Name: large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por becas BIO2017-83184-R y BIO2017-91865-EXP desde el Ministerio Español de Ciencia, Innovación y Universidades (cofinanciados fondos FEDER).

1. construcción de plásmido
<ol><li>
Amplificar por PCR (o por transcripción reversa PCR si a partir de una plantilla de RNA) el cDNA correspondiente al RNA de interés usando las cartillas con extensