Name: large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd BIO2017-83184-R og BIO2017-91865-EXP fra den spanske Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (co finansiert ble tildelt und fond).

1. plasmider konstruksjon
<ol><li>
Forsterke av PCR (eller omvendt transkripsjon PCR hvis starter fra en RNA mal) cDNA tilsvarer RNA rundt med primere med 5' forlengelsen for å tillate forsamlingen uttrykk plasmider. For å unngå uønskede mutasjoner, bruk en høy-troskapen DNA polymerase.
	<ol>
<li>Sette på cDNA i uttrykket plasmider av Gibson montering20, legge følgende 5' filtyper til PCR primere: fremover, 5-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; omvendt,...

<ol>
	<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Research+on+Non-Coding+Ribonucleic+Acid+(RNA).">Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA).</a> Genes. 8 (12), (2017).</li><li>Hamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+approaches+to+RNA+aptamer+design.">In silico approaches to RNA aptamer design.</a> Biochimie. 145, 8-14 (2018).</li><li>Bobbin, M. L., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)-Based+Therapeutics:+Delivering+on+the+Promise?.">RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).</li><li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+for+Mosquito+and+Mosquito-Borne+Disease+Control.">RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control.</a> Insects. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expression+and+purification+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Methods. 54 (2), 267-273 (2011).</li><li>Kikuchi, Y., Umekage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nucleic+acids+of+the+marine+bacterium+Rhodovulum+sulfidophilum+and+recombinant+RNA+production+technology+using+bacteria.">Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+RNA+technology:+the+tRNA+scaffold.">Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold.</a> Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).</li><li>Batey, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+methods+for+native+expression+and+purification+of+RNA+for+structural+studies.">Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).</li><li>El Khouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+RNA-Protein+Complexes+in+Escherichia+coli.">Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli.</a> Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).</li><li>Ponchon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+RNA-protein+complexes+in+Escherichia+coli+and+applications+to+RNA+biology.">Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology.</a> Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).</li><li>Umekage, S., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+production+and+purification+of+circular+RNA+aptamer.">In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer.</a> Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).</li><li>Dar&#242;s, J. -. A., Aragon&#233;s, V., Cordero, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viroid-derived+system+to+produce+large+amounts+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids:+small+noncoding+infectious+RNAs+with+the+remakable+ability+of+autonomous+replication.">Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication.</a> Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).</li><li>Flores, R., Hern&#225;ndez, C., Mart&#237;nez de Alba, A. E., Dar&#242;s, J. A., Di Serio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+and+viroid-host+interactions.">Viroids and viroid-host interactions.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).</li><li>Di Serio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICTV+Virus+Taxonomy+Profile:+Avsunviroidae.">ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae.</a> The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).</li><li>Nohales, M. A., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroid+RNA+redirects+host+DNA+ligase+1+to+act+as+an+RNA+ligase.">Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).</li><li>Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+chloroplastic+isoform+of+tRNA+ligase+in+the+replication+of+viroids+belonging+to+the+family+Avsunviroidae.">Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggplant+latent+viroid:+a+friendly+experimental+system+in+the+family+Avsunviroidae.">Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).</li><li>Cordero, T., Ortol&#224;, B., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+Eggplant+Latent+Viroid+RNA+Circularization+by+the+Eggplant+tRNA+Ligase+in+Escherichia+coli.">Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li><li>Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-dimensional+electrophoretic+technique+for+the+detection+of+circular+viroids+and+virusoids.">A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids.</a> Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).</li><li>Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+electrophoretic+properties+of+solubilizable+disulfide+gels.">Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels.</a> Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).</li><li>Gigu&#232;re, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+structures+of+all+members+of+the+Avsunviroidae+family.">Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family.</a> Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).</li><li>L&#243;pez-Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+initiation+sites+of+eggplant+latent+viroid+strands+map+within+distinct+motifs+in+their+in+vivo+RNA+conformations.">The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations.</a> RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).</li></ol>

Mens forskning ELVd sekvensen og struktur krav involvert i erkjennelsen av aubergine tRNA ligase, la vi merke til at co uttrykk for både molekyler i ikke-vert E. coli førte til en uventede store opphopning av viroid runde skjemaer i bakterieceller19. Vi forsto at store akkumulering av viroid RNA i E. coli sannsynligvis var konsekvensen av co uttrykke en svært stabile RNA molekylet, som den relativt liten (333 nt), svært basert-sammenkoblet, sirkulære viroid og et protein som...

