Name: large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

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1. प्लाज्मिड निर्माण
<ol><li>
पीसीआर द्वारा बढ़ाना (या प्रतिलेखन पीसीआर रिवर्स अगर एक आरएनए से शुरू टेम्पलेट) सीडीएनए अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में विधानसभा की अनुमति देने के लिए 5 ' विस्तार के साथ प्राइमरों ?...

<ol>
	<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Research+on+Non-Coding+Ribonucleic+Acid+(RNA).">Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA).</a> Genes. 8 (12), (2017).</li><li>Hamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+approaches+to+RNA+aptamer+design.">In silico approaches to RNA aptamer design.</a> Biochimie. 145, 8-14 (2018).</li><li>Bobbin, M. L., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)-Based+Therapeutics:+Delivering+on+the+Promise?.">RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).</li><li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+for+Mosquito+and+Mosquito-Borne+Disease+Control.">RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control.</a> Insects. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expression+and+purification+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Methods. 54 (2), 267-273 (2011).</li><li>Kikuchi, Y., Umekage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nucleic+acids+of+the+marine+bacterium+Rhodovulum+sulfidophilum+and+recombinant+RNA+production+technology+using+bacteria.">Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+RNA+technology:+the+tRNA+scaffold.">Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold.</a> Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).</li><li>Batey, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+methods+for+native+expression+and+purification+of+RNA+for+structural+studies.">Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).</li><li>El Khouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+RNA-Protein+Complexes+in+Escherichia+coli.">Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli.</a> Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).</li><li>Ponchon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+RNA-protein+complexes+in+Escherichia+coli+and+applications+to+RNA+biology.">Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology.</a> Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).</li><li>Umekage, S., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+production+and+purification+of+circular+RNA+aptamer.">In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer.</a> Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).</li><li>Dar&#242;s, J. -. A., Aragon&#233;s, V., Cordero, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viroid-derived+system+to+produce+large+amounts+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids:+small+noncoding+infectious+RNAs+with+the+remakable+ability+of+autonomous+replication.">Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication.</a> Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).</li><li>Flores, R., Hern&#225;ndez, C., Mart&#237;nez de Alba, A. E., Dar&#242;s, J. A., Di Serio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+and+viroid-host+interactions.">Viroids and viroid-host interactions.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).</li><li>Di Serio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICTV+Virus+Taxonomy+Profile:+Avsunviroidae.">ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae.</a> The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).</li><li>Nohales, M. A., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroid+RNA+redirects+host+DNA+ligase+1+to+act+as+an+RNA+ligase.">Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).</li><li>Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+chloroplastic+isoform+of+tRNA+ligase+in+the+replication+of+viroids+belonging+to+the+family+Avsunviroidae.">Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggplant+latent+viroid:+a+friendly+experimental+system+in+the+family+Avsunviroidae.">Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).</li><li>Cordero, T., Ortol&#224;, B., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+Eggplant+Latent+Viroid+RNA+Circularization+by+the+Eggplant+tRNA+Ligase+in+Escherichia+coli.">Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li><li>Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-dimensional+electrophoretic+technique+for+the+detection+of+circular+viroids+and+virusoids.">A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids.</a> Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).</li><li>Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+electrophoretic+properties+of+solubilizable+disulfide+gels.">Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels.</a> Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).</li><li>Gigu&#232;re, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+structures+of+all+members+of+the+Avsunviroidae+family.">Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family.</a> Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).</li><li>L&#243;pez-Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+initiation+sites+of+eggplant+latent+viroid+strands+map+within+distinct+motifs+in+their+in+vivo+RNA+conformations.">The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations.</a> RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).</li></ol>

जबकि ELVd अनुक्रम और संरचना बैंगन tRNA ligase द्वारा मांयता में शामिल आवश्यकताओं शोध, हमने देखा है कि सह गैर में दोनों अणुओं की अभिव्यक्ति-मेजबान ई. कोलाई viroid परिपत्र के एक अप्रत्याशित बड़े संचय के लिए नेतृत्?...

