Name: large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

이 작품은 BIO2017-83184-R 보조금과 BIO2017-91865-특급 스페인 정부의 드 많은, Innovación y 대학 (공동 자금된 페더 자금)에서 의해 지원 되었다.

1. 플라스 미드 건설
<ol><li>
PCR에 의해 (또는) 반전 녹음 방송 RNA 서식 파일에서 시작 하는 경우에, PCR에 의해 증폭 식 플라스 미드에 있도록 5' 확장명이 뇌관을 사용 하 여 관심사의 RNA에 해당 하는 cDNA. 고 충실도 DNA 중 합 효소를 사용 하 여 원치 않는 변이 방지.
	<ol>
<li>깁슨 어셈블리20식 플라스 미드에는 cDNA를 삽입 하려면 다음 5' 확장 PCR 뇌관을 추가: 앞으로, 5'-t...

<ol>
	<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Research+on+Non-Coding+Ribonucleic+Acid+(RNA).">Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA).</a> Genes. 8 (12), (2017).</li><li>Hamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+approaches+to+RNA+aptamer+design.">In silico approaches to RNA aptamer design.</a> Biochimie. 145, 8-14 (2018).</li><li>Bobbin, M. L., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)-Based+Therapeutics:+Delivering+on+the+Promise?.">RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).</li><li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+for+Mosquito+and+Mosquito-Borne+Disease+Control.">RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control.</a> Insects. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expression+and+purification+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Methods. 54 (2), 267-273 (2011).</li><li>Kikuchi, Y., Umekage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nucleic+acids+of+the+marine+bacterium+Rhodovulum+sulfidophilum+and+recombinant+RNA+production+technology+using+bacteria.">Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+RNA+technology:+the+tRNA+scaffold.">Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold.</a> Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).</li><li>Batey, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+methods+for+native+expression+and+purification+of+RNA+for+structural+studies.">Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).</li><li>El Khouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+RNA-Protein+Complexes+in+Escherichia+coli.">Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli.</a> Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).</li><li>Ponchon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+RNA-protein+complexes+in+Escherichia+coli+and+applications+to+RNA+biology.">Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology.</a> Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).</li><li>Umekage, S., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+production+and+purification+of+circular+RNA+aptamer.">In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer.</a> Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).</li><li>Dar&#242;s, J. -. A., Aragon&#233;s, V., Cordero, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viroid-derived+system+to+produce+large+amounts+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids:+small+noncoding+infectious+RNAs+with+the+remakable+ability+of+autonomous+replication.">Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication.</a> Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).</li><li>Flores, R., Hern&#225;ndez, C., Mart&#237;nez de Alba, A. E., Dar&#242;s, J. A., Di Serio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+and+viroid-host+interactions.">Viroids and viroid-host interactions.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).</li><li>Di Serio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICTV+Virus+Taxonomy+Profile:+Avsunviroidae.">ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae.</a> The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).</li><li>Nohales, M. A., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroid+RNA+redirects+host+DNA+ligase+1+to+act+as+an+RNA+ligase.">Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).</li><li>Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+chloroplastic+isoform+of+tRNA+ligase+in+the+replication+of+viroids+belonging+to+the+family+Avsunviroidae.">Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggplant+latent+viroid:+a+friendly+experimental+system+in+the+family+Avsunviroidae.">Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).</li><li>Cordero, T., Ortol&#224;, B., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+Eggplant+Latent+Viroid+RNA+Circularization+by+the+Eggplant+tRNA+Ligase+in+Escherichia+coli.">Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li><li>Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-dimensional+electrophoretic+technique+for+the+detection+of+circular+viroids+and+virusoids.">A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids.</a> Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).</li><li>Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+electrophoretic+properties+of+solubilizable+disulfide+gels.">Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels.</a> Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).</li><li>Gigu&#232;re, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+structures+of+all+members+of+the+Avsunviroidae+family.">Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family.</a> Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).</li><li>L&#243;pez-Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+initiation+sites+of+eggplant+latent+viroid+strands+map+within+distinct+motifs+in+their+in+vivo+RNA+conformations.">The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations.</a> RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).</li></ol>

ELVd 시퀀스 및 구조 요구 사항 가지 tRNA 리가 여 인식에 관련 된 연구를 하는 동안 우리 주의 원형 바이로이드의 예기치 않은 큰 축적에 비 호스트 대장균 에 두 분자의 공동 식 세균성 세포19에 양식입니다. 우리가 이해 하는 대장균 에 RNA 바이로이드의 큰 축적 아마 공동 표현 등 상대적으로 작은 매우 안정적인 RNA 분자의 결과 이었다 (333 nt), 높은 기반-결합, 원형 바...

