Name: large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים BIO2017-83184-R ו- BIO2017-91865-EXP מ ספרדי Ministerio דה Ciencia, Innovación y Universidades (שותפה במימון קרנות פדר).

1. פלסמיד בנייה
<ol><li>
להגביר את ה-PCR (או על ידי שעתוק במהופך PCR אם החל תבנית הרנ א) cDNA התואם הרנ א עניין באמצעות תחל עם סיומת 5' כדי לאפשר הרכבה לתוך פלסמיד הביטוי. כדי למנוע מוטציות בלתי רצויה, להשתמש אמינות גבוהה DNA פולימראז.
	<ol>
<li>כדי להוסיף את cDNA פלסמיד ביטוי גיבסון הרכבה20</...

<ol>
	<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Research+on+Non-Coding+Ribonucleic+Acid+(RNA).">Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA).</a> Genes. 8 (12), (2017).</li><li>Hamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+approaches+to+RNA+aptamer+design.">In silico approaches to RNA aptamer design.</a> Biochimie. 145, 8-14 (2018).</li><li>Bobbin, M. L., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)-Based+Therapeutics:+Delivering+on+the+Promise?.">RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).</li><li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+for+Mosquito+and+Mosquito-Borne+Disease+Control.">RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control.</a> Insects. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expression+and+purification+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Methods. 54 (2), 267-273 (2011).</li><li>Kikuchi, Y., Umekage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nucleic+acids+of+the+marine+bacterium+Rhodovulum+sulfidophilum+and+recombinant+RNA+production+technology+using+bacteria.">Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+RNA+technology:+the+tRNA+scaffold.">Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold.</a> Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).</li><li>Batey, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+methods+for+native+expression+and+purification+of+RNA+for+structural+studies.">Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).</li><li>El Khouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+RNA-Protein+Complexes+in+Escherichia+coli.">Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli.</a> Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).</li><li>Ponchon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+RNA-protein+complexes+in+Escherichia+coli+and+applications+to+RNA+biology.">Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology.</a> Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).</li><li>Umekage, S., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+production+and+purification+of+circular+RNA+aptamer.">In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer.</a> Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).</li><li>Dar&#242;s, J. -. A., Aragon&#233;s, V., Cordero, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viroid-derived+system+to+produce+large+amounts+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids:+small+noncoding+infectious+RNAs+with+the+remakable+ability+of+autonomous+replication.">Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication.</a> Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).</li><li>Flores, R., Hern&#225;ndez, C., Mart&#237;nez de Alba, A. E., Dar&#242;s, J. A., Di Serio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+and+viroid-host+interactions.">Viroids and viroid-host interactions.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).</li><li>Di Serio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICTV+Virus+Taxonomy+Profile:+Avsunviroidae.">ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae.</a> The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).</li><li>Nohales, M. A., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroid+RNA+redirects+host+DNA+ligase+1+to+act+as+an+RNA+ligase.">Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).</li><li>Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+chloroplastic+isoform+of+tRNA+ligase+in+the+replication+of+viroids+belonging+to+the+family+Avsunviroidae.">Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggplant+latent+viroid:+a+friendly+experimental+system+in+the+family+Avsunviroidae.">Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).</li><li>Cordero, T., Ortol&#224;, B., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+Eggplant+Latent+Viroid+RNA+Circularization+by+the+Eggplant+tRNA+Ligase+in+Escherichia+coli.">Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li><li>Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-dimensional+electrophoretic+technique+for+the+detection+of+circular+viroids+and+virusoids.">A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids.</a> Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).</li><li>Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+electrophoretic+properties+of+solubilizable+disulfide+gels.">Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels.</a> Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).</li><li>Gigu&#232;re, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+structures+of+all+members+of+the+Avsunviroidae+family.">Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family.</a> Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).</li><li>L&#243;pez-Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+initiation+sites+of+eggplant+latent+viroid+strands+map+within+distinct+motifs+in+their+in+vivo+RNA+conformations.">The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations.</a> RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).</li></ol>

כשחיפשתי את רצף ELVd ודרישות מבנה מעורב ההכרה על ידי ליגאז tRNA חציל, שמנו לב את הביטוי שיתוף של שתי מולקולות ב-פונדקאי e. coli הוביל הצטברות גדולה לא צפויה של וירואיד מעגלית טפסים תאים חיידקיים19. הבנו כי הצטברות גדולה של וירואיד RNA ב e. coli ככל הנראה היה התוצאה של שיתוף לבטא מו...

