoewel ELVd niet gerepliceerd in E. coli, een voorloper van de ELVd is efficiënt getranscribeerd door de E. coli RNA polymerase en verwerkt door de ribozymes van de ingesloten hammerhead in bacteriële cellen, en de resulterende monomeren zijn circularized door de Co uitgedrukt tRNA ligase een opmerkelijke concentratie bereiken. Het inbrengen van een RNA van belang in de ELVd steiger kan de productie van tientallen milligram van de recombinant RNA per liter bacteriecultuur in normale laboratoriumomstandigheden. Een belangrijke fractie van het RNA-product is circulaire, een functie die de reiniging van de recombinante RNA naar virtuele homogeniteit vergemakkelijkt. In dit protocol, wordt een complementaire DNA (cDNA) dat overeenkomt met het RNA van belang ingevoegd in een bepaalde stand van de ELVd cDNA in een plasmide expressie die wordt gebruikt, langs de plasmide uitspreken aubergine tRNA ligase, mede om te transformeren van E. coli. Co expressie van beide moleculen onder de controle van sterke constitutieve initiatiefnemers leidt tot de productie van grote hoeveelheden van de recombinante RNA. De recombinante RNA kan worden geëxtraheerd uit de bacteriële cellen en gescheiden van het merendeel van de bacteriële RNAs profiteren van haar cirkelvormigheid.

Het RNA van belang is voor de productie van recombinant RNA in E. coli met behulp van de ELVd-afgeleide systeem12, een steiger ELVd RNA geënt. Deze chimeer RNA is mede uitgedrukt langs de aubergine tRNA ligase in E. coli. Zodra verwerkt, gekloofd en circularized, vormt het chimeer circulaire RNA, waaruit de RNA van belang steekt, waarschijnlijk een complex met de mede uitgedrukt aubergine enzym dat opmerkelijke concentratie in de bacteriële cell...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

De grootschalige productie van recombinante RNAs op een circulaire steiger met behulp van een systeem van Viroïde afkomstige in Escherichia coli

Hier presenteren we een protocol voor de productie van grote hoeveelheden van recombinante RNA in Escherichia coli mede uitspreken een chimeer RNA waarin het RNA van belang in een Viroïde steiger en een plant tRNA ligase. Het hoofdproduct is een circulaire molecuul dat zuivering aan homogeniteit wordt vergemakkelijkt.