DNA와 단백질, 대조적으로 많은 양의 RNA의 쉽게, 효율적이 고 비용 효율적인 생산을 위한 프로토콜 풍부 하지 않습니다. 그러나, 연구 및 산업 수요 또는 그들의 독특한 생물 속성1, 조사에 사용할 이러한 생체의 금액을 증가 정교한 매우 구체적인 aptamers로 그들의 사용을 포함 한 바이오 응용 프로그램 2, 치료제3또는 선택적인 농약4. 생체 외에서 전사 및 화학 합성 일반적으로 사용 됩니다 연구에서 RNA를 생산. 그러나, 이러한 방법은 제품의 대용량이 필요한 경우 중요 한 한계를 수반. 논리적 대안 살아있는 세포, 세포 동료 로부터 관심의 RNAs를 분리 하는 정화 과정 뒤의 내 인 성 전사 기계를 사용 하는 것입니다. 이 전략에 따라 방법은 실험실-친화 등의 세균성 세포에서 재조합 RNAs를 생산 하기 위해 개발 되었다 대장균5 나는 해양 보라색 광합성 알파-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. 세균에 재조합 RNA를 생성 하는 대부분의 메서드와 tRNA 또는 관심의 RNA가는 rRNA 삽입7같은 네이티브 매우 안정적인 RNA 발판의 표현에 의존. 이 여분의 RNA의 존재는8다운스트림 응용 프로그램 대 한 문제 경우 공상 분자에서 관심의 RNA를 공개의 필요성을 부과 한다. 재조합 RNA 생명 공학의 또 다른 개념은 재조합 ribonucleoprotein 단지는 원하는 제품 당 있을 수 있습니다 또는 보호 전략으로 관심9, RNA의 안정성을 증가 하는 데 사용의 생산 10. 마찬가지로, 원형 RNAs의 생산 또한 더 안정적인 제품11을 생성 하는 전략으로 제안 되었습니다.
우리는 최근 많은 양의 3 위의 개념에 참여 하는 대장균 에서 재조합 RNA 생성 하는 새로운 방법을 개발: 매우 안정적인 원형 RNA 비 계에 대 한 관심의 RNA와의 공동 식의 삽입은 박테리아의 놀라운 금액에 축적 가능성이 복잡 한 안정 되어 있는 ribonucleoprotein를 생산 하는 상호 작용 단백질으로 재조합 RNA 세포12. 이전 개발, 달리 완전히 외계인 대장균, 즉 바이로이드 RNA 발판을 사용 했습니다. Viroids는 매우 특별 한 종류 (246-401 nt) 상대적으로 작은 의해 독점적으로 구성 되는 더 높은 식물의 전염 성 요원의 높은 베이스 결합 원형 RNA13. 흥미롭게도, viroids는 비 코딩 RNAs 그리고, 그들의 자신의 단백질에서 도움 없이, 그들은 감염 된 호스트14에서 복잡 한 감염 주기를 완료 수 있습니다. 이러한 사이클 핵 또는 엽록체, 바이로이드 가족에 따라 RNA RNA 복제 포함-Pospiviroidae 또는 Avsunviroidae각각-감염 된 식물 및 호스트 방어 반응의 회피를 통해 이동. Viroids는 자연, 누드 원형 RNA 되 고 감염 된 식물 세포의 적대 하는 환경에서 생존 하는 것 때문에 가장 안정적인 RNAs 중 평가 해야 합니다. 이 속성 viroids 건설 기계 바이오 접근에 재조합 RNA 안정화에 특히 적합 한 만들 수 있습니다. 또한, 새로운 메서드는 상호 작용 식물 단백질 바이로이드 발판의 공동 식 기반으로 합니다. Viroids는 호스트에 효소 촉매 과정의 다른 단계를 모집 롤링 원 메커니즘을 통해 복제 합니다. 특히 일부 viroids, 좀 더 구체적으로 그 가족 Avsunviroidae15에 속하는 ribozymes 또한 복제에 관련 된 포함 되어 있습니다. 바이로이드 종에 따라 바이로이드 RNAs의 전사는 RNA 중 합 효소 II 호스트나는 chloroplastic 인코딩 핵 RNA 중 합 효소 (NEP)에 의해 중재 됩니다. 바이로이드 RNA 처리 호스트에 의해 촉매 될 것 유형 III RNase, 비록 ribozymes oligomeric RNA와 viroids에서 중간체는 자기 복제 하는 동안 다니엘. 마지막으로, 결과 바이로이드 단위체는 circularized, 바이로이드 가족에 따라 호스트 DNA 리가 1 또는 tRNA 리가16,17의 chloroplastic isoform에 의해. 이 마지막 효소 가지 잠재 바이로이드 (ELVd)18등 가족 Avsunviroidae, viroids의 단위체 형태의 결 찰에 포함 된다.
가지 (지속의 총칭 melongena L.)에 의해 인정을 결정 하는 ELVd의 순서 및 구조 요구를 분석 하는 작업 과정에서 tRNA 리가 우리 대장균 에 두 분자의 공동 식에 따라 실험 시스템 설정 19. 우리 것으로 나타났습니다 그 단위 보다 더 긴 ELVd 증명서 자체 쪼개 효율적으로 임베디드 귀상어 ribozymes 통해 대장균 세포에 결과 바이로이드 단위체와 5'-수 산 기 2', 3'-phosphodiester 테르미니 했다 효율적으로 공동 표현된 가지 tRNA 리가 여 circularized. 더욱, 결과 원형 바이로이드의 RNA 생 rRNAs12의 초과 대장균에서 예기치 않은 높은 농도 도달. 복제 중간체의 부재가 세균 세포에서 ELVd RNA RNA 증폭의 부족을 표시. 흥미롭게도, 바이로이드 분자의 특정 위치에 분리 RNAs의 삽입 원형 바이로이드 파생 RNAs12의 축적에 온건한 영향을 미쳤다. 이러한 관측 우리가 많은 양의 재조합 박테리아에 RNAs 생산 하는 방법을 구상 했다. 이 방법에서는, cDNAs의 RNAs에 해당 ELVd cDNA에 삽입 하 고 결과 공상 RNA 강한 제정 발기인 통해 대장균 에서 표현 된다. 시스템 작동에 대 한 대장균 공동 가지 tRNA 리가 표현 하는 플라스 미드와 변형 될 해야 합니다. ELVd에서 파생 된 단위 보다 더 이상 사본 포함된 귀상어 ribozymes에 의해 처리 되 고 적절 한 테르미니와 결과 단위체는 인식 하 고 공동 표현된 tRNA 리가 여 circularized. 이러한 방법으로, 관심의 RNA 바이로이드 원형 분자의 구성 된 매우 안정적인 원형 발판에 삽입 됩니다. 이 재조합 공상 RNA는 대부분의 아마 더 tRNA 리가와 상호 작용을 통해 복잡 한 ribonucleoprotein의 형성에 의해 대장균 세포 안으로 안정. 이 메서드를 사용 하 여 (프로토콜 아래 참조), RNA aptamers, 헤어핀 RNAs 및 다른 구조화 된 RNAs 쉽게 일반 실험실 조건에서 대장균 문화의 리터 당 밀리 그램의 10의 금액에서 생산 되었고 복용 동질성을 정화 원형12의 장점입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bpi I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010</td>
			<td>D1 low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131008.1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>Ba2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>48045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>X1402.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131785.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucloSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>22740588.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69387-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115(DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref. Timmons et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C 0113.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1211</td>
			<td>87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131509.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122333.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131020.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>FE04791000</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3691,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap DEAE Sepharose FF column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5055-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTAprime plus liquid chromatography system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>11001313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamyde</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1089,1000</td>
			<td>2K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>146392.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2940,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0937,2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Bis(acryloyl)cystamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4929-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli

RNA 생물학과 정교한 바이오 응용 프로그램에서 RNA 분자의 사용에 대 한 관심 증가, 재조합 RNAs의 다량을 생성 하는 방법을 제한 됩니다. 우리가 많은 양의 바이로이드 비 계 및 식물에 대 한 관심의 RNA를 포함 하는 공상 분자의 공동 식에 따라 대장균 에서 재조합 RNA 생성 하는 프로토콜을 설명 하는 여기, tRNA 리가. Viroids는 상대적으로 작은, 비 코딩, 높은 베이스 결합 원형 RNAs 더 높은 식물에 전염성이 있다. 호스트 공장 tRNA 리가 중재 바이로이드 복제 동안 RNA circularization Avsunviroidae, 가지 잠재 바이로이드 (ELVd), 같은 가족에 속하는 viroids에 의해 보충 하는 효소 이다. 비록 ELVd 대장균에 복제 하지 않습니다, ELVd 전조 대장균 RNA 중 합 효소에 의해 복사할 효율적 이며 임베디드 귀상어 ribozymes 세균성 세포에 의해 처리 결과 단위체에 의해 circularized는 공동 표현된 tRNA 리가 놀라운 농도 도달입니다. ELVd 비 계에의 한 RNA의 삽입 당 세균성 문화 일반 실험실 조건에서의 재조합 RNA의 밀리 그램 수만의 생산 수 있습니다. RNA 제품의 주요 일부분 이다 원형, 가상 동질성을 재조합 RNA의 정화를 용이 하 게 하는 기능. 이 프로토콜에는 보완 DNA (cDNA)에 해당 하는 관심의 RNA는 사용 되는, 공동 가지 tRNA 리가 표현 하는 플라스 미드 따라 대장균을 변환 하는 식 플라스 미드에 ELVd cDNA의 특정 위치에 삽입 됩니다. 강력한 제정 발기인의 통제 아래 두 분자의 공동 식 대량의 재조합 RNA의 생산 리드. 재조합 RNA 세균 세포에서 추출 하 고 세균성 RNAs의 순환 활용의 대부분에서 분리 수 있습니다.