בניגוד DNA, חלבונים, פרוטוקולים לייצור קל, יעיל וחסכוני של כמויות גדולות של RNA אינם בשפע. עם זאת, המחקר והתעשייה דרישה להגדיל כמויות של מולקולות אלה כדי לחקור תכונות ביולוגיות ייחודיות שלהם1, או להיות מועסק ב מתוחכמים ביוטכנולוגי יישומים, כולל שימוש ספציפי מאוד aptamers 2, סוכני טיפולית3או הדברה סלקטיבי4. תמלול במבחנה, סינתזה משמשים במחקר לייצר RNA. עם זאת, שיטות אלה כרוכה מגבלות חשובות כאשר כמויות גדולות של המוצרים נדרשים. החלופה ההגיונית היא להשתמש את מכונות שעתוק אנדוגני של תאים חיים, ואחריו תהליך טיהור להפריד את RNAs עניין חבריו הסלולר. בעקבות אסטרטגיה זו, פותחו שיטות כדי לייצר RNAs רקומביננטי בתאי חיידקים, כגון המעבדה-הידידותית Escherichia coli5 או את ימית סגול phototrophic האלפא-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. לרוב השיטות לייצור RNA רקומביננטי בחיידקים להסתמך על הביטוי של לפיגום RNA יליד יציב מאוד, כגון להוסיף tRNA או של rRNA, בהן הרנ א עניין הוא7. זה מטיל את ההכרח משחרר את הרנ א עניין מחוץ מולקולת chimeric, אם הנוכחות של RNA נוספת היא בעיה עבור יישומי הזרם8. המושג ב רקומביננטי ביוטכנולוגיה RNA הוא הייצור של מכלולים ribonucleoprotein רקומביננטי ייתכן המוצר הרצוי כשלעצמו או השתמשו כאסטרטגיה מגן כדי להגביר את היציבות RNA של ריבית9, 10. באופן דומה, הייצור של RNAs מעגלית גם הוצע כאסטרטגיה לייצר מוצרים יציב יותר11.
לאחרונה פיתחנו שיטה חדשה להפקת כמויות גדולות של רנ א רקומביננטי ב e. coli המשתתפת בשלוש מתוך המושגים לעיל: החדרת את הרנ א ביקוש לפיגום RNA מעגלי יציב מאוד וביטוי שיתוף רקומביננטי RNA עם חלבונים אינטראקציה לייצר סביר של ribonucleoprotein יציב מורכבים שמצטבר בכמויות מדהים בבקטריאלי תאים12. בניגוד התפתחויות הקודם, השתמשנו זר לחלוטין כדי e. coli, כלומר וירואיד של RNA לגרדום. Viroids הם סוג מאוד מסוים של מדבקים של צמחים גבוהים יותר באופן בלעדי היוו מאת קטן יחסית (246-401 nt) מאוד בסיס לזווג מעגלית רנ א13. מעניין, viroids הם ללא קידוד RNAs, בלי עזרה של חלבונים משלהם, הם מסוגלים להשלים את מורכבות מחזורים זיהומיות ב לנשאים נגועים14. מחזורים אלה כוללות שכפול רנ א-ל-RNA גרעינים או מהכלורופלסט, בהתאם משפחת וירואיד —Pospiviroidae או Avsunviroidae, בהתאמה – תנועה דרך צמחים נגועים התחמקות של התגובה ההגנתית המארח. Viroids חייב להיות מדורגת בין RNAs היציב ביותר בטבע, כתוצאה להיות ה-RNA מעגלי עירומים ויש להם לשרוד בסביבה עוינת של תאי צמחים נגועים. מאפיין זה עלול להפוך viroids מתאים במיוחד כמו פיגומים לייצב רקומביננטי RNA בגישות הביו-טכנולוגיה. בנוסף, השיטה החדשה מבוססת על שיתוף לביטוי לגרדום וירואיד עם חלבון אינטראקציה הצמח. Viroids שכפל באמצעות מנגנון מתגלגל-מעגל בפונדקאי אשר מגויסים אנזימים כדי לעודד את השלבים השונים של התהליך. בייחוד את viroids קצת, ליתר דיוק אלה השייכים המשפחה Avsunviroidae15, מכילים ribozymes המעורבים גם שכפול. תלוי בזן וירואיד, שעתוק של וירואיד RNAs מתווך על-ידי המחשב המארח RNA פולימראז II או את chloroplastic הגרעיני מקודד ה-RNA פולימראז (NEP). וירואיד RNA עיבוד נראה להיות מזורז על-ידי מחשב מארח RNase סוג-III, למרות ב viroids עם ribozymes oligomeric RNA intermediates עצמית קליב במהלך שכפול. בסופו של דבר, שנוצר מונומרים וירואיד הם circularized, בהתאם משפחת וירואיד, את מארח ה-DNA ליגאז 1 או איזופורם chloroplastic tRNA ליגאז16,17. אנזים זה האחרון מעורב מצדו של צורות monomeric של viroids משפחת Avsunviroidae, כגון וירואיד החבויים חצילים (ELVd)18.