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Deze methode kan helpen om grote hoeveelheden recombinant RNAs van belang voor toepassing in onderzoek of industrie te produceren. Het belangrijkste voordeel is dat recombinant RNA wordt geproduceerd in Escherichia coli in een goedkoop proces dat gemakkelijk kan worden opgeschaald. Belangrijk is dat het RNA wordt geproduceerd op een cirkelvormige RNA steiger, die de zuivering naar homogeniteit vergemakkelijkt.In tegenstelling tot DNA of eiwitten worden RNAs van belang niet gemakkelijk in grote hoeveelheden geproduceerd in biofabrieken, zoals een Escherichia coli-cultuur. Onze methode is gebaseerd op co-expressie van het RNA van belang ingevoegd in een zeer stabiele cirkelvormige steiger en het toepassen van een ligase die RNA circularisatie bemiddelt. Het ronde RNA steiger is afgeleid van een gepatenteerde viroid.Viroids zijn relatief kleine, niet-coiling, zeer base-paired circulaire RNAs die besmettelijk zijn voor sommige hogere planten. We kunnen tientallen milligram van het recombinant RNA per liter bacteriële cultuur produceren in reguliere laboratoriumomstandigheden. Om deze procedure te starten, versterkt u de cDNA per PCR zoals beschreven in het tekstprotocol.Voeg vervolgens 100 nanogram van de plasmide pLELVd-BZB toe aan een buis van 0,5 milliliter. Voeg 10 U van het type IIS beperking enzym BpiI en genoeg van buffer G om een 20 microliter reactie te creëren. Incubeer op 37 graden Celsius gedurende een uur om de plasmide te verteren.Daarna, scheiden de PCR en spijsvertering producten door elektroforese in een een procent agarose gel in TAE buffer. Vlek de gel door het te schudden in 200 milliliter ethidium bromide bij een concentratie van 0,5 microgram per milliliter. Visualiseer het DNA met behulp van een UV-transilluminator.Gebruik een scalpel om de banden uit te snijden die overeenkomen met de versterkte cDNA en de BpiI verteerde plasmid. Met behulp van silica gel kolommen, elute de DNAs van de gel fragmenten. Kwantificeer de concentratie van het DNA door spectrofotometrische analyse.Het opzetten van een Gibson Assembly reactie met behulp van de versterkte cDNA en de verteerde plasmid. Broed een uur lang op 50 graden Celsius. Gebruik vervolgens een silicagelkolom om de reactie te zuiveren.Na elektroporating bevoegde E.coli DH5-Alpha Cellen, kies verschillende witte kolonies en breng ze naar vloeibaar LB medium. Laat de kolonies 's nachts groeien bij 37 graden Celsius. Gebruik vervolgens een miniprep kit om de plasmiden te zuiveren, en analyseren hun maten door elektroforese in een een procent agarose gel in TAE buffer.Ten eerste co-electro-electroporate de geselecteerde E.coli stam met zowel de pLELVd-BZB derivaat die de cDNA die overeenkomt met het RNA van belang en de plasmid P15LTRNISM co-express de aubergine tRNA ligase. Breng SOC vloeibaar medium in de elektroporatie cuvette om de cellen te herstellen, en incubeer op 37 graden Celsius gedurende een uur. Dan, plaat de bacteriën op LB vaste medium met 50 microgram per milliliter ampicilline, en 34 microgram per milliliter chlooramphenicol.Incubeer op 37 graden Celsius 's nachts. De volgende dag, voeg 250 milliliter van vloeibare TB medium, met 50 microgram per milliliter ampicilline, en 34 microgram per milliliter chlooramphenicol, aan een een liter verbijsterd Erlenmeyer fles. Haal de geïncubeerde E.Coli, en kies dan een kolonie en inent het medium in de kolf.Incubeer bij 37 graden Celsius met krachtig schudden bij 180 RPM gedurende 12 tot 16 uur voor het oogsten van de bacteriën. Giet de geoogste E.Coli cultuur in een 250 milliliter centrifuge fles en spin de cellen op 14,000 G gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en verleg de cellen in 30 milliliter water.Breng deze suspensie over naar een centrifugebuis en draai de cellen opnieuw naar beneden met behulp van de vorige voorwaarden. Gooi de supernatant en voeg 10 milliliter chromatografie buffer aan de cel pellet. Vortex om de cellen in de buffer opnieuw op te plaatsen.Voeg een volume fenol: chloroform en vortex krachtig om de cellen te breken. Dan, centrifuge op 12,000 G gedurende 10 minuten. Herstel de waterige fase, voeg een volume chloroform, en vortex krachtig.Centrifuge op 12.000 G gedurende 10 minuten. Filtreer hierna het RNA-preparaat door een spuitfilter van 45 micrometer. Zuiveren van de RNA met behulp van een een milliliter diethyl ethanol amine kolom aangesloten op