डीएनए और प्रोटीन के विपरीत, आरएनए की बड़ी मात्रा में आसान, कुशल और लागत प्रभावी उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल प्रचुर मात्रा में नहीं हैं । हालांकि, अनुसंधान और उद्योग इन जैव अणुओं की मात्रा में वृद्धि की मांग उनके अद्वितीय जैविक1संपत्तियों की जांच करने के लिए, या अत्यधिक विशिष्ट aptamers के रूप में उनके उपयोग सहित परिष्कृत प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों में कार्यरत हो 2, चिकित्सकीय एजेंटों3, या चयनात्मक कीटनाशकों4। इन विट्रो में प्रतिलेखन और रासायनिक संश्लेषण आमतौर पर आरएनए का उत्पादन करने के लिए अनुसंधान में इस्तेमाल कर रहे हैं. हालांकि, इन पद्धतियों महत्वपूर्ण सीमाओं जब उत्पादों की बड़ी मात्रा में आवश्यक है जोर । तार्किक विकल्प के लिए जीवित कोशिकाओं की अंतर्जात प्रतिलेखन मशीनरी का उपयोग करने के लिए है, एक शुद्धि प्रक्रिया के बाद सेलुलर साथी से ब्याज की RNAs अलग करने के लिए । इस रणनीति के बाद, तरीकों को बैक्टीरियल कोशिकाओं में रिकॉमबिनेंट RNAs उत्पादन के लिए विकसित किया गया है, इस तरह के रूप में प्रयोगशाला के अनुकूल ई कोलाई5 या समुद्री बैंगनी phototrophic अल्फा-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. बैक्टीरिया में रिकॉमबिनेंट आरएनए का उत्पादन करने के लिए सबसे अधिक तरीके एक देशी अत्यधिक स्थिर आरएनए पाड़ की अभिव्यक्ति पर निर्भर करते हैं, जैसे कि एक tRNA या एक rRNA, जिसमें ब्याज की आरएनए7डाला जाता है. इस chimeric अणु से बाहर ब्याज की आरएनए जारी की आवश्यकता लगाता है, अगर अतिरिक्त आरएनए की उपस्थिति के बहाव अनुप्रयोगों के लिए एक समस्या है8. रिकॉमबिनेंट आरएनए जैव प्रौद्योगिकी में एक और अवधारणा रिकॉमबिनेंट ribonucleoprotein कॉम्प्लेक्स है कि प्रति वांछित उत्पाद हो सकता है या ब्याज9की आरएनए की स्थिरता को बढ़ाने के लिए एक सुरक्षात्मक रणनीति के रूप में इस्तेमाल किया का उत्पादन है, 10. इसी तरह, परिपत्र RNAs के उत्पादन में भी अधिक स्थिर उत्पाद पैदा करने के लिए एक रणनीति के रूप में सुझाव दिया गया है11.
हम हाल ही में एक नई विधि के लिए ई. कोलाई में रिकॉमबिनेंट आरएनए कि उपर्युक्त अवधारणाओं के तीन में भाग लेने में बड़ी मात्रा में उत्पादन विकसित किया है: एक अत्यंत स्थिर परिपत्र आरएनए पाड़ में ब्याज की आरएनए के सम्मिलन और सह की अभिव्यक्ति एक बातचीत प्रोटीन के साथ रिकॉमबिनेंट आरएनए की संभावना एक स्थिर ribonucleoprotein जटिल है कि जीवाणु कोशिकाओं में उल्लेखनीय मात्रा में जमा12का उत्पादन. पिछले घटनाक्रम के विपरीत, हम एक आरएनए पाड़ पूरी तरह से ई. कोलाई, अर्थात् एक viroid के लिए विदेशी इस्तेमाल किया । Viroids उच्च संयंत्रों के संक्रामक एजेंटों का एक बहुत ही विशेष प्रकार है कि विशेष रूप से एक अपेक्षाकृत छोटे द्वारा गठित कर रहे है (246-401 nt) अत्यधिक आधार युग्मित आरएनए13। दिलचस्प है, viroids गैर कोडिंग RNAs है और अपने स्वयं के प्रोटीन से कोई मदद के साथ, वे संक्रमित14में जटिल संक्रामक चक्र को पूरा करने में सक्षम हैं । इन चक्रों में आरएनए-टू-आरएनए प्रतिकृति नाभिक या chloroplasts, viroid परिवार पर निर्भर करता है —Pospiviroidae या Avsunviroidae, क्रमशः-संक्रमित संयंत्र और मेजबान रक्षात्मक प्रतिक्रिया की चोरी के माध्यम से आंदोलन शामिल हैं । Viroids प्रकृति में सबसे स्थिर RNAs के बीच क्रमित किया जाना चाहिए, एक नग्न परिपत्र आरएनए होने का एक परिणाम के रूप में और संयंत्र संक्रमित कोशिकाओं के शत्रुतापूर्ण वातावरण में जीवित रहने के लिए होने. इस संपत्ति viroids विशेष रूप से उपयुक्त पाड़ों के रूप में रिकॉमबिनेंट आरएनए के लिए प्रौद्योगिकी के दृष्टिकोण में स्थिर कर सकते हैं । इसके अलावा, नई विधि सह पर आधारित है एक बातचीत संयंत्र प्रोटीन के साथ viroid पाड़ की अभिव्यक्ति । Viroids एक रोलिंग सर्किल तंत्र जिसमें मेजबान एंजाइमों की प्रक्रिया के विभिंन चरणों उत्प्रेरित भर्ती कर रहे है के माध्यम से दोहराने । विशेष रूप से कुछ viroids, अधिक विशेष रूप से उन है कि परिवार Avsunviroidae15से संबंधित हैं, ribozymes भी है कि प्रतिकृति में शामिल हैं । viroid प्रजातियों पर निर्भर करता है, viroid RNAs की प्रतिलिपि मेजबान आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय या chloroplastic परमाणु इनकोडिंग आरएनए पोलीमरेज़ (नेप) द्वारा मध्यस्थता है. Viroid आरएनए प्रोसेसिंग एक मेजबान प्रकार-III RNase द्वारा catalyzed लगता है, हालांकि ribozymes oligomeric आरएनए मध्यवर्ती के साथ viroids में प्रतिकृति के दौरान स्व-सट. अंत में, परिणामस्वरूप viroid मोनोमर, viroid परिवार के आधार पर, मेजबान डीएनए ligase 1 या chloroplastic isoform16,17के tRNA ligase द्वारा परिपत्रित हैं । यह आखिरी एंजाइम परिवार Avsunviroidaeमें viroids के monomeric रूपों के बंधाव में शामिल है, जैसे बैंगन उनक viroid (ELVd)18.
