Name: large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por subsídios BIO2017-83184-R e BIO2017-91865-EXP do espanhol Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (co-financiado fundos do FEDER).

1. plasmídeo construção
<ol><li>
Amplificar pelo PCR (ou pela transcrição reversa PCR se a partir de um modelo de RNA) o cDNA correspondente para o RNA de interesse usando as primeiras demão com extensão de 5' para permitir que o assembly para o plasmídeo de expressão. Para evitar mutações indesejáveis, use uma DNA polimerase de alta-fidelidade.
	<ol>
<li>Para inserir o cDNA no plasmídeo de expressão por Gibson montagem20, adicionar as seguintes extensões de 5' p...

<ol>
	<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Research+on+Non-Coding+Ribonucleic+Acid+(RNA).">Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA).</a> Genes. 8 (12), (2017).</li><li>Hamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+approaches+to+RNA+aptamer+design.">In silico approaches to RNA aptamer design.</a> Biochimie. 145, 8-14 (2018).</li><li>Bobbin, M. L., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)-Based+Therapeutics:+Delivering+on+the+Promise?.">RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).</li><li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+for+Mosquito+and+Mosquito-Borne+Disease+Control.">RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control.</a> Insects. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expression+and+purification+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Methods. 54 (2), 267-273 (2011).</li><li>Kikuchi, Y., Umekage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nucleic+acids+of+the+marine+bacterium+Rhodovulum+sulfidophilum+and+recombinant+RNA+production+technology+using+bacteria.">Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+RNA+technology:+the+tRNA+scaffold.">Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold.</a> Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).</li><li>Batey, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+methods+for+native+expression+and+purification+of+RNA+for+structural+studies.">Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).</li><li>El Khouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+RNA-Protein+Complexes+in+Escherichia+coli.">Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli.</a> Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).</li><li>Ponchon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+RNA-protein+complexes+in+Escherichia+coli+and+applications+to+RNA+biology.">Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology.</a> Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).</li><li>Umekage, S., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+production+and+purification+of+circular+RNA+aptamer.">In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer.</a> Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).</li><li>Dar&#242;s, J. -. A., Aragon&#233;s, V., Cordero, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viroid-derived+system+to+produce+large+amounts+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids:+small+noncoding+infectious+RNAs+with+the+remakable+ability+of+autonomous+replication.">Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication.</a> Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).</li><li>Flores, R., Hern&#225;ndez, C., Mart&#237;nez de Alba, A. E., Dar&#242;s, J. A., Di Serio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+and+viroid-host+interactions.">Viroids and viroid-host interactions.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).</li><li>Di Serio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICTV+Virus+Taxonomy+Profile:+Avsunviroidae.">ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae.</a> The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).</li><li>Nohales, M. A., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroid+RNA+redirects+host+DNA+ligase+1+to+act+as+an+RNA+ligase.">Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).</li><li>Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+chloroplastic+isoform+of+tRNA+ligase+in+the+replication+of+viroids+belonging+to+the+family+Avsunviroidae.">Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggplant+latent+viroid:+a+friendly+experimental+system+in+the+family+Avsunviroidae.">Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).</li><li>Cordero, T., Ortol&#224;, B., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+Eggplant+Latent+Viroid+RNA+Circularization+by+the+Eggplant+tRNA+Ligase+in+Escherichia+coli.">Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li><li>Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-dimensional+electrophoretic+technique+for+the+detection+of+circular+viroids+and+virusoids.">A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids.</a> Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).</li><li>Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+electrophoretic+properties+of+solubilizable+disulfide+gels.">Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels.</a> Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).</li><li>Gigu&#232;re, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+structures+of+all+members+of+the+Avsunviroidae+family.">Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family.</a> Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).</li><li>L&#243;pez-Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+initiation+sites+of+eggplant+latent+viroid+strands+map+within+distinct+motifs+in+their+in+vivo+RNA+conformations.">The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations.</a> RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).</li></ol>

Enquanto pesquisava a sequência de ELVd e requisitos de estrutura envolvidos no reconhecimento pela berinjela ligase do tRNA, notamos essa expressão co de ambas as moléculas no host não Escherichia coli levado a uma inesperada grande acumulação de viroid circular formas em células bacterianas19. Entendemos que o grande acúmulo de viroid RNA em e. coli mais provavelmente foi consequência da co, expressando uma molécula de RNA altamente estável, tais como o relativamente...