een vloeibare chromatografie systeem.Pas de stroomsnelheid aan op één milliliter per minuut en vereenig de kolom met 10 milliliter chromatografiebuffer. Laad vervolgens het monster en was de kolom met 10 milliliter chromatografiebuffer. Elute het RNA met 20 milliliter elutie buffer, en verzamel een milliliter aliquots.Met behulp van tweedimensionale polyacrylamide gel elektroforese, scheiden de cirkelvormige RNAs van hun lineaire tegenhangers. Bereid eerst een vijf procent polyacrylamidegel in TBE-buffer en met acht molaire ureum zoals beschreven in het tekstprotocol. Meng 20 microliter van de RNA-preparaten met één volume laadbuffer.Broed op 95 graden Celsius in een verwarmingsblok gedurende 1,5 minuten, en dan snap-cool op ijs. Laad de monsters in de polyacrylamidegel en voer de elektroforese uit onder de juiste omstandigheden voor de gelafmeting. Vlek hierna gedurende 15 minuten de gel in 0,5 microgram per milliliter ethidium bromide.Was de gekleurde gel met water en visualiseer het RNA onder UV-licht. Elektroforetische analyse van verschillende recombinant plasmiden waarin verschillende cDNAs worden ingevoegd vertonen verschillende migraties in vergelijking met pLELVd-BZB. Merk op dat pLELVd-BZB de lacZ marker bevat, die wordt vervangen door de cDNA die overeenkomt met het RNA van belang, dus terwijl de migratie afhankelijk is van de grootte van de ingevoegde cDNA, zullen de recombinant plasmiden meestal sneller migreren dan de controlplasmid.De productie van het recombinant RNA in co-geëlektreerde bacteriële culturen wordt gecontroleerd door het breken van de cellen en het analyseren van het RNA door het denatureren van PAGINA. De sterke banden kunnen worden gezien, die aan lege ELVd en chimeric ELVd vormen beantwoorden, waarin de verschillende RNAs van belang werden opgenomen. Interessant is dat een groot deel van het recombinant RNA wordt gezien als een cirkelvormige vorm.De circulariteit van de belangrijkste fractie wordt waargenomen door een combinatie van twee PAGE's te gebruiken onder denatureringsomstandigheden bij hoge en lage ionische sterkte. De RNA-voorbereiding kan verder worden gezuiverd door anionuitwisselingschromatografie. Zoals hier te zien, is de E.Coli RNA efficiënt behouden op een lage ionische sterkte, en vervolgens eluted op hoge ionische sterkte, met het grootste deel van het RNA wordt verzameld in fracties twee en drie.Recombinant RNA kan verder worden gezuiverd tot homogeniteit door 2-D elektroforese. Dit protocol maakt het mogelijk om grote hoeveelheden recombinant RNA in Escherichia coli en zuivering tot homogeniteit te produceren dankzij de circulariteit van het eindproduct. Vergeet niet dat de RNA van belang resultaten ingebed in een cirkel RNA steiger afgeleid van een plant viroid.Als u beide moieties wilt scheiden, moet u een standaardstrategie gebruiken, zoals ribozymes, DNAzymes of RNase H.De opbrengst van dit protocol is afhankelijk van het specifieke RNA van belang, omdat kleine RNA's waarschijnlijk in hogere hoeveelheden worden geproduceerd dan grotere. Voor grootschaligere uitdrukkingen, rekening mee houden dat een optimale tijd om bacteriën te oogsten afhankelijk is van vele factoren, waaronder de E.Coli stam, cultuur medium, en groeiomstandigheden. Wij raden u aan een voorlopige cursustest aan om het optimale productievenster in uw specifieke omstandigheden te vinden.Vergeet niet dat de recombinant RNAs zich van voorbijgaande aard ophopen in bacteriële cellen, en dat ze volledig verdwijnen in de late groeifase.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Geregisseerd Protein Packaging binnen Outer membraanvesicles uit<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Ontwerp, Productie en zuivering

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; en<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kwantificering van de overvloed en het opladen van de niveaus van overdracht RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Gebruik van Alu Element met minigenen om circulaire RNA's te analyseren

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Reinigingsmiddel-bijgestaan reconstitutie van recombinant fruit vliegje Atlastin in liposomen voor lipide-mengt analyses

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site specifieke Lysine acetylatie van histonen voor nucleosoom reconstitutie met behulp van genetische code uitbreiding in Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...