एक काम के दौरान अनुक्रम और ELVd कि बैंगन (मकोय melongena एल) tRNA ligase द्वारा मांयता निर्धारित की संरचनात्मक आवश्यकताओं का विश्लेषण करने के लिए, हम एक प्रयोगात्मक सह पर आधारित प्रणाली की स्थापना की ई. कोलाई में दोनों अणुओं की अभिव्यक्ति 19. हमने देखा है कि अब से अधिक इकाई ELVd टेप स्वयं-कुशलतापूर्वक ई. कोलाई कोशिकाओं में एंबेडेड हथौड़ा ribozymes के माध्यम से और है कि जिसके परिणामस्वरूप viroid मोनोमर के साथ 5 '-हाइड्रॉक्सिल और 2 ', 3 '-phosphodiester टर्मिनी थे कुशलतापूर्वक सह-व्यक्त बैंगन tRNA ligase द्वारा परिपत्र । इससे भी अधिक, परिणामस्वरूप परिपत्र viroid आरएनए ई. कोलाईमें एक अप्रत्याशित उच्च एकाग्रता तक पहुँच, अंतर्जात rRNAs12के उन से अधिक. प्रतिकृति मध्यवर्ती की अनुपस्थिति इन बैक्टीरियल कोशिकाओं में ELVd आरएनए-टू-आरएनए प्रवर्धन की कमी संकेत दिया । दिलचस्प है, viroid अणु की एक विशेष स्थिति में heterologous RNAs की प्रविष्टि परिपत्र viroid के संचय पर एक उदारवादी प्रभाव था-RNAs12व्युत्पंन । इन टिप्पणियों ने हमें बैक्टीरिया में रिकॉमबिनेंट RNAs की बड़ी मात्रा का उत्पादन करने के लिए एक विधि की कल्पना की । इस विधि में, ब्याज की RNAs के लिए इसी cDNAs ELVd सीडीएनए में डाला जाता है और परिणामस्वरूप chimeric आरएनए ई. कोलाई में एक मजबूत गठन प्रमोटर के माध्यम से व्यक्त किया जाता है । काम करने के लिए प्रणाली के लिए, ई. कोलाई सह होना चाहिए एक प्लाज्मिड के साथ परिवर्तित करने के लिए बैंगन tRNA ligase व्यक्त करते हैं । ELVd-प्राप्त अब से अधिक इकाई प्रतिलिपि एंबेडेड हथौड़ा ribozymes द्वारा संसाधित है और उचित टर्मिनी के साथ जिसके परिणामस्वरूप मोनोमर मांयता प्राप्त कर रहे है और सह द्वारा परिपत्र tRNA ligase व्यक्त की है । इस तरह, ब्याज की आरएनए viroid परिपत्र अणु से मिलकर एक बहुत स्थिर परिपत्र पाड़ में डाला जाता है । इस रिकॉमबिनेंट chimeric आरएनए सबसे शायद आगे tRNA ligase के साथ बातचीत के माध्यम से एक ribonucleoprotein परिसर के गठन के द्वारा ई. कोलाई कोशिकाओं के अंदर स्थिर है । इस विधि का प्रयोग (नीचे प्रोटोकॉल देखें), आरएनए aptamers, hairpin RNAs और अन्य संरचित RNAs आसानी से ई. कोलाई संस्कृति की प्रति लीटर की मात्रा में उत्पादन किया गया है नियमित रूप से प्रयोगशाला की स्थितियों में और सजातीयता को ले शुद्ध परिपत्र का लाभ12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bpi I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010</td>
			<td>D1 low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131008.1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>Ba2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>48045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>X1402.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131785.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucloSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>22740588.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69387-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115(DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref. Timmons et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C 0113.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1211</td>
			<td>87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131509.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122333.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131020.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>FE04791000</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3691,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap DEAE Sepharose FF column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5055-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTAprime plus liquid chromatography system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>11001313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamyde</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1089,1000</td>
			<td>2K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>146392.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2940,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0937,2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Bis(acryloyl)cystamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4929-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli

आरएनए जीव विज्ञान और परिष्कृत जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों में आरएनए अणुओं के उपयोग में बढ़ती रुचि के साथ, रिकॉमबिनेंट RNAs की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के तरीके सीमित हैं । यहां, हम एक viroid पाड़ और एक संयंत्र tRNA ligase में ब्याज की आरएनए शामिल है कि एक chimeric अणु की सह अभिव्यक्ति पर आधारित ई कोलाई में रिकॉमबिनेंट आरएनए की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । Viroids अपेक्षाकृत छोटे हैं, गैर कोडिंग, उच्च आधार युग्मित परिपत्र RNAs है कि अधिक पौधों के लिए संक्रामक हैं । मेजबान संयंत्र tRNA ligase एक viroids है कि परिवार Avsunviroidae, जैसे बैंगन अव्यक्त viroid (ELVd), circularization पुनरावृत्ति के दौरान आरएनए viroid मध्यस्थता करने के लिए संबंधित द्वारा भर्ती एंजाइम है । हालांकि ELVd ई. कोलाई, एक ELVd अग्रदूत में दोहराने नहीं है कुशलतापूर्वक ई. कोलाई आरएनए पोलीमरेज़ द्वारा लिखित और बैक्टीरियल कोशिकाओं में एम्बेडेड हथौड़ा ribozymes द्वारा संसाधित है, और परिणामस्वरूप मोनोमर द्वारा परिपत्र सह-व्यक्त tRNA ligase एक उल्लेखनीय एकाग्रता तक पहुँचने. ELVd पाड़ में ब्याज की एक आरएनए के सम्मिलन नियमित प्रयोगशाला की स्थिति में बैक्टीरियल संस्कृति के प्रति लीटर रिकॉमबिनेंट आरएनए के मिलीग्राम के उत्पादन में सक्षम बनाता है. आरएनए उत्पाद का एक मुख्य अंश परिपत्र, एक विशेषता है कि आभासी सजातीयता को रिकॉमबिनेंट आरएनए की शुद्धि की सुविधा है । इस प्रोटोकॉल में, एक पूरक डीएनए (सीडीएनए) ब्याज की आरएनए के लिए इसी ELVd सीडीएनए की एक विशेष स्थिति में एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड है कि प्रयोग किया जाता है में डाला जाता है, प्लाज्मिड के साथ सह एक्सप्रेस बैंगन tRNA ligase, ई. कोलाईको बदलने के लिए । मजबूत गठित प्रवर्तकों के नियंत्रण में दोनों अणुओं की सह-अभिव्यक्ति रिकॉमबिनेंट आरएनए की बड़ी मात्रा के उत्पादन की ओर ले जाती है । रिकॉमबिनेंट आरएनए को बैक्टीरियल कोशिकाओं से निकाला जा सकता है और इसके प्रचलन का लाभ उठाते हुए बैक्टीरियल RNAs के थोक से अलग कर दिया जाता है.

