Name: large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio BIO2017-83184-R e BIO2017-91865-EXP da Spagnolo Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (cofinanziati fondi FEDER).

1. plasmide costruzione
<ol><li>
Amplificare mediante PCR (o da trascrizione d'inversione PCR se partendo da un modello di RNA) il cDNA corrispondente al RNA di interesse utilizzando primer con 5' estensione che consente un assemblaggio nel plasmide di espressione. Per evitare indesiderate mutazioni, utilizzare una DNA polimerasi ad alta fedeltà.
	<ol>
<li>Per inserire il cDNA nel plasmide di espressione di Gibson Assemblea20, aggiungere le seguenti estensioni di 5' per gli in...

<ol>
	<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Research+on+Non-Coding+Ribonucleic+Acid+(RNA).">Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA).</a> Genes. 8 (12), (2017).</li><li>Hamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+approaches+to+RNA+aptamer+design.">In silico approaches to RNA aptamer design.</a> Biochimie. 145, 8-14 (2018).</li><li>Bobbin, M. L., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)-Based+Therapeutics:+Delivering+on+the+Promise?.">RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).</li><li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+for+Mosquito+and+Mosquito-Borne+Disease+Control.">RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control.</a> Insects. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expression+and+purification+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Methods. 54 (2), 267-273 (2011).</li><li>Kikuchi, Y., Umekage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nucleic+acids+of+the+marine+bacterium+Rhodovulum+sulfidophilum+and+recombinant+RNA+production+technology+using+bacteria.">Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+RNA+technology:+the+tRNA+scaffold.">Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold.</a> Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).</li><li>Batey, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+methods+for+native+expression+and+purification+of+RNA+for+structural+studies.">Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).</li><li>El Khouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+RNA-Protein+Complexes+in+Escherichia+coli.">Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli.</a> Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).</li><li>Ponchon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+RNA-protein+complexes+in+Escherichia+coli+and+applications+to+RNA+biology.">Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology.</a> Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).</li><li>Umekage, S., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+production+and+purification+of+circular+RNA+aptamer.">In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer.</a> Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).</li><li>Dar&#242;s, J. -. A., Aragon&#233;s, V., Cordero, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viroid-derived+system+to+produce+large+amounts+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids:+small+noncoding+infectious+RNAs+with+the+remakable+ability+of+autonomous+replication.">Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication.</a> Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).</li><li>Flores, R., Hern&#225;ndez, C., Mart&#237;nez de Alba, A. E., Dar&#242;s, J. A., Di Serio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+and+viroid-host+interactions.">Viroids and viroid-host interactions.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).</li><li>Di Serio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICTV+Virus+Taxonomy+Profile:+Avsunviroidae.">ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae.</a> The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).</li><li>Nohales, M. A., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroid+RNA+redirects+host+DNA+ligase+1+to+act+as+an+RNA+ligase.">Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).</li><li>Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+chloroplastic+isoform+of+tRNA+ligase+in+the+replication+of+viroids+belonging+to+the+family+Avsunviroidae.">Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggplant+latent+viroid:+a+friendly+experimental+system+in+the+family+Avsunviroidae.">Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).</li><li>Cordero, T., Ortol&#224;, B., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+Eggplant+Latent+Viroid+RNA+Circularization+by+the+Eggplant+tRNA+Ligase+in+Escherichia+coli.">Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li><li>Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-dimensional+electrophoretic+technique+for+the+detection+of+circular+viroids+and+virusoids.">A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids.</a> Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).</li><li>Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+electrophoretic+properties+of+solubilizable+disulfide+gels.">Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels.</a> Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).</li><li>Gigu&#232;re, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+structures+of+all+members+of+the+Avsunviroidae+family.">Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family.</a> Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).</li><li>L&#243;pez-Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+initiation+sites+of+eggplant+latent+viroid+strands+map+within+distinct+motifs+in+their+in+vivo+RNA+conformations.">The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations.</a> RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).</li></ol>

Mentre la ricerca i requisiti di struttura coinvolti nel riconoscimento della melanzana ligasi di tRNA ed ELVd sequenza, abbiamo notato che co-espressione di entrambe le molecole nel non host Escherichia coli ha condotto ad un grande accumulo imprevisto di viroide circolare forme in cellule batteriche19. Abbiamo capito che il grande accumulo di viroide RNA in e. coli era più probabilmente la conseguenza di cheesprimono una molecola di RNA altamente stabile, ad esempio il relativ...

A differenza del DNA e proteine, protocolli per la produzione di semplice, efficiente ed economica di grandi quantità di RNA non sono abbondanti. Tuttavia, ricerca e industria domanda quantità crescenti di queste biomolecole per studiare le loro proprietà biologiche uniche1, o per essere impiegati in sofisticate applicazioni biotecnologiche, tra cui il loro uso come aptameri altamente specifico 2, agenti terapeutici3o pesticidi selettiva4. Sintesi chimica e trascrizione in vitro sono comunemente usati nella ricerca per produrre RNA. Tuttavia, questi metodi comportano limitazioni importanti quando grandi quantità di prodotti sono richiesti. La logica alternativa consiste nell'utilizzare i macchinari di trascrizione endogena delle cellule viventi, seguita da un processo di purificazione per separare il RNA di interesse dai compagni cellulari. Seguendo questa strategia, sono stati sviluppati metodi per produrre RNA ricombinante in cellule batteriche, quali il laboratorio-friendly Escherichia coli5 o la Marina viola phototrophic alfa-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. maggior parte dei metodi per produrre RNA ricombinante nei batteri si basano sull'espressione di un'impalcatura nativa di RNA altamente stabile, come un tRNA o un rRNA, in cui il RNA di interesse è inserito7. Questo impone la necessità di liberare il RNA di interesse fuori la molecola chimerica, se la presenza di RNA supplementare è un problema per le applicazioni a valle8. Un altro concetto a ricombinante biotecnologie RNA è la produzione di complessi della ribonucleoproteina ricombinante che può essere il prodotto desiderato per sé o utilizzato come una strategia di protezione per aumentare la stabilità del RNA di interesse9, 10. Analogamente, la produzione di RNA circolare inoltre è stata suggerita come una strategia per generare più stabile prodotti11.
Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo metodo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in e. coli che partecipa a tre dei concetti qui sopra: l'inserimento di RNA di interesse in un'impalcatura di RNA circolare altamente stabile e la co-espressione della RNA ricombinante con una proteina d'interazione probabile produrre una ribonucleoproteina stabile complessa che si accumula in quantità notevole in batterico cellule12. In contrasto con sviluppi precedenti, abbiamo usato un'impalcatura di RNA completamente estraneo ad e. coli, vale a dire un viroide. Viroidi sono un tipo molto particolare di agenti infettivi di più alte piante che sono costituite esclusivamente da un relativamente piccolo (246-401 nt) altamente abbinati in base circolare RNA13. Interessante, viroidi sono RNA non codificanti e, senza alcun aiuto di proprie proteine, sono in grado di completare cicli complessi infettive nel host infetti14. Questi cicli includono la replica di RNA-a-RNA nei nuclei o cloroplasti, a seconda della famiglia di viroide —Pospiviroidae o Avsunviroidae, rispettivamente — movimento attraverso la pianta infetta e l'evasione della risposta difensiva ospite. Viroidi devono essere allineati fra il RNAs più stabile in natura, come conseguenza di essere un RNA circolare nudo e dover sopravvivere in un ambiente ostile di cellule vegetali infetti. Questa proprietà può rendere particolarmente adatto come scaffold per stabilizzare ricombinante RNA in approcci biotecnologici viroidi. Inoltre, il nuovo metodo si basa sulla co-espressione dell'impalcatura viroide con un'interazione della pianta. Viroidi replicano attraverso un meccanismo di rotolamento-cerchio in quale host vengono reclutati gli enzimi per catalizzare le diverse fasi del processo. In particolare alcuni viroidi, in particolare quelli che appartengono alla famiglia Avsunviroidae15, contengono ribozimi che sono anche coinvolti nella replica. A seconda della specie di viroide, trascrizione di viroide RNAs è mediato dall'host RNA polimerasi II o dalla RNA polimerasi cloroplastica codificate (NEP). Elaborazione di viroide RNA sembra essere catalizzata da un host RNAsi di tipo III, anche se in viroidi con RNA oligomerici ribozimi intermedi self-fendono durante la replica. Infine, i monomeri viroide risultante sono circolarizzazione, a seconda della famiglia di viroide, la ligasi del DNA ospite 1 o l'isoforma cloroplastico di tRNA ligasi16,17. Questo ultimo enzima è coinvolto nella legatura delle forme monomeriche di viroidi nella famiglia Avsunviroidae, come melanzane viroid latente (ELVd)18.