ELVd 파생 시스템12을 사용 하 여 대장균 에서 재조합 RNA를 생성 하려면 관심의 RNA는 ELVd RNA 비 계에 투입 이다. 이 공상 RNA 가지 tRNA 리가 대장균에 따라 공동 표현 이다. 일단 처리 하 고 죽 습 circularized에서 관심의 RNA 돌출, 공상 원형 RNA 가능성이 세균 세포 ( 에 있는 현저한 농도 도달 공동 표현된 가지 효소와 복잡 한 ribonucleop...

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Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

대장균 에서 바이로이드 파생 시스템을 사용 하 여 원형 발판에 재조합 RNAs의 대규모 생산

여기, 선물이 공동 표현 공상 RNA 바이로이드 비 계 및 식물에 대 한 관심의 RNA를 포함 하 여 많은 양의 대장균 에서 재조합 RNA 생성 하는 프로토콜 tRNA 리가. 주요 제품은 동질성을 정화를 용이 하 게 원형 분자 이다.

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

이 방법은 연구 또는 산업에서 응용 프로그램에 대한 관심의 재조합 RNA의 큰 금액을 생산하는 데 도움이 될 수 있습니다. 가장 큰 장점은 재조합 RNA가 쉽게 확장될 수 있는 저렴한 공정에서 대장균에서 생산된다는 것입니다. 중요한 것은, RNA는 동질성에 대한 정제를 용이하게 하는 원형 RNA 비계에서 생산된다.DNA 또는 단백질과는 대조적으로, 관심있는 RNA는 쉽게 생체 공장 시스템, 이러한 대장균 배양에서 다량에서 생산되지 않습니다. 우리의 방법은 매우 안정적인 원형 비계에 삽입된 관심의 RNA의 공동 발현을 기반으로 하고 RNA 순환화를 중재하는 리구아제를 적용한다. 원형 RNA 스캐폴드는 특허받은 비로이드로부터 유래한다.Viroids는 상대적으로 작은, 비 코일, 일부 높은 식물에 전염 하는 높은 기본 페어링 원형 RNA. 우리는 일반 실험실 조건에서 세균 배양리터 당 재조합 RNA의 수십 밀리그램을 생산할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PCR로 cDNA를 증폭합니다.다음으로, 플라스미드 pLELVd-BZB의 100 나노그램을 0.5 밀리리터 튜브에 추가합니다. 타입 IIS 제한 효소 BpiI의 10 U를 추가하고 20 마이크로 리터 반응을 만들기 위하여 완충 G의 충분한. 플라스미드를 소화하기 위해 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.그 후, 전기전구에 의한 PCR 및 소화 제품을 TAE 완충제에서 1% 아가로즈 젤로 분리한다. 밀리리터당 0.5 마이크로그램의 농도로 200 밀리리터 에티듐 브로마이드에서 젤을 흔들어 서 젤을 얼룩지게 합니다. UV 트랜틸루미네이터를 사용하여 DNA를 시각화합니다.메스를 사용하여 증폭된 cDNA 및 BpiI 소화 플라스미드에 해당하는 밴드를 잘라냅니다. 실리카 젤 컬럼을 사용하여 젤 조각에서 DNA를 엘테합니다. 분광측정 분석을 통해 DNA의 농도를 정량화한다.증폭된 cDNA와 소화된 플라스미드를 사용하여 깁슨 어셈블리 반응을 설정합니다. 1 시간 동안 섭씨 50도에서 배양하십시오. 그런 다음 실리카 젤 컬럼을 사용하여 반응을 정화합니다.유능한 E.coli DH5-알파 세포를 전기화 한 후 여러 개의 흰색 식민지를 선택하고 액체 LB 배지로 옮기습니다. 하룻밤 사이에 식민지를 섭씨 37도에서 키우겠습니다. 다음으로, 미니프렙 키트를 사용하여 플라스미드를 정화하고, TAE 버퍼의 1% 아가로즈 젤로 전기전도로 크기를 분석합니다.첫째, 선택된 대장균 균주를 관심의 RNA및 플라스미드 P15LTRNISM에 대응하는 cDNA를 포함하는 pLELVd-BZB 유도체를 모두 사용하여 원간 tRNA 리구아제를 공동 발현한다. SOC 액체 배지를 전기기큐벳으로 이송하여 세포를 회수하고, 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양한다. 그런 다음, 밀리리터 암피실린 당 50 마이크로그램, 밀리리터 클로람페니콜 당 34 마이크로그램을 함유한 LB 고체 배지에 박테리아를 플레이트.하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 배양하십시오. 다음 날, 액체 결핵 매체의 250 밀리리터를 추가, 포함 50 밀리리터 암피실린 당 마이크로 그램, 그리고 34 밀리리터 클로람페니콜 당 마이크로 그램, 한 리터 당황 에를렌 마이어 플라스크에. 배양 된 대장균을 검색 한 다음 식민지를 선택하고 플라스크에서 매체를 접종하십시오.박테리아를 수확하기 전에 180 RPM에서 180 RPM에서 활발한 흔들림으로 섭씨 37도에서 배양하십시오. 수확한 E.Coli 배양을 250밀리리터 원심분리기 병에 붓고 14, 000 G에서 10분간 세포를 회전시합니다. 상체를 버리고 30 밀리리터의 물에 세포를 다시 중단하십시오.이 현탁액을 원심분리기 튜브로 옮기고 이전 조건을 사용하여 세포를 다시 회전시합니다. 상체를 버리고 세포 펠릿에 크로마토그래피 버퍼 10 밀리리터를 추가합니다. 