ELVd-व्युत्पंन प्रणाली12का उपयोग कर ई. कोलाई में रिकॉमबिनेंट आरएनए का उत्पादन करने के लिए, ब्याज की आरएनए एक ELVd आरएनए पाड़ में भ्रष्टाचारी है । इस chimeric आरएनए सह है ई. कोलाईमें बैंग?...

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Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

एक परिपत्र पाड़ पर रिकॉमबिनेंट RNAs के बड़े पैमाने पर उत्पादन ई कोलाई में एक Viroid-व्युत्पन्न प्रणाली का उपयोग

यहाँ, हम एक viroid पाड़ और एक संयंत्र tRNA ligase में ब्याज की आरएनए शामिल है कि सह-व्यक्त एक chimeric आरएनए के द्वारा ई कोलाई में रिकॉमबिनेंट आरएनए की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं. मुख्य उत्पाद एक परिपत्र अणु कि सजातीयता को शुद्धीकरण की सुविधा है ।

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

यह विधि अनुसंधान या उद्योग में आवेदन के लिए ब्याज की बड़ी मात्रा में पुनर्संयोजन आरएनए का उत्पादन करने में मदद कर सकती है। मुख्य लाभ यह है कि एक सस्ती प्रक्रिया में एस्चेरिचिया कोलाई में पुनर्संयोजन आरएनए का उत्पादन किया जाता है जिसे आसानी से बढ़ाया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि आरएनए का उत्पादन एक परिपत्र आरएनए पाड़ पर किया जाता है, जो शुद्धिकरण को एकरूपता की सुविधा प्रदान करता है।डीएनए या प्रोटीन के विपरीत, ब्याज की आरएनए आसानी से बायोफैक्ट्री सिस्टम, ऐसी एस्चेरिचिया कोलाई संस्कृति में बड़ी मात्रा में उत्पादित नहीं होती हैं। हमारी विधि एक अत्यधिक स्थिर परिपत्र पाड़ में डाली गई ब्याज की आरएनए की सह-अभिव्यक्ति पर आधारित है और आरएनए परिपत्रीकरण में मध्यस्थता करने वाले लिगाज़ को लागू कर रही है। परिपत्र आरएनए पाड़ एक पेटेंट विरॉइड से निकला है।विरॉइड अपेक्षाकृत छोटे, गैर-कुंडल, अत्यधिक आधार-युग्मित परिपत्र आरएनए हैं जो कुछ उच्च पौधों के लिए संक्रामक हैं। हम नियमित प्रयोगशाला की स्थिति में जीवाणु संस्कृति के प्रति लीटर पुनर्संयोजन आरएनए के दसियों मिलीग्राम का उत्पादन कर सकते हैं। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित पीसीआर द्वारा सीडीएनए को बढ़ाना।इसके बाद, प्लाज्मिड पीएलएमिड पीएलवीडी-बीजेडबी के 100 नैनोग्राम को 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ें। 20 माइक्रोलीटर प्रतिक्रिया बनाने के लिए टाइप आईआईएस प्रतिबंध एंजाइम बीपीआई और बफर जी के लिए पर्याप्त 10 यू जोड़ें। प्लाज्मिड को पचाने के लिए एक घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।इसके बाद, टीएई बफर में एक प्रतिशत एगरे जैल में इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा पीसीआर और पाचन उत्पादों को अलग करें। 0.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर 200 मिलीलीटर एथिडियम ब्रोमाइड में हिलाकर जेल को दाग दें। यूवी ट्रांसिल्यूमिनेटर का उपयोग करके, डीएनए की कल्पना करें।प्रवर्धित सीडीएनए और बीपीआई पचाने वाले प्लाज्मिड के अनुरूप बैंड को काटने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। सिलिका जेल कॉलम का उपयोग करना, जेल के टुकड़ों से डीएनए को एल्यूट करें। स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा डीएनए की एकाग्रता की मात्रा निर्धारित करें।प्रवर्धित सीडीएनए और पचा हुआ प्लाज्मिड का उपयोग करके गिब्सन असेंबली प्रतिक्रिया की स्थापना करें। एक घंटे तक 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। फिर, प्रतिक्रिया को शुद्ध करने के लिए सिलिका जेल कॉलम का उपयोग करें।सक्षम ई.