Nel corso di un lavoro per analizzare i requisiti strutturali e sequenza di ELVd che determinano il riconoscimento di melanzana (Solanum melongena L.) ligasi tRNA, abbiamo istituito un sistema sperimentale basato sulla co-espressione di entrambe le molecole dentro e. coli 19. abbiamo notato che le trascrizioni di ELVd più lungo rispetto a unità self-fendono in modo efficiente in cellule di Escherichia coli attraverso i ribozimi hammerhead incorporato e che i monomeri viroide risultante con 5'-idrossile e 2', 3'-fosfodiestere termini erano in modo efficiente circolarizzazione dalla ligasi di tRNA melanzane co-espressi. Ancora di più, il RNA circolare viroide risultante ha raggiunto un'inattesa alta concentrazione in e. coli, superiori a quelle del endogeno rRNAs12. Assenza di replica intermedi indica la mancanza di amplificazione ELVd RNA-a-RNA in queste cellule batteriche. Interessante, inserimento di eterologa RNA in una particolare posizione della molecola viroide ha avuto un effetto moderato su accumulazione del RNAs circolare viroide-derivato12. Queste osservazioni ci ha fatto immaginare un metodo per produrre grandi quantità di ricombinante RNAs in batteri. In questo metodo, i cDNA corrispondente per il RNA di interesse vengono inseriti nel cDNA ELVd e il RNA chimerico risultante è espressa in e. coli attraverso un forte promotore costitutivo. Perché il sistema funzioni, e. coli devono essere co-trasformati con un plasmide per esprimere la melanzana ligasi di tRNA. La trascrizione di più-di-unità ELVd-derivato viene elaborata dai ribozimi hammerhead incorporato e i monomeri risultanti con termini appropriati sono riconosciuti e circolarizzazione dalla ligasi di tRNA co-espressi. In questo modo, il RNA di interesse viene inserito in un'impalcatura circolare molto stabile che consiste della molecola circolare viroide. Questo RNA chimerico recombinant molto probabilmente si è ulteriormente stabilizzata all'interno delle cellule di Escherichia coli mediante la formazione di una ribonucleoproteina complessa attraverso l'interazione con ligasi di tRNA. Utilizzando questo metodo (Vedi il protocollo qui sotto), RNA aptameri, hairpin RNA e altro RNAs strutturato è stati facilmente prodotto in quantità di decine di milligrammi per litro di coltura di Escherichia coli in condizioni di laboratorio regolari e purificato ad omogeneità prendendo vantaggio di circolarità12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bpi I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010</td>
			<td>D1 low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131008.1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>Ba2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>48045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>X1402.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131785.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucloSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>22740588.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69387-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115(DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref. Timmons et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C 0113.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1211</td>
			<td>87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131509.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122333.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131020.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>FE04791000</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3691,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap DEAE Sepharose FF column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5055-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTAprime plus liquid chromatography system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>11001313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamyde</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1089,1000</td>
			<td>2K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>146392.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2940,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0937,2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Bis(acryloyl)cystamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4929-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli

Con il crescente interesse per la biologia del RNA e l'impiego di molecole di RNA in sofisticate applicazioni biotecnologiche, i metodi per produrre grandi quantità di RNA ricombinante sono limitati. Qui, descriviamo un protocollo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in Escherichia coli basato su co-espressione di una molecola chimerica che contiene il RNA di interesse in un'impalcatura viroid e una pianta ligasi di tRNA. Viroidi sono relativamente piccole, non codificanti, altamente abbinati in base RNAs circolari che sono infettivi per piante superiori. L'host pianta tRNA ligasi è un enzima reclutato da viroidi che appartengono alla famiglia Avsunviroidae, quali melanzane viroid latente (ELVd), per mediare circularization di RNA durante la replica di viroide. Anche se ELVd non replica in Escherichia coli, un precursore di ELVd è efficientemente trascritti dalla RNA polimerasi Escherichia coli ed elaborato dai ribozimi hammerhead incorporato nelle cellule batteriche e i monomeri risultanti sono circolarizzazione della co-espressi ligasi di tRNA raggiungendo una notevole concentrazione. L'inserimento di un RNA di interesse in patibolo ELVd consente la produzione di decine di milligrammi di RNA ricombinante per litro di coltura batterica in condizioni normali di laboratorio. Una frazione principale del prodotto RNA è circolare, una caratteristica che facilita la purificazione del RNA ricombinante ad omogeneità virtuale. In questo protocollo, un corrispondente di DNA (cDNA) complementare al RNA di interesse viene inserito in una particolare posizione del cDNA ELVd in un plasmide di espressione che viene utilizzata, lungo il plasmide per co-esprimere melanzana-ligasi tRNA per trasformare e. coli. Co-espressione di entrambe le molecole sotto il controllo di promotori costitutivi forti porta alla produzione di grandi quantità di RNA ricombinante. il RNA ricombinante può essere Estratto da cellule batteriche e separato dalla massa di RNA batterico, approfittando della sua circolarità.