במהלך עבודה כדי לנתח את הדרישות רצף מבניים של ELVd הקובעים הכרה על ידי החציל (סולנום melongena ל') ליגאז tRNA, הקמנו מערכת ניסיוני המבוסס על ביטוי משותף של שתי מולקולות ב e. coli 19. הבחנו כי עוד יותר-יחידות ELVd תעתיקים עצמית קליב ביעילות בתאים e. coli עד ribozymes האמרהאד מוטבע וכי וירואיד שנוצר מונומרים עם 5'-הידרוקסיל, 2', טרמיני 3'-phosphodiester circularized ביעילות על ידי ליגאז tRNA ביטוי במשותף חציל. אפילו יותר, RNA מעגלי וירואיד וכתוצאה מכך להגיע של ריכוז גבוה לא צפוי ב e. coli, מעבר. rRNAs אנדוגני12. היעדר שכפול intermediates הצביעו על חוסר ELVd רנ א-ל-RNA הגברה תאים חיידקיים אלה. מעניין, החדרת heterologous RNAs במצב מסוים של המולקולה וירואיד הייתה השפעה מתונה על הצטברות של מעגלי נגזר וירואיד RNAs12. תצפיות אלה גרמו לנו לדמיין שיטה לייצר כמויות גדולות של רקומביננטי RNAs בחיידקים. בשיטה זו, cDNAs התואמים RNAs עניין הנוספים של cDNA ELVd, הרנ א chimeric וכתוצאה מכך זה מתבטא ב e. coli דרך מקדם מכוננת חזקה. עבור מערכת לעבודה, e. coli ולשוד במשותף עם פלסמיד לבטא את ליגאז tRNA חציל. בתמליל עוד יותר-יחידות הנגזרות ELVd יעובד על-ידי ribozymes האמרהאד מוטבע, שנוצר מונומרים עם טרמיני המתאים מזוהה, circularized על ידי ליגאז tRNA ביטוי במשותף. בדרך זו, הרנ א עניין מוכנס לתוך לפיגום מעגלית יציב מאוד המורכב של המולקולה המעגלית וירואיד. רנ א רקומביננטי זה chimeric היא ככל הנראה עוד התייצב בתוך התאים e. coli על ידי היווצרות ribonucleoprotein מורכבים תוך אינטראקציה עם ליגאז tRNA. בשיטה זו (ראה פרוטוקול להלן), RNA aptamers, סיכת ראש RNAs RNAs מובנים אחרים יש כבר בקלות מיוצר בכמויות של עשרות מיליגרם לליטר של e. coli תרבות בתנאי מעבדה רגיל וטיהרו את ההומוגניות לוקח היתרון של מעגליות12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bpi I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010</td>
			<td>D1 low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131008.1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>Ba2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>48045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>X1402.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131785.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucloSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>22740588.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69387-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115(DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref. Timmons et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C 0113.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1211</td>
			<td>87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131509.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122333.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131020.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>FE04791000</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3691,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap DEAE Sepharose FF column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5055-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTAprime plus liquid chromatography system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>11001313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamyde</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1089,1000</td>
			<td>2K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>146392.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2940,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0937,2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Bis(acryloyl)cystamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4929-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli

עם הגדלת ההתעניינות RNA ביולוגיה והשימוש של מולקולות RNA ביישומים הביו-טכנולוגיה מתוחכמת, השיטות להפקת כמויות גדולות של RNAs רקומביננטי מוגבלים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לייצר כמויות גדולות של רנ א רקומביננטי ב- Escherichia coli בהתבסס על ביטוי משותף של מולקולה chimeric המכיל את הרנ א ביקוש לפיגום וירואיד ומפעל ליגאז tRNA. Viroids הם RNAs עגול קטן יחסית, ללא קידוד, מאוד בסיס לזווג שאינן זיהומיות צמחים גבוהים יותר. המארח לשתול tRNA ליגאז הוא אנזים גויס על ידי viroids שייך למשפחת Avsunviroidae, כגון וירואיד החבויים חצילים (ELVd), לתווך RNA circularization במהלך וירואיד שכפול. למרות ELVd לא לשכפל ב e. coliקודמן ELVd ביעילות עיבד על ידי e. coli RNA פולימראז, עיבדה את ribozymes האמרהאד מוטבעים תאים חיידקיים, שנוצר מונומרים הם circularized על ידי ליגאז tRNA ביטוי במשותף להגיע ריכוז יוצא דופן. החדרת RNA עניין לתוך לגרדום ELVd מאפשר הייצור של עשרות מיליגרם רקומביננטי RNA לליטר של התרבות חיידקי בתנאי מעבדה רגיל. שבר העיקרי של המוצר RNA היא מעגלית, תכונה המאפשרת הטיהור של הרנ א רקומביננטי כדי הומוגניות וירטואלי. ב פרוטוקול זה, תואמת DNA (cDNA) משלימים ל RNA עניין נוסף במצב מסוים של cDNA ELVd ב פלסמיד ביטוי המשמש, לאורך פלסמיד לבטא משותפת ליגאז tRNA חציל, להפוך את החיידק. ביטוי משותף של שתי מולקולות תחת השליטה של היזמים מכוננת חזק מוביל לייצור כמויות גדולות של הרנ א רקומביננטי. הרנ א רקומביננטי יכול להיות שחולצו מן התאים חיידקי, הופרדו עיקר RNAs חיידקים ניצול של מעגליות שלה.