कोलाई डीएच5-अल्फा कोशिकाओं को इलेक्ट्रोपोरा करने के बाद, कई सफेद उपनिवेशों को चुनें और उन्हें तरल पौंड माध्यम में स्थानांतरित करें। कॉलोनियों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर उगाएं। इसके बाद, प्लाज्मिड को शुद्ध करने के लिए एक मिनीप्रेप किट का उपयोग करें, और टीएई बफर में एक प्रतिशत एगर उठे जेल में इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा उनके आकार का विश्लेषण करें।सबसे पहले, दोनों pLELVd-BZB व्युत्पन्न है कि ब्याज की आरएनए और प्लाज्मिड P15LTRNISM के अनुरूप सीडीएनए शामिल है के साथ चयनित ई.कोलाई तनाव सह इलेक्ट्रोपोरेट बैंगन tRNA ligase सह व्यक्त करने के लिए । कोशिकाओं को ठीक करने के लिए इलेक्ट्रोपाउरेशन क्यूवेट में एसओसी तरल माध्यम को स्थानांतरित करें, और एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, एलबी सॉलिड मीडियम पर बैक्टीरिया को प्लेट करें जिसमें ५० माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर एम्पीसिलिन और ३४ माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर क्लोरम्फेनिकोल होता है ।रात 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। अगले दिन, तरल टीबी माध्यम के २५० मिलीलीटर जोड़ें, जिसमें ५० माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर एम्पिसिलिन, और ३४ माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर क्लोरम्फेनिकोल, एक लीटर चकित एर्लेनमेयर फ्लास्क में जोड़ें । इनक्यूबेटेड ई. कोलाई को पुनः प्राप्त करें, और फिर एक कॉलोनी चुनें और फ्लास्क में माध्यम को टीका लगाएं।बैक्टीरिया की कटाई से पहले 12 से 16 घंटे के लिए १८० आरपीएम पर जोरदार मिलाते हुए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट । काटा ई. कोलाई संस्कृति एक २५० मिलीलीटर अपकेंद्रित्र की बोतल में डालो और 14, 000 जी पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं नीचे स्पिन । सुपरनेट को त्यागें और कोशिकाओं को 30 मिलीलीटर पानी में फिर से रखें।इस निलंबन को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें, और पिछली स्थितियों का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से स्पिन करें। सुपरनेट को त्यागें और सेल पेलेट में क्रोमेटोग्राफी बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें। भंवर बफर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करने के लिए।कोशिकाओं को तोड़ने के लिए फिनोल: क्लोरोफॉर्म और भंवर की एक मात्रा जोर से जोड़ें। फिर, 10 मिनट के लिए 12, 000 G पर अपकेंद्रित्र। जलीय चरण को ठीक करें, क्लोरोफॉर्म की एक मात्रा जोड़ें, और भंवर सख्ती से जोड़ें।10 मिनट के लिए 12, 000 G पर सेंट्रलाइज। इसके बाद 45 माइक्रोमीटर सिरिंज फिल्टर के जरिए आरएनए की तैयारी को फिल्टर करें। एक मिलीलीटर डिथाइल इथेनॉल अमीन कॉलम का उपयोग करके आरएनए को शुद्ध करें जो तरल क्रोमेटोग्राफी प्रणाली से जुड़ा हुआ है।प्रवाह दर को प्रति मिनट एक मिलीलीटर में समायोजित करें, और क्रोमेटोग्राफी बफर के 10 मिलीलीटर के साथ कॉलम को बराबर करें। फिर, नमूना लोड करें और क्रोमेटोग्राफी बफर के 10 मिलीलीटर के साथ कॉलम धोएं। एल्यूशन बफर के 20 मिलीलीटर के साथ आरएनए को एल्यूट करें, और एक मिलीलीटर एलिकोट्स एकत्र करें।दो आयामी पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग करके, परिपत्र आरएनए को उनके रैखिक समकक्षों से अलग करें। सबसे पहले, TBE बफर में पांच प्रतिशत पॉलीएक्रेलैमाइड जेल तैयार करें और पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित आठ मोलर यूरिया युक्त। लोडिंग बफर की एक मात्रा के साथ आरएनए की तैयारी के 20 माइक्रोलीटर मिलाएं।