Per produrre RNA di ricombinante in e. coli usando il sistema ELVd-derivato12, il RNA di interesse si innesta in un'impalcatura di RNA ELVd. Questo RNA chimerico è co-espresso lungo la melanzana ligasi di tRNA in e. coli. Una volta elaborati, spaccati e circolarizzazione, il RNA chimerico circolare, dalla quale sporge il RNA di interesse, costituisce probabilmente una ribonucleoproteina complessa con l'enzima di melanzane co-espresso che raggiung...

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Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Produzione su larga scala di RNA ricombinante su un'impalcatura circolare utilizzando un sistema derivato Viroid in Escherichia coli

Qui, presentiamo un protocollo per produrre grandi quantità di RNA ricombinante in Escherichia coli co-esprimendo un RNA chimerico che contiene il RNA di interesse in un'impalcatura viroid e una pianta ligasi di tRNA. Il prodotto principale è una molecola circolare che facilita la purificazione di omogeneità.

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Questo metodo può aiutare a produrre grandi quantità di RNA ricombinanti di interesse per l'applicazione nella ricerca o nell'industria. Il vantaggio principale è che l'RNA ricombinante è prodotto in Escherichia coli in un processo economico che può essere facilmente scalato. È importante sottolineare che l'RNA è prodotto su un'impalcatura circolare dell'RNA, che facilita la purificazione all'omogeneità.A differenza del DNA o delle proteine, gli RNA di interesse non sono facilmente prodotti in grandi quantità nei sistemi biofabbri, come una cultura di Escherichia coli. Il nostro metodo si basa sulla co-espressione dell'RNA di interesse inserito in un'impalcatura circolare altamente stabile e applicando una ligasi che media la circolarizzazione dell'RNA. L'impalcatura circolare dell'RNA deriva da una viroide brevettata.I viroidi sono RNA circolari relativamente piccoli, non arrotolato, altamente accoppiati alla base che sono infettivi per alcune piante superiori. Possiamo produrre decine di milligrammi dell'RNA ricombinante per litro di coltura batterica in normali condizioni di laboratorio. Per iniziare questa procedura, amplificare il cDNA da PCR come descritto nel protocollo di testo.Quindi, aggiungere 100 nanogrammi del pLELVd-BZB plasmide a un tubo da 0,5 millilitri. Aggiungere 10 U dell'enzima di restrizione IIS BpiI e abbastanza tampone G per creare una reazione di 20 microliter. Incubare a 37 gradi Celsius per un'ora per digerire il plasmide.Successivamente, separare la PCR e i prodotti di digestione per elettroforesi in un gel di agarosio dell'uno per cento nel tampone TAE. Macchiare il gel scuotendolo in bromuro di etidio da 200 millilitri ad una concentrazione di 0,5 microgrammi per millilitro. Usando un transilluminatore UV, visualizza il DNA.Utilizzare un bisturi per tagliare le bande corrispondenti al cDNA amplificato e al plasmide digerito BpiI. Usando colonne di gel di silice, elutare i DNA dai frammenti di gel. Quantificare la concentrazione del DNA mediante analisi spettrofotometrica.Impostare una reazione Gibson Assembly utilizzando il cDNA amplificato e il plasmide digerito. Incubare a 50 gradi Celsius per un'ora. Quindi, utilizzare una colonna di gel di silice per purificare la reazione.Dopo aver elettroporato le cellule E.coli DH5-Alpha competenti, raccogliere diverse colonie bianche e trasferirle su mezzo liquido LB. Fai crescere le colonie durante la notte a 37 gradi Celsius. Successivamente, utilizzare un kit miniprep per purificare i plasmidi e analizzarne le dimensioni per elettroforesi in un gel di agarosio dell'uno per cento nel buffer TAE.In primo luogo, co-elettroporare il ceppo E.coli selezionato sia con il derivato pLELVd-BZB che contiene il cDNA corrispondente all'RNA di interesse che con il P15LTRNISM plasmide per co-esprimere la tRNA ligasi delle melanzane. Trasferire il mezzo liquido SOC nella cuvetta di elettroporazione per recuperare le cellule e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, placcare i batteri su un mezzo solido LB contenente 50 microgrammi per ampicillina millilitro e 34 microgrammi per cloramfenicolo millilitro.Incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, aggiungere 250 millilitri di mezzo liquido TB, contenente 50 microgrammi per ampicillina millilitro, e 34 microgrammi per millilitro cloramfenicolo, a un pallone Erlenmeyer sconcertato da un litro. Recuperate l'E.Coli incubato, quindi scegliete una colonia e inoculate il mezzo nel pallone.Incubare a 37 gradi Celsius con scuotimenti vigorosi a 180 giri/min per 12-16 ore prima di