כדי לייצר רקומביננטי RNA ב e. coli באמצעות מערכת ELVd-derived12, הרנ א עניין הוא הושתל לתוך לגרדום ELVd RNA. רנ א chimeric זו היא ביטוי במשותף לאורך ליגאז tRNA החציל ב- e. coli. לאחר עיבוד, ביקע, circularized, RNA מעגלי chimeric, שממנו הרנ א עניין בולט, סביר להניח צורות מורכבות עם האנזים חצ...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

ייצור בקנה מידה גדול של RNAs רקומביננטי על גרדום מעגלית באמצעות מערכת נגזר וירואיד ב- Escherichia coli

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי לייצר כמויות גדולות של רנ א רקומביננטי ב- Escherichia coli בהבעת משותפת של RNA chimeric המכיל את הרנ א ביקוש לפיגום וירואיד ומפעל ליגאז tRNA. המוצר העיקרי הוא מולקולה מעגלית המקל על טיהור עד הומוגניות.

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

שיטה זו יכולה לעזור לייצר כמויות גדולות של RNAs רקומביננטי של עניין עבור יישום במחקר או בתעשייה. היתרון העיקרי הוא כי RNA רקומביננטי מיוצר Escherichia coli בתהליך זול שניתן לשנות בקלות. חשוב לציין, RNA מיוצר על פיגום RNA עגול, אשר מאפשר טיהור הומוגניות.בניגוד לדנ"א או חלבונים, RNAs של עניין אינם מיוצרים בקלות בכמויות גדולות במערכות biofactory, כגון תרבות קולי Escherichia. השיטה שלנו מבוססת על ביטוי משותף של RNA של עניין מוכנס לתוך פיגום מעגלי יציב מאוד החלת ליגזה המתווה RNA חזור. פיגום ה-RNA המעגלי נובע מווירואיד המוגן בפטנט.Viroids הם קטנים יחסית, לא סליל, RNAs מעגלי מאוד בסיס זיווג כי הם זיהומיות כמה צמחים גבוהים יותר. אנחנו יכולים לייצר עשרות מיליגרם של RNA רקומביננטי לליטר של תרבות חיידקית בתנאי מעבדה רגילים. כדי להתחיל בהליך זה, הגבר את ה- cDNA על-ידי PCR כמפורט בפרוטוקול הטקסט.לאחר מכן, להוסיף 100 ננוגרם של pLELVd-BZB פלסמיד לצינור 0.5 מיליליטר. הוסף 10 U מסוג IIS הגבלת אנזים BpiI ומספיק חיץ G כדי ליצור תגובה 20 microliter. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי לעכל את הפלסמיד.לאחר מכן, להפריד את PCR ומוצרי עיכול על ידי אלקטרופורזה ב 1 אחוז ג'ל אגרוז במאגר TAE. הכתם את הג'ל על ידי טלטולו ב 200 מיליליטר אתידיום ברומיד בריכוז של 0.5 מיקרוגרם למיליליטר. באמצעות טרנסילומינטור UV, לדמיין את ה-DNA.השתמש באזמל כדי לחתוך את הרצועות המתאימות cDNA מוגברת ואת פלסמיד מתעכל BpiI. באמצעות עמודי ג'ל סיליקה, יש לחמק מ- DNAs מרסיסי הג'ל. לכמת את ריכוז הדנ"א על ידי ניתוח ספקטרופוטומטרי.הגדר תגובת הרכבה גיבסון באמצעות cDNA מוגברת ואת פלסמיד מתעכל. דגירה ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, השתמש בעמודת ג'ל סיליקה כדי לטהר את התגובה.לאחר electroporating מוסמך E.coli DH5-אלפא תאים, לבחור כמה מושבות לבנות ולהעביר אותם למדיום נוזלי LB. לגדל את המושבות לילה ב37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש בערכת miniprep כדי לטהר את הפלסמידים, ולנתח את גודלם על ידי אלקטרופורזה בג'ל אגרוז באחוז אחד במאגר TAE.ראשית, משותף electroporate זן E.coli שנבחר עם נגזרת pLELVd-BZB המכיל את cDNA המתאים RNA של עניין ואת P15LTRNISM פלסמיד לבטא במשותף את ליגאז tRNA חצילים. מעבירים מדיום נוזלי SOC לתוך cuvette אלקטרופורציה כדי לשחזר את התאים, ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן, צלחת החיידקים על מדיום מוצק LB המכיל 50 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין, ו 34 מיקרוגרם לכלוראמפניקול מיליליטר.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, להוסיף 250 מיליליטר של מדיום TB נוזלי, המכיל 50 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין, ו 34 מיקרוגרם לכלוראמפניקול מיליליטר, לבקבוק ארלנמאייר מבולבל ליטר אחד. אחזר את הדגירה E.Coli, ולאחר מכן לבחור מושבה לחסן את המדיום בבקבוקון.דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות נמרצות ב 180 סל"ד במשך 12 עד 16 שעות לפני קצירת החיידקים. יוצקים את תרבות E.Coli שנקטפה לתוך בקבוק צנטריפוגה 250 מיליליטר ולסובב את התאים ב 14, 000 G במשך 10 דקות. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את התאים ב-30 מיליליטר מים.