I motsetning til DNA og proteiner er protokoller for enkel, effektiv og kostnadseffektiv produksjon av store mengder RNA ikke rikelig. Men sofistikert forskning og industri etterspørsel økende mengder av disse biomolecules å undersøke deres unike biologiske egenskaper1, eller å være ansatt i bioteknologisk programmer, inkludert deres bruk som svært spesifikke aptamers 2, terapeutiske agenter3eller Selektiv plantevernmidler4. In vitro transkripsjon og syntese er vanlig i forskning for å produsere RNA. Men innebærer metodene viktige begrensninger når store mengder av produkter. Den logiske alternativet er å bruke endogene transkripsjon maskiner av levende celler, etterfulgt av en renselsesprosess skille RNAs rundt fra mobilnettet følgesvenner. Etter denne strategien, metoder har blitt utviklet til å produsere rekombinant RNAs i bakterielle celler, for eksempel lab-vennlig Escherichia coli5 eller den marine lilla phototrophic alpha-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. de fleste metoder for å produsere rekombinant RNA i bakterier stole på uttrykket av en innfødt svært stabile RNA skafottet, som en tRNA eller en rRNA, der RNA rundt er satt7. Dette medfører nødvendigheten av å slippe RNA rundt av chimeric molekylet, hvis ekstra RNA er et problem for nedstrøms programmer8. En annen begrep i rekombinant RNA bioteknologi er produksjonen av rekombinant ribonucleoprotein komplekser som kan være det ønskede produktet sådan eller brukes som en beskyttende strategi for å øke stabiliteten av RNA interesse9, 10. Tilsvarende har produksjon av sirkulære RNAs også blitt foreslått som en strategi for å generere mer stabil produkter11.
Vi har nylig utviklet en ny metode for å produsere store mengder rekombinant RNA i E. coli som deltar i tre av de ovennevnte begrepene: innsetting av RNA rundt i en svært stabile sirkulær RNA stillaset og co uttrykk for den rekombinant RNA med et samspill protein til trolig produsere en stabil ribonucleoprotein kompleks som akkumuleres i bemerkelsesverdig mengder i bakterielle celler12. I motsetning til tidligere utviklingen brukte vi en RNA stillaset helt fremmed for E. coli, nemlig en viroid. Viroids er en meget spesiell type smittestoffer høyere planter som er utelukkende konstituert av en relativt liten (246-401 nt) svært base-sammenkoblet sirkulær RNA13. Interessant, viroids er ikke-koding RNAs, og uten hjelp fra sine egne proteiner, de er kjøpedyktig fullstendig komplekse smittsomme sykluser i den infiserte verter14. Disse syklusene ta RNA-til-RNA replikering i kjerner eller chloroplasts, avhengig av viroid familien,Pospiviroidae eller Avsunviroidae, henholdsvis-bevegelse gjennom infiserte anlegget og unndragelse av verten defensive svaret. Viroids må være rangert blant de mest stabile RNAs i naturen, som følge av å være en naken sirkulær RNA og måtte overleve i det fiendtlige miljøet av anlegget infiserte celler. Denne egenskapen kan gjøre viroids spesielt egnet som stillaser å stabilisere rekombinant RNA i bioteknologisk tilnærminger. I tillegg er den nye metoden basert på co uttrykk for viroid stillaset med et samspill planteprotein. Viroids replikere gjennom en rullende sirkel mekanisme i som vert enzymer er rekruttert til å katalysere de ulike trinnene i prosessen. Spesielt noen viroids, mer spesifikt de som tilhører familien Avsunviroidae15, inneholder ribozymes som er også involvert i replikering. Avhengig av den viroid arten, er transkripsjon av viroid RNAs formidlet av verten RNA polymerase II eller den chloroplastic kjernefysiske-kodet RNA polymerase (NEP). Viroid RNA behandling synes å være katalysert av en vert type-III RNase, selv om i viroids med ribozymes oligomeric RNA mellomprodukter selv cleave under replikering. Til slutt, de resulterende viroid monomerer er circularized, avhengig av viroid familien, vert DNA ligase 1 eller chloroplastic isoformen av tRNA ligase16,17. Dette siste enzymet er involvert i ligation av de monomerisk viroids i familien Avsunviroidae, som aubergine latente viroid (ELVd)18.