raccogliere i batteri. Versare la coltura di E.Coli raccolta in una bottiglia di centrifuga da 250 millilitri e far girare le cellule a 14.000 G per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 30 millilitri di acqua.Trasferire questa sospensione in un tubo di centrifuga e far girare di nuovo le celle utilizzando le condizioni precedenti. Scartare il supernatante e aggiungere 10 millilitri di tampone di cromatografia al pellet cellulare. Vortice per rimorsi le celle nel buffer.Aggiungere vigorosamente un volume di fenolo:cloroformio e vortice per rompere le cellule. Quindi, centrifuga a 12.000 G per 10 minuti. Recuperare la fase acquosa, aggiungere vigorosamente un volume di cloroformio e vortice.Centrifuga a 12.000 G per 10 minuti. Successivamente, filtrare la preparazione dell'RNA attraverso un filtro siringa da 45 micrometri. Purificare l'RNA usando una colonna di amina di dietile dietile etanolo collegata a un sistema di cromatografia liquida.Regolare la portata a un millilitro al minuto ed equilibrare la colonna con 10 millilitri di tampone cromatografico. Quindi, caricare il campione e lavare la colonna con 10 millilitri di tampone cromatografico. Eluire l'RNA con 20 millilitri di tampone di eluizione e raccogliere aliquote millilitre.Usando l'elettroforesi bidimensionale in gel di poliacrilammide, separare gli RNA circolari dalle loro controparti lineari. In primo luogo, preparare un gel di poliacrilammide al cinque per cento nel buffer TBE e contenente otto urea molare come delineato nel protocollo di testo. Mescolare 20 microlitri dei preparati di RNA con un volume di buffer di carico.Incubare a 95 gradi Celsius in un blocco riscaldante per 1,5 minuti, quindi raffreddare sul ghiaccio. Caricare i campioni nel gel di poliacrilammide ed eseguire l'elettroforesi nelle condizioni appropriate per la dimensione del gel. Dopo questo, macchiare il gel in 0,5 microgrammi per bromuro di etidio millilitro per 15 minuti.Lavare il gel macchiato con acqua, quindi visualizzare l'RNA sotto la luce UV. L'analisi elettroforetica di diversi plasmidi ricombinanti in cui sono inseriti diversi cDA mostrano migrazioni diverse rispetto a pLELVd-BZB. Si noti che pLELVd-BZB contiene il marcatore lacZ, che viene sostituito dal cDNA corrispondente all'RNA di interesse, quindi mentre la migrazione dipende dalle dimensioni del cDNA inserito, i plasmidi ricombinanti di solito migrano più velocemente del plasmide di controllo.La produzione dell'RNA ricombinante in colture batteriche co-elettroporate viene monitorata rompendo le cellule e analizzando l'RNA denaturando PAGE. Si possono vedere bande forti, che corrispondono a forme vuote di ELVd e ELVd chimerico, in cui sono stati inseriti diversi RNA di interesse. È interessante notare che una frazione maggiore dell'RNA ricombinante è vista come una forma circolare.La circolarità della frazione principale si osserva utilizzando una combinazione di due PAGE in condizioni di denaturazione ad alta e bassa resistenza ionica. La preparazione dell'RNA può essere ulteriormente purificata dalla cromatografia a scambio ionico. Come visto qui, l'RNA E.Coli viene efficientemente mantenuto a bassa forza ionica, e successivamente eluitato ad alta forza ionica, con la maggior parte dell'RNA raccolto in frazioni due e tre.L'RNA ricombinante può essere ulteriormente purificato all'omogeneità per elettroforesi 2D. Questo protocollo consente la facile produzione di grandi quantità di RNA ricombinante in Escherichia coli e la purificazione all'omogeneità grazie alla circolarità del prodotto finale. Ricorda che l'RNA di interesse risulta incorporato in un'impalcatura circolare di RNA derivata da una pianta viroide.Se si desidera separare entrambe le moieties, è necessario utilizzare una strategia standard, ad esempio ribozimi, DNAzymes o RNasi H.Il rendimento di questo protocollo dipende dal particolare RNA di interesse, poiché è probabile che i piccoli RNA vengano prodotti in quantità più elevate rispetto a quelle più grandi. Per espressioni su larga scala, prendi in considerazione che il tempo ottimale per raccogliere i batteri dipende da molti fattori tra cui il ceppo E.Coli, il mezzo di coltura e le condizioni di crescita. Si consiglia un saggio preliminare del corso di tempo per trovare la finestra di produzione ottimale nelle vostre particolari condizioni.Ricorda che gli RRNA ricombinanti si accumulano nelle cellule batteriche in modo transitorio e che scompaiono completamente nella fase di crescita tardiva.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Ricerca

Biochimica

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