Em contraste com DNA e proteínas, protocolos para fácil, eficiente e econômica de produção de grandes quantidades de RNA não são abundantes. No entanto, investigação e indústria demanda quantidade crescente destas biomoléculas para investigar suas propriedades biológicas únicas1, ou para ser empregado em sofisticadas aplicações biotecnológicas, incluindo a sua utilização como altamente específico aptamers 2, agentes terapêuticos3ou pesticidas seletivos4. In vitro a transcrição e síntese química são comumente usados em pesquisas para produzir RNA. No entanto, estes métodos implicam limitações importantes quando grandes quantidades de produtos são necessárias. A alternativa lógica é usar a maquinaria de transcrição endógeno das células vivas, seguido de um processo de purificação para separar os RNAs de interesse dos companheiros celulares. Na sequência desta estratégia, foram desenvolvidos métodos para produzir RNA recombinante em células bacterianas, tais como o laboratório-friendly Escherichia coli5 ou o marinho roxo fototróficas alfa-Proteobacteria Rhodovolum sulfidophilum 6. a maioria dos métodos para produzir RNA recombinante em bactérias dependem a expressão de um andaime nativo de RNA altamente estável, tais como um tRNA ou um rRNA, no qual o RNA de interesse é inserido7. Isso impõe a necessidade de liberar o RNA de interesse fora a molécula quimérico, se a presença de RNA extra é um problema para as aplicações a jusante de8. Outro conceito em biotecnologia de RNA de recombinação é a produção de complexos ribonucleoprotein recombinante que pode ser o produto desejado por si ou usado como uma estratégia de proteção para aumentar a estabilidade do RNA de interesse9, 10. Da mesma forma, a produção de RNAs circulares também tem sido sugerida como uma estratégia para gerar mais estável produtos11.
Recentemente desenvolvemos um novo método para produzir grandes quantidades de RNA recombinante em e. coli que participa em três dos conceitos acima: a inserção de RNA de interesse em um andaime de RNA circular altamente estável e a expressão co do RNA recombinante com uma proteína de interação provavelmente produzir um complexo de ribonucleoprotein estável que se acumula em quantidades notáveis em bacteriana células12. Em contraste com a evolução do anterior, usamos um andaime de RNA completamente alheio a Escherichia coli, ou seja um viroid. Viroides são um tipo muito particular de agentes infecciosos de plantas superiores que são constituídas exclusivamente por um relativamente pequeno (246-401 nt) altamente emparelhado-base de RNA circular13. Curiosamente, viroides são não-codificantes RNAs e, sem a ajuda de suas próprias proteínas, eles são capazes de completar ciclos infecciosos complexos no hospedeiros infectados14. Esses ciclos incluem a replicação de RNA RNA-para nos núcleos ou cloroplastos, dependendo da família viroid —Pospiviroidae ou Avsunviroidae, respectivamente — movimento através da planta infectada e evasão da resposta defensiva do hospedeiro. Viroides devem ser classificados entre os RNAs mais estáveis na natureza, em consequência de ser um RNA circular nu e ter que sobreviver no ambiente hostil de células vegetais infectados. Esta propriedade pode fazer viroides particularmente apropriada como andaimes para estabilizar a recombinação RNA em abordagens biotecnológicas. Além disso, o novo método baseia-se na expressão co do cadafalso viroid com uma interação da planta. Viroides replicam através de um mecanismo de rolamento-círculo no qual host enzimas são recrutadas para catalisar as diferentes etapas do processo. Notadamente algumas viroides, mais especificamente aqueles que pertencem a família Avsunviroidae15, contêm ribozimas que também estão envolvidas na replicação. Dependendo da espécie de viroid, transcrição de viroid RNAs é mediada pelo host RNA polimerase II ou o cloroplástico nuclear codificado RNA polimerase (NEP). Processamento de Viroid RNA parece ser catalisada por um host tipo III RNase, embora em viroides com ribozimas oligoméricas RNA intermediários Self cleave durante a replicação. Finalmente, os resultante monômeros viroid são circularizou, dependendo da família viroid, pelo ligase do DNA de anfitrião 1 ou o isoform cloroplástico de tRNA ligase16,17. Esta última enzima está envolvida na ligadura das formas monoméricas dos viroides da família Avsunviroidae, como berinjela viroid latente (ELVd)18.
No decorrer de um trabalho para analisar os requisitos de ELVd sequência e estruturais que determinam o reconhecimento pela berinjela (Solanum melongena L.) ligase do tRNA, montamos um sistema experimental baseado na expressão co de ambas as moléculas em e. coli 19. notamos que as transcrições de ELVd mais-que-unidade self cleave eficientemente em células de Escherichia coli através da martelo incorporado ribozimas e que eram os monómeros de viroid resultante com 5'-hidroxila e 2', 3'-fosfodiéster termini eficientemente circularizou pelo co expressa berinjela ligase do tRNA. Ainda mais, o RNA circular viroid resultante alcançou uma inesperada alta concentração em Escherichia coli, superiores dos rRNAs endógena12. Ausência de replicação intermediários indicou falta de ELVd de RNA RNA-para amplificação nestas células bacterianas. Curiosamente, inserção de RNAs heterólogos em uma posição específica da molécula viroid teve um efeito moderado na acumulação do circular viroid-derivado RNAs12. Estas observações nos fez imaginar um método para produzir grandes quantidades de recombinante RNAs em bactérias. Neste método, os cDNAs correspondente as RNAs de interesse são inseridos no cDNA a ELVd e o RNA quimérico resultante é expressa em e. coli através de um forte promotor constitutivo. Para o sistema funcionar, e. coli devem ser transformados co com um plasmídeo para expressar a berinjela ligase do tRNA. A transcrição de mais-do que-unidade ELVd-derivado é processada pelas martelo incorporado ribozimas e os monómeros resultantes com o termini apropriado são reconhecidos e circularizou pelo co expressa ligase do tRNA. Deste modo, o RNA de interesse é inserido em um andaime circular muito estável, consistindo da molécula circular viroid. Este RNA recombinante quimérico é provavelmente mais estabilizado no interior das células de Escherichia coli , pela formação de um complexo através da interação com a ligase do tRNA do ribonucleoprotein. Usando este método (Veja o protocolo abaixo), RNA aptamers, gancho de cabelo RNAs e outros RNAs estruturadas facilmente produzidos em quantidades de dezenas de miligramas por litro de cultura de Escherichia coli em condições laboratoriais normais e purificados a homogeneidade tomando vantagem de circularidade12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bpi I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010</td>
			<td>D1 low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131008.1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>Ba2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>48045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>X1402.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131785.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucloSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>22740588.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69387-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115(DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref. Timmons et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C 0113.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1211</td>
			<td>87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131509.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122333.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131020.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>FE04791000</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3691,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap DEAE Sepharose FF column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5055-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTAprime plus liquid chromatography system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>11001313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamyde</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1089,1000</td>
			<td>2K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>146392.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2940,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0937,2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Bis(acryloyl)cystamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4929-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli

Com interesse crescente em biologia do RNA e a utilização de moléculas de RNA em sofisticadas aplicações biotecnológicas, limitam-se os métodos para produzir grandes quantidades de RNA recombinante. Aqui, descrevemos um protocolo para produzir grandes quantidades de RNA recombinante em Escherichia coli , com base na expressão co de uma molécula quimérico que contém o RNA de interesse em um andaime viroid e uma planta ligase do tRNA. Viroides são relativamente pequenas, não-codificantes, altamente base-emparelhado RNAs circulares que são infecciosas para plantas superiores. O host planta tRNA ligase é uma enzima recrutada por viroides que pertencem à família Avsunviroidae, tais como berinjela viroid latente (ELVd), para mediar a circularização de RNA durante a replicação viroid. Embora ELVd não Replica em e. coli, um precursor do ELVd eficientemente é transcrito pela RNA polimerase de e. coli e processado pelas martelo incorporado ribozimas em células bacterianas, e os monômeros resultantes são circularizou pela ligase do tRNA co expressa atingindo uma concentração notável. A inserção de um RNA de interesse no cadafalso ELVd permite a produção de dezenas de miligramas do RNA recombinante por litro de cultura bacteriana em condições laboratoriais regulares. Uma fração principal do produto do RNA é circular, um recurso que facilita a purificação do RNA recombinante de homogeneidade virtual. Neste protocolo, um correspondente de DNA (cDNA) complementar ao RNA de interesse é inserido em uma determinada posição do cDNA ELVd em um plasmídeo de expressão que é usada, ao longo do plasmídeo para expressar co berinjela ligase do tRNA, para transformar e. coli. Expressão co de ambas as moléculas sob o controle dos promotores constitutivos fortes leva à produção de grandes quantidades de RNA recombinante. O RNA recombinante pode ser extraído as células bacterianas e separa a maior parte dos RNAs bacterianas, aproveitando sua circularidade.

Para produzir RNA de recombinação em Escherichia coli usando o sistema derivado de ELVd12, o RNA de interesse é enxertado em um andaime de RNA ELVd. Este RNA quimérico é co expressa ao longo da berinjela ligase do tRNA em e. coli. Uma vez processadas, clivado e circularizou, o quimérico RNA circular, do qual o RNA de interesse se projeta, provavelmente forma um complexo com a enzima de berinjela co expressa que atinge notável concentração...