På en jobb å analysere sekvensen og strukturelle kravene til ELVd som bestemmer anerkjennelse av aubergine (Solanum melongena L.) tRNA ligase, vi satt opp en eksperimentell system basert på co uttrykk for både molekyler i E. coli 19. vi merke til at lengre enn enheten ELVd transkripsjoner selv cleave effektivt i E. coli celler gjennom den innebygde hammerhead ribozymes og at de resulterende viroid monomerer med 5'-hydroksyl og 2, 3-phosphodiester termini var effektivt circularized av co uttrykt aubergine tRNA ligase. Enda mer, nådd den resulterende sirkulære viroid RNA et uventet høy konsentrasjon i E. coli, overstiger de av endogene rRNAs12. Fravær av replikering mellomprodukter indikerte mangel ELVd RNA-til-RNA forsterkning i disse bakterielle celler. Interessant, hadde innsetting av heterologous RNAs i en bestemt plassering av viroid molekyl en moderat effekt på akkumulering av sirkulære viroid-avledet RNAs12. Disse observasjonene gjort oss forestille en metode for å produsere store mengder av rekombinant RNAs i bakterier. I denne metoden cDNAs tilsvarer RNAs rundt settes inn i ELVd-cDNA og den resulterende chimeric RNA uttrykkes i E. coli gjennom en sterk konstituerende promoter. For at systemet skal fungere, må E. coli co forvandles med en plasmider å uttrykke den aubergine tRNA ligase. ELVd-avledet lengre enn enheten transkripsjon behandles av innebygde hammerhead ribozymes og de resulterende monomerer med de aktuelle termini gjenkjennes og circularized av co uttrykt tRNA ligase. På denne måten settes RNA rundt inn i en meget stabil sirkulær stillaset bestående av viroid sirkulær molekylet. Denne rekombinant chimeric RNA er trolig ytterligere stabiliseres i de E. coli cellene ved dannelsen av en ribonucleoprotein komplekse gjennom samspill med tRNA ligase. Denne metoden (se protokollen nedenfor), RNA aptamers, hårnål RNAs og andre strukturert RNAs er lett produsert i mengder titalls milligram per liter av E. coli kultur i vanlig laboratorium og renset til homogenitet tar Utnytt sirkularitet12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bpi I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010</td>
			<td>D1 low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131008.1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>Ba2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>48045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>X1402.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131785.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucloSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>22740588.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69387-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115(DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref. Timmons et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C 0113.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1211</td>
			<td>87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131509.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122333.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131020.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>FE04791000</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3691,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap DEAE Sepharose FF column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5055-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTAprime plus liquid chromatography system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>11001313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamyde</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1089,1000</td>
			<td>2K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>146392.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2940,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0937,2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Bis(acryloyl)cystamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4929-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli

Med økende interesse RNA biologi og bruk av RNA molekyler i avanserte bioteknologisk programmer, er metoder for å produsere store mengder av rekombinant RNAs begrenset. Her beskriver vi en protokoll for å produsere store mengder rekombinant RNA i Escherichia coli basert på co uttrykk for et chimeric molekyl som inneholder RNA av interesse i en viroid stillaset og en plante tRNA ligase. Viroids er relativt liten, ikke-koding, svært base-sammenkoblet sirkulære RNAs som er smittsom for høyere planter. Verten plante tRNA ligase er et enzym rekruttert av viroids som tilhører familien Avsunviroidae, som aubergine latente viroid (ELVd), for å megle RNA circularization under viroid replikering. Selv om ELVd replikerer ikke i E. coli, en ELVd forløper er effektivt transkribert av E. coli RNA polymerase og behandlet av den innebygde hammerhead ribozymes i bakterielle celler, og de resulterende monomerer er circularized av den co uttrykt tRNA ligase nådde en bemerkelsesverdig konsentrasjon. Innsetting av en rundt ELVd stillaset kan titalls milligram rekombinant RNA per liter bakteriell kultur i vanlig laboratorium. En viktigste brøkdel av RNA produktet er rund, en funksjon som forenkler rensing av rekombinant RNA til virtuelle homogenitet. I denne protokollen settes et komplementære DNA (cDNA) svarer til RNA rundt i en bestemt plassering av ELVd cDNA i et uttrykk plasmider som brukes, langs plasmider co uttrykke aubergine tRNA ligase, for å transformere E. coli. Co uttrykk for både molekyler under kontroll av sterke konstituerende arrangører fører til produksjon av store mengder av rekombinant RNA. Den rekombinante RNA kan utdraget fra bakterieceller og atskilt fra hoveddelen av bakteriell RNAs utnytter circularity sin.

For å produsere rekombinant RNA i E. coli bruker ELVd-avledet systemet12, podet RNA rundt inn i en ELVd RNA stillaset. Denne chimeric RNA er co uttrykt langs den aubergine tRNA ligase i E. coli. Når behandlet, kløyvde og circularized, danner chimeric sirkulær RNA, som RNA rundt stikker sannsynlig en ribonucleoprotein kompleks med co uttrykt aubergine enzymet som bemerkelsesverdig konsentrasjon i bakterieceller ( Figur 1</s...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Storskalaproduksjon av rekombinant RNAs på en sirkulær stillaset med en Viroid-avledet System i Escherichia coli

Her presenterer vi en protokoll for å produsere store mengder rekombinant RNA i Escherichia coli ved co uttrykker en chimeric RNA som inneholder RNA av interesse i en viroid stillaset og en plante tRNA ligase. Hovedproduktet er en sirkulær molekyl som forenkler rensing å homogenitet.

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Denne metoden kan bidra til å produsere store mengder rekombinante RNAer av interesse for anvendelse i forskning eller industri. Den største fordelen er at rekombinant RNA produseres i Escherichia coli i en billig prosess som lett kan skaleres opp. Viktigere, RNA er produsert på et sirkulært RNA stillas, noe som letter rensing til homogenitet.I motsetning til DNA eller proteiner, er RNAs av interesse ikke lett produsert i store mengder i biofaktoriske systemer, for eksempel en Escherichia coli kultur. Vår metode er basert på co-uttrykk for RNA av interesse satt inn i en svært stabil sirkulær stillas og bruke en ligase som formidler RNA sirkulærisering. Det sirkulære RNA-stillaset stammer fra et patentert viroid.Viroider er relativt små, ikke-kveilet, svært base-paret sirkulære RNAs som er smittsomme for noen høyere planter. Vi kan produsere titalls milligram av rekombinant RNA per liter bakteriell kultur under vanlige laboratorieforhold. For å starte denne prosedyren, forsterke cDNA av PCR som beskrevet i tekstprotokollen.Deretter legger du til 100 nanogram av plasmid pLELVd-BZB til et 0,5 milliliter rør. Legg til 10 U av typen IIS-begrensningsenzym BpiI og nok buffer G til å skape en 20 mikrolitersreaksjon. Inkuber ved 37 grader Celsius i en time for å fordøye plasmid.Etter dette, skille PCR og fordøyelsesprodukter ved elektroforese i en en prosent agarose gel i TAE buffer. Flekk gelen ved å riste den i 200 milliliter ethidiumbromid i en konsentrasjon på 0,5 mikrogram per milliliter. Ved hjelp av en UV-transilluminator, visualiser DNA.Bruk en skalpell til å kutte ut båndene som tilsvarer den forsterkede CDNA og BpiI fordøyd plasmid. Bruk silikagelsøyler til å elute DnAene fra gelfragmentene. Kvantifisere konsentrasjonen av DNA ved spektrofotometrisk analyse.Sett opp en Gibson Assembly reaksjon ved hjelp av forsterket cDNA og fordøyd plasmid. Inkuber ved 50 grader Celsius i en time. Deretter bruker du en silikagelkolonne for å rense reaksjonen.Etter elektroporating kompetente E.coli DH5-Alpha Celler, plukke flere hvite kolonier og overføre dem til flytende LB medium. Vokse koloniene over natten på 37 grader Celsius. Deretter bruker du et miniprep-sett til å rense plasmidene, og analysere størrelsene ved elektroforese i en en prosent agarosegel i TAE-buffer.Først co-elektroporate den valgte E.coli belastning med både pLELVd-BZB derivat som inneholder cDNA tilsvarende RNA av interesse og plasmid P15LTRNISM å co-uttrykke aubergine tRNA ligase. Overfør SOC flytende medium inn i elektroporasjon cuvette å gjenopprette cellene, og inkubere ved 37 grader Celsius i en time. Deretter, plate bakteriene på LB solid medium som inneholder 50 mikrogram per milliliter ampicillin, og 34 mikrogram per milliliter kloramfenikol.Inkuber ved 37 grader Celsius over natten. Neste dag, tilsett 250 milliliter flytende TB medium, som inneholder 50 mikrogram per milliliter ampicillin, og 34 mikrogram per milliliter kloramfenikol, til en en liter forvirret Erlenmeyer kolbe. Hent den inkuberte E.Coli, og velg deretter en koloni og inokuler mediet i kolben.Inkuber ved 37 grader Celsius med kraftig risting ved 180 RPM i 12 til 16 timer før høsting av bakteriene. Hell den høstede E.Coli-kulturen i en 250 milliliter sentrifugeflaske og spinn ned cellene ved 14.000 G i 10 minutter. Kast de overnaturante og gjenoppusse cellene i 30 milliliter vann.Overfør denne suspensjonen til et sentrifugerør, og spinn ned cellene igjen ved hjelp av de tidligere forholdene. Kast supernatant og tilsett 10 milliliter kromatografibuffer til cellepellet. Vortex å gjenbruke cellene i bufferen.Tilsett ett volum fenol:kloroform og vortex kraftig for å bryte cellene. Deretter sentrifuge på 12,000 G i 