העבר השעיה זו לצינור צנטריפוגה, ולסובב את התאים שוב באמצעות התנאים הקודמים. השלך את העל-טבעי והוסף 10 מיליליטר של מאגר כרומטוגרפיה לכדור התא. מערבולת כדי להשתמש מחדש בתאים במאגר.הוסף נפח אחד של פנול:כלורופורם ומערבולת במרץ כדי לשבור את התאים. ואז, צנטריפוגה ב 12, 000 G במשך 10 דקות. לשחזר את השלב הממיקי, להוסיף נפח אחד של כלורופורם, ומערבולת במרץ.צנטריפוגה ב 12, 000 G במשך 10 דקות. לאחר מכן, לסנן את הכנת RNA באמצעות מסנן מזרק מיקרומטר 45. לטהר את ה-RNA באמצעות עמודת אמין דיתיל אתנול מיליליטר אחד מחובר למערכת כרומטוגרפיה נוזלית.התאם את קצב הזרימה למיליליטר אחד לדקה, וצייד את העמודה ב- 10 מיליליטר של מאגר כרומטוגרפיה. לאחר מכן, לטעון את המדגם ולשטוף את העמודה עם 10 מיליליטר של מאגר כרומטוגרפיה. אלוט RNA עם 20 מיליליטר של חיץ אלוטיון, ולאסוף aliquots מיליליטר אחד.באמצעות אלקטרופורזה דו מימדית של ג'ל פוליאקרילמיד, הפרד את ה- RNAs המעגליים מעמיתיהם הליניאריים. ראשית, להכין חמישה אחוזים פוליאקרילמיד ג'ל במאגר TBE ומכיל שמונה אוריאה טוחנת כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מערבבים 20 מיקרוליטרים של תכשירי ה-RNA עם נפח אחד של מאגר טעינה.דגירה ב 95 מעלות צלזיוס בבלוק חימום במשך 1.5 דקות, ולאחר מכן הצמד להתקרר על קרח. טוענים את הדגימות בג'ל פוליאקרילמיד ו מפעילים את האלקטרופורזה בתנאים המתאימים למימד הג'ל. לאחר מכן, להכתים את הג'ל ב 0.5 מיקרוגרם למיליליטר אתידיום ברומיד במשך 15 דקות.לשטוף את הג'ל המוכתם במים, ולאחר מכן לדמיין את RNA תחת אור UV. ניתוח אלקטרופורטי של מספר פלסמידים רקומביננטיים שבהם מוכנסים cDNAs שונים להראות הגירות שונות בהשוואה pLELVd-BZB. שים לב כי pLELVd-BZB מכיל את סמן lacZ, אשר מוחלף על ידי cDNA המתאים RNA של עניין, כך בעוד ההעברה תלויה בגודל של cDNA שנוספה, פלסמיד רקומביננטי בדרך כלל להעביר מהר יותר מאשר פלסמיד הבקרה.הייצור של RNA רקומביננטי בתרבויות חיידקים co-electroporated מנוטר על ידי שבירת התאים וניתוח RNA על ידי denaturing PAGE. ניתן לראות להקות חזקות, התואמות לצורות ELVD ריקות ו- ELVD כימריות, שבהן הוכנסו RNAs שונים של עניין. מעניין, חלק גדול של RNA רקומביננטי נתפס כצורה מעגלית.המעגליות של השבר העיקרי נצפתה באמצעות שילוב של שני PAGEs בתנאים denaturing בעוצמה יונית גבוהה ונמוכה. הכנת RNA ניתן לטהר עוד יותר על ידי כרומטוגרפיה חילופי אניון. כפי שניתן לראות כאן, E.Coli RNA נשמר ביעילות בעוצמה יונית נמוכה, ולאחר מכן eluted בעוצמה יונית גבוהה, עם רוב RNA נאסף בשברים 2 ו -3.RNA רקומביננטי ניתן לטהר עוד יותר הומופוביות על ידי אלקטרופורזה דו-מיתית. פרוטוקול זה מאפשר ייצור קל של כמויות גדולות של RNA רקומביננטי ב Escherichia coli וטיהור הומוגניות הודות המעגליות של המוצר הסופי. זכור כי RNA של תוצאות עניין מוטבע לתוך פיגום RNA עגול נגזר וירווידי צמח.אם ברצונך להפריד בין שני moieties, אתה צריך להשתמש באסטרטגיה סטנדרטית, כגון ריבוזים, DNAzymes, או RNase H.The התשואה של פרוטוקול זה תלוי RNA מסוים של עניין, כמו RNAs קטנים צפויים להיות מיוצרים בכמויות גבוהות יותר מאשר גדולים יותר. לביטויים בקנה מידה גדול יותר, יש לקחת בחשבון כי הזמן האופטימלי לקצור חיידקים תלוי בגורמים רבים, כולל זן E.Coli, מדיום תרבות, ותנאי גידול. אנו ממליצים על בדיקה ראשונית של קורס זמן כדי למצוא את חלון הייצור האופטימלי בתנאים הספציפיים שלך.זכור כי RNAs רקומביננטי לצבור בתאי חיידקים באופן חולף, כי הם נעלמים לחלוטין בשלב מאוחר גדל.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

כימות של רמות של RNAs העברה ב- Escherichia coli השפע וטעינה

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

שימוש באלמנט Alu המכיל מיני-גנים לניתוח Rnas מעגלית

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

כביסה-החוקה בסיוע מחדש של רקומביננטי דרוזולה אטלסטין ליפוזומים בשביל השומנים

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

אתר ספציפי ליסין אצטילציה של היסטונים עבור שחזור Nucleosome באמצעות הרחבת קוד גנטי ב Escherichia קולי

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...