१.५ मिनट के लिए एक हीटिंग ब्लॉक में ९५ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, और फिर तस्वीर-बर्फ पर शांत । पॉलीएक्रेलैमाइड जेल में नमूनों को लोड करें और जेल आयाम के लिए उपयुक्त परिस्थितियों में इलेक्ट्रोफोरेसिस चलाएं। इसके बाद 15 मिनट तक 05 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर एथिडियम ब्रोमाइड में जेल को दाग दें।दाग वाले जेल को पानी से धोएं, और फिर यूवी लाइट के नीचे आरएनए की कल्पना करें। कई रीकॉम्बिनेंट प्लाज्मिड का इलेक्ट्रोफोरेटिक विश्लेषण जिसमें विभिन्न सीडीएनए डाले जाते हैं, पीईएलवीडी-बीजेडबी की तुलना में अलग-अलग माइग्रेशन दिखाते हैं। ध्यान दें कि pLELVd-BZB में लैक्ज़ मार्कर होता है, जिसे ब्याज के आरएनए के अनुरूप सीडीएनए द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, इसलिए माइग्रेशन डाला गई सीडीएनए के आकार पर निर्भर करता है, फिर से संयोजन प्लाज्मिड आमतौर पर नियंत्रण प्लाज्मिड की तुलना में तेजी से माइग्रेट होगा।सह-इलेक्ट्रोपेटेड बैक्टीरियल संस्कृतियों में पुनर्संयोजक आरएनए के उत्पादन की निगरानी कोशिकाओं को तोड़कर और पृष्ठ को विकृत करके आरएनए का विश्लेषण करके की जाती है। मजबूत बैंड देखा जा सकता है, जो खाली ELVd और चिमरिक ELVd रूपों के अनुरूप है, जिसमें ब्याज के विभिन्न RNAs डाला गया । दिलचस्प बात यह है कि पुनर्संयोजन आरएनए का एक प्रमुख अंश एक परिपत्र रूप के रूप में देखा जाता है।मुख्य अंश की गोलाकारता उच्च और निम्न आयनिक शक्ति पर विकृत परिस्थितियों के तहत दो PAGEs के संयोजन का उपयोग करके देखा जाता है। आरएनए की तैयारी को एनियन एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी द्वारा और शुद्ध किया जा सकता है। जैसा कि यहां देखा गया है, ई कोलाई आरएनए को कम आयनिक ताकत पर कुशलतापूर्वक बनाए रखा जाता है, और बाद में उच्च आयनिक ताकत पर एल्यूट किया जाता है, जिसमें अधिकांश आरएनए दो और तीन अंशों में एकत्र किए जाते हैं।रीकॉम्बिनेंट आरएनए को 2-डी इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा एकरूपता के लिए और शुद्ध किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल एस्चेरिचिया कोलाई में बड़ी मात्रा में पुनर्संयोजन आरएनए के आसान उत्पादन और अंतिम उत्पाद की परिपत्रता के लिए एकरूपता के लिए शुद्धिकरण की अनुमति देता है। याद रखें कि ब्याज के आरएनए परिणाम एक परिपत्र आरएनए पाड़ में एम्बेडेड एक संयंत्र विरॉइड से व्युत्पन्न।यदि आप दोनों मोइटीज को अलग करना चाहते हैं, तो आपको एक मानक रणनीति का उपयोग करने की आवश्यकता है, जैसे कि रिबोजिम्स, DNAzymes, या RNase H.The इस प्रोटोकॉल की उपज ब्याज की विशेष आरएनए पर निर्भर करती है, क्योंकि छोटे आरएनए बड़े लोगों की तुलना में अधिक मात्रा में उत्पादित होने की संभावना है। बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति के लिए, ध्यान में रखना है कि बैक्टीरिया फसल के लिए इष्टतम समय ई. कोलाई तनाव, संस्कृति माध्यम, और बढ़ती स्थितियों सहित कई कारकों पर निर्भर करता है । हम आपकी विशेष परिस्थितियों में इष्टतम उत्पादन खिड़की खोजने के लिए प्रारंभिक समय पाठ्यक्रम परख की सलाह देते हैं।याद रखें कि पुनर्संयोजन आरएनए बैक्टीरियल कोशिकाओं में क्षणिक रूप से जमा होते हैं, और वे देर से बढ़ते चरण में पूरी तरह से गायब हो जाते हैं।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

से बाहरी झिल्ली Vesicles भीतर निर्देशित प्रोटीन पैकेजिंग<em&gt; कोलाई</em&gt;: डिजाइन, उत्पादन और शोधन

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

के पीएच निर्भर गतिविधि का पता लगाने<em&gt; कोलाई</em&gt; निगरानी HdeB<em&gt; इन विट्रो</em&gt; और<em&gt; Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

ठहराव की बहुतायत और चार्ज करने के स्तर के हस्तांतरण RNAs में ई कोलाई

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis एलिगेंस में उच्च प्रवाह रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए एक सरल तरीका

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

साइट-निर्देशित Mutagenesis इन विट्रो में और Vivo प्रयोगों उदाहरण में आरएनए बातचीत के साथ ई कोलाई

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

परिपत्र आरएनए का विश्लेषण करने के लिए मिनीजीन युक्त एलु तत्व का उपयोग

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

लिपिड-मिश्रण परख के लिए Liposomes में रिकॉमबिनेंट Drosophila Atlastin के डिटर्जेंट की मदद से पुनर्गठन

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

एस्चेरिचिया कोलाई में जेनेटिक कोड विस्तार का उपयोग करके न्यूक्लियोसोम पुनर्गठन के लिए हिस्टोन्स की साइट विशिष्ट लाइसिन एसिटिलेशन

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...