10 minutter. Gjenopprett vandig fase, legg til ett volum kloroform og vortex kraftig.Sentrifuge ved 12.000 G i 10 minutter. Deretter filtrerer du RNA-preparatet gjennom et 45 mikrometersprøytefilter. Rens RNA ved hjelp av en en milliliter dietylamenanolaminkolonne koblet til et flytende kromatografisystem.Juster strømningshastigheten til én milliliter per minutt, og likevekt til kolonnen med 10 milliliter kromatografibuffer. Deretter laster du prøven og vasker kolonnen med 10 milliliter kromatografibuffer. Elute RNA med 20 milliliter elution buffer, og samle en milliliter aliquots.Ved hjelp av todimensjonal polyakrylamid gel elektroforese, skille sirkulære RNA fra sine lineære kolleger. Først forberede en fem prosent polyakrylamid gel i TBE buffer og inneholder åtte molar urea som beskrevet i tekstprotokollen. Bland 20 mikroliter av RNA-preparatene med ett volum av lastbuffer.Inkuber ved 95 grader Celsius i en varmeblokk i 1,5 minutter, og klikk deretter på is. Legg prøvene i polyakrylamidgelen og kjør elektroforesen ved passende forhold for geldimensjonen. Etter dette, beise gelen i 0,5 mikrogram per milliliter ethidiumbromid i 15 minutter.Vask den beisede gelen med vann, og visualiser deretter RNA under UV-lys. Elektroforetisk analyse av flere rekombinante plasmider der forskjellige cDNAer settes inn viser forskjellige migrering sammenlignet med pLELVd-BZB. Legg merke til at pLELVd-BZB inneholder lacZ-markøren, som erstattes av cDNA som tilsvarer RNA av interesse, så mens migreringen avhenger av størrelsen på den innsatte cDNA, vil de rekombinante plasmidene vanligvis migrere raskere enn kontrollplasmiden.Produksjon av rekombinant RNA i koelektroporerte bakteriekulturer overvåkes ved å bryte cellene og analysere RNA ved å denaturing PAGE. Sterke bånd kan sees, noe som tilsvarer tomme ELVd og kimeriske ELVd former, der forskjellige RNAs av interesse ble satt inn. Interessant, en stor brøkdel av rekombinant RNA blir sett på som en sirkulær form.Sirkulariteten til hovedfraksjonen observeres ved hjelp av en kombinasjon av to PAGEs under denaturing forhold ved høy og lav ionisk styrke. RNA-preparatet kan ytterligere renses ved anionutvekslingskromatografi. Som sett her, E.Coli RNA er effektivt beholdt ved lav ionisk styrke, og deretter eluted ved høy ionisk styrke, med det meste av RNA blir samlet i fraksjoner to og tre.Rekombinant RNA kan ytterligere renses til homogenitet ved 2D elektroforese. Denne protokollen tillater enkel produksjon av store mengder rekombinant RNA i Escherichia coli og rensing til homogenitet takket være sirkulariteten til sluttproduktet. Husk at RNA av interesse resultater innebygd i et sirkulært RNA stillas avledet fra en plante viroid.Hvis du ønsker å skille begge moieties, må du bruke en standardstrategi, for eksempel ribozymes, DNAzymes eller RNase H.Utbyttet av denne protokollen avhenger av den bestemte RNA av interesse, da små RRIer sannsynligvis vil bli produsert i høyere mengder enn større. For større uttrykk, ta hensyn til at optimal tid til å høste bakterier avhenger av mange faktorer, inkludert E.Coli-stammen, kulturmediet og vekstforholdene. Vi anbefaler en foreløpig tidsanalyse for å finne det optimale produksjonsvinduet under dine spesielle forhold.Husk at rekombinante RNA-er akkumuleres i bakterielle celler forbigående, og at de helt forsvinner i den sene voksende fasen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Regissert Protein Emballasje innen ytre membran Blemmer fra<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produksjon og rensing

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Påvisning av pH-avhengig aktivitet av<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Anstand HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; og<em&gt; I Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantifisering av overflod og lading nivåer av overføring RNAs i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metode for høy gjennomstrømning kjemiske Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Nettstedet-rettet mutagenese for In Vitro og Vivo eksperimenter eksemplifisert med RNA samhandling i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Bruk av Alu Element som inneholder minigenes å analysere sirkulære RNAs

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Vaskemiddel-assistert rekonstituering av rekombinant Drosophila Atlastin til liposomer for lipid-miksing analyser

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Stedsspesifikk lysinacetylering av histoner for nukleosomrekonstituering ved bruk av genetisk kodeutvidelse i Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...