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Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Produção em grande escala de RNAs recombinantes em um andaime Circular usando um sistema derivado de Viroid em Escherichia coli

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir grandes quantidades de RNA recombinante em Escherichia coli expressando co um RNA quimérico que contém o RNA de interesse em um andaime viroid e uma planta ligase do tRNA. O principal produto é uma molécula circular que facilita a purificação de homogeneidade.

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Este método pode ajudar a produzir grandes quantidades de RNAs recombinantes de interesse para aplicação em pesquisa ou indústria. A principal vantagem é que o RNA recombinante é produzido em Escherichia coli em um processo barato que pode ser facilmente ampliado. É importante ressaltar que o RNA é produzido em um andaime circular de RNA, o que facilita a purificação da homogeneidade.Em contraste com o DNA ou proteínas, as RNAs de interesse não são facilmente produzidas em grandes quantidades em sistemas biofatoriais, como uma cultura Escherichia coli. Nosso método baseia-se na co-expressão do RNA de interesse inserido em um andaime circular altamente estável e na aplicação de um ligase que media a circularização do RNA. O andaime RNA circular deriva de um viróide patenteado.Viróides são relativamente pequenos, não-enrolados, rnas circulares altamente emparelhadas com base que são infecciosos para algumas plantas mais altas. Podemos produzir dezenas de miligramas do RNA recombinante por litro de cultura bacteriana em condições de laboratório regulares. Para iniciar este procedimento, amplie o cDNA por PCR conforme descrito no protocolo de texto.Em seguida, adicione 100 nanogramas do pLELVd-BZB plasmídeo a um tubo de 0,5 mililitro. Adicione 10 U da enzima de restrição IIS tipo BpiI e o suficiente de buffer G para criar uma reação de 20 microliter. Incubar a 37 graus Celsius por uma hora para digerir o plasmídeo.Depois disso, separe os produtos PCR e digestão por eletroforese em um gel de 1% de agarose no buffer TAE. Manche o gel sacudindo-o em 200 mililitros brometo de etídio a uma concentração de 0,5 microgramas por mililitro. Usando um transilluminador UV, visualize o DNA.Use um bisturi para cortar as bandas correspondentes ao cDNA amplificado e ao plasmídeo digerido BpiI. Usando colunas de gel de sílica, elute os DNAs dos fragmentos de gel. Quantifique a concentração do DNA por análise espectrofotométrica.Configure uma reação gibson assembly usando o cDNA amplificado e o plasmídeo digerido. Incubar a 50 graus Celsius por uma hora. Em seguida, use uma coluna de gel de sílica para purificar a reação.Depois de eletroporar células E.coli DH5-Alpha competentes, escolha várias colônias brancas e transfira-as para o meio LB líquido. Cresça as colônias durante a noite a 37 graus Celsius. Em seguida, use um kit miniprep para purificar os plasmídeos, e analise seus tamanhos por eletroforese em um gel de 1% de agarose no buffer TAE.Primeiro, co-eletroporar a cepa E.coli selecionada com o derivado pLELVd-BZB que contém o cDNA correspondente ao RNA de interesse e o plasmídeo P15LTRNISM para co-expressar a liga ligase de tRNA de berinjela. Transfira o meio líquido SOC para a cuvette de eletroporação para recuperar as células, e incubar a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, aborrece as bactérias em meio sólido LB contendo 50 microgramas por ampicillina mililitro, e 34 microgramas por niólito clorofenicol.Incubar a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione 250 mililitros de meio líquido de TB, contendo 50 microgramas por ampicillina mililitro, e 34 microgramas por clororamfenicol mililitro, a um frasco de um litro confundido erlenmeyer. Recupere o E.Coli incubado, e então escolha uma colônia e inocula o meio no frasco.Incubar a 37 graus Celsius com agitação vigorosa a 180 RPM por 12 a 16 horas antes de colher a bactéria. Despeje a cultura E.Coli colhida em uma garrafa de centrífugas de 250 mililitros e gire as células a 14.000 G por 10 minutos. Descarte o supernatante e resuspenque as células em 30 mililitros de água.Transfira esta suspensão para um tubo de centrífuga e gire as células novamente usando as condições anteriores. Descarte o supernatante e adicione 10 mililitros de tampão de cromatografia à pelota celular. Vórtice para resuspensar as células no buffer.Adicione um volume de fenol:clorofórmio e vórtice vigorosamente para quebrar as células. Então, centrífuga a 12.000 G por 10 minutos. Recupere a fase aquosa, adicione um volume de clorofórmio e vórtice vigorosamente.Centrífuga a 12.000 G por 10 minutos. Depois disso, filtre a preparação do