소용돌이버퍼의 셀을 다시 일시 중단합니다.페놀의 부피를 1부더라: 클로로폼과 소용돌이를 적극적으로 추가하여 세포를 깨뜨린다. 그런 다음 12, 000 G에서 원심분리기를 10분 동안 사용할 수 있습니다. 수성 상회복, 클로로폼 1부, 소용돌이를 적극적으로 추가한다.12, 000 G의 원심분리기는 10분 동안. 그 후, 45마이크로미터 주사기 필터를 통해 RNA 제제를 필터링한다. 액체 크로마토그래피 시스템에 연결된 1밀리리터 디틸 에탄올 아민 컬럼을 사용하여 RNA를 정화합니다.유량을 분당 1밀리리터로 조정하고 크로마토그래피 버퍼 10밀리리터로 컬럼을 상형화합니다. 그런 다음 샘플을 로드하고 크로마토그래피 버퍼 10 밀리리터로 컬럼을 세척합니다. 용출 완충제의 20 밀리리터로 RNA를 엘테우고, 1밀리리터 알리쿼트를 수집합니다.2차원 폴리아크릴아미드 젤 전기포레시스를 사용하여 원형 RNA를 선형 과대 분리합니다. 먼저 TBE 버퍼에서 5% 폴리아크릴아미드 젤을 준비하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 8개의 어금니 우레아를 함유한다. RNA 제제의 마이크로리터 20개를 한 부적버퍼로 혼합합니다.난방 블록에서 섭씨 95도에서 1.5분 동안 배양한 다음 얼음위를 식힙니다. 폴리아크릴아미드 젤에 샘플을 적재하고 겔 치수에 적합한 조건에서 전기포고를 실행한다. 그 후, 젤을 밀리리터 에티듐 브로마이드당 0.5 마이크로그램으로 15분간 염색합니다.스테인드 젤을 물로 씻은 다음 UV 빛 아래에서 RNA를 시각화합니다. 다른 cDN이 삽입되는 여러 재조합 플라스미드의 전기 전광 분석은 pLELVd-BZB에 비해 다른 마이그레이션을 보여줍니다. pLELVd-BZB는 관심있는 RNA에 대응하는 cDNA로 대체되는 lacZ 마커를 포함하므로 마이그레이션은 삽입 된 cDNA의 크기에 따라 다르지만 재조합 플라스미드는 일반적으로 제어 플라스미드보다 빠르게 마이그레이션됩니다.공동 전극성 세균 배양에서 재조합 RNA의 생산은 세포를 파괴하고 PAGE를 분해하여 RNA를 분석함으로써 모니터링된다. 관심있는 다른 RNA가 삽입 된 빈 ELVd 및 키메라 ELVd 형태에 해당하는 강력한 밴드를 볼 수 있습니다. 흥미롭게도, 재조합 RNA의 주요 분수는 원형 형태로 볼 수 있습니다.주요 분획의 원형은 높고 낮은 이온 강도에서 데마포링 조건하에서 두 개의 PAGEs의 조합을 사용하여 관찰된다. RNA 제제는 애니온 교환 크로마토그래피에 의해 더욱 정제될 수 있다. 여기에서 볼 수 있듯이, 대장균 RNA는 낮은 이온 강도에서 효율적으로 유지되고, 그 후에 높은 이온 강도에서 용출되고, RNA의 대부분은 분수 2 및 3에서 집합되는.재조합 RNA는 2-D 전기포진에 의해 균질성으로 더 정제될 수 있다. 이 프로토콜을 통해 대장균에서 다량의 재조합 RNA를 쉽게 생산하고 최종 제품의 순환성 덕분에 균일성으로 정제할 수 있습니다. 식물 viroid에서 파생 된 원형 RNA 스캐폴드에 내장 된 관심 결과의 RNA를 기억하십시오.두 moieties를 분리하려는 경우, 작은 RNA가 더 큰 것보다 더 높은 양으로 생산될 가능성이 높기 때문에 리보지메, DNAzymes 또는 RNase H.와 같은 표준 전략을 사용해야 합니다. 더 큰 규모의 표현의 경우, 박테리아를 수확하는 최적의 시간은 E.Coli 균주, 배양 배지 및 성장하는 조건을 포함한 많은 요인에 달려 있다는 것을 고려하십시오. 특정 조건에서 최적의 생산 창을 찾기 위해 예비 시간 과정 분석방법을 권장합니다.재조합 RNA는 일시적으로 세균 세포에 축적되고, 그(것)들은 완전히 늦게 성장하는 단계에서 사라다는 것을 기억하십시오.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

에서 외부 막 소포 내에서 감독 단백질 포장<em&gt; 대장균</em&gt; : 디자인, 생산 및 정제

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

연구

생화학

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

풍부 하 고 대장균 에서 전송 RNAs의 레벨 충전의 정량화

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

사이트 감독 Mutagenesis에 대 한 생체 외에서 그리고 Vivo 실험 대장균 RNA 상호 Exemplified에서

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

원형 RNA를 분석하기 위해 미니유전자를 포함하는 Alu 요소 사용

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

지질 혼합 애신을 위한 리포솜으로 재조합 초파리 아틀라스틴의 세제 지원 재구성

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

에체리치아 대장균의 유전코드 확장을 이용한 뉴클레오소성 재구성을 위한 히스톤의 특정 리신 아세틸화

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...