RNA através de um filtro de seringa de 45 micrômetros. Purifique o RNA usando uma coluna de amina de etanol dietil de um mililitro conectada a um sistema de cromatografia líquida.Ajuste a taxa de fluxo para um mililitro por minuto e equilibre a coluna com 10 mililitros de tampão de cromatografia. Em seguida, carregue a amostra e lave a coluna com 10 mililitros de tampão cromatógrafo. Elute o RNA com 20 mililitros de tampão de elução, e colete uma alíquota mililitro.Utilizando eletroforese de gel de poliacrilamida bidimensional, separe as RNAs circulares de suas contrapartes lineares. Primeiro, prepare um gel de poliacrilamida de 5% no tampão TBE e contendo oito ureia molar, conforme descrito no protocolo de texto. Misture 20 microliters das preparações de RNA com um volume de tampão de carga.Incubar a 95 graus Celsius em um bloco de aquecimento por 1,5 minutos e, em seguida, esfriar no gelo. Carregue as amostras no gel de poliacrilamida e execute a eletroforese nas condições adequadas para a dimensão do gel. Depois disso, manche o gel em 0,5 micrograma por brometo de etídio mililitro por 15 minutos.Lave o gel manchado com água e, em seguida, visualize o RNA sob luz UV. A análise eletroforética de vários plasmídeos recombinantes nos quais diferentes cDNAs são inseridos mostram migrações diferentes quando comparadas com pLELVd-BZB. Observe que pLELVd-BZB contém o marcador lacZ, que é substituído pelo cDNA correspondente ao RNA de interesse, portanto, enquanto a migração depende do tamanho do cDNA inserido, os plasmídeos recombinantes geralmente migrarão mais rápido do que o plasmídeo de controle.A produção do RNA recombinante em culturas bacterianas co-eletroporadas é monitorada pela quebra das células e pela análise do RNA por meio da desnaturação PAGE. Podem ser vistas bandas fortes, que correspondem a formas elvd vazias e quimricas de ELVd, nas quais diferentes RNAs de interesse foram inseridas. Curiosamente, uma grande fração do RNA recombinante é vista como uma forma circular.A circularidade da fração principal é observada usando uma combinação de dois PAGEs em condições de desnaturação com alta e baixa resistência iônica. A preparação do RNA pode ser purificada por cromatografia de troca de ânion. Como visto aqui, o RNA E.Coli é eficientemente retido com baixa resistência iônica, e posteriormente elucido com alta resistência iônica, com a maior parte do RNA sendo coletado nas frações dois e três.O RNA recombinante pode ser purificado ainda mais para a homogeneidade por eletroforese 2D. Este protocolo permite a fácil produção de grandes quantidades de RNA recombinante em Escherichia coli e purificação à homogeneidade graças à circularidade do produto final. Lembre-se que o RNA de juros resulta embutido em um andaime circular de RNA derivado de um viróide vegetal.Se você deseja separar ambas as moieties, você precisa usar uma estratégia padrão, como ribozymes, DNAzymes ou RNase H.O rendimento deste protocolo depende do RNA particular de interesse, já que pequenos RNAs provavelmente serão produzidos em quantidades maiores do que as maiores. Para expressões de maior escala, leve em consideração que o tempo ideal para colher bactérias depende de muitos fatores, incluindo a cepa E.Coli, o meio cultural e as condições de crescimento. Recomendamos um ensaio preliminar de curso de tempo para encontrar a janela de produção ideal em suas condições particulares.Lembre-se que as RNAs recombinantes se acumulam em células bacterianas transitoriamente, e que elas desaparecem completamente na fase de crescimento tardio.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Concepção, produção e purificação

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Bioquímica

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

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Quantificação de abundância e carregamento níveis de RNAs de transferência em Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

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Um método simples para High Throughput Screening químico em Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Mutagenesis local-dirigido para In Vitro e In Vivo experimentos exemplificados com interações de RNA em Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Uso do elemento Alu contendo Minigenes para analisar RNAs circulares

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Reconstituição detergente-assistida da Drosophila atlastin recombinante em lipossomas para ensaios de mistura de lipídios

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Lysine Acetilation specific de Histones para Reconstituição Nucleososome usando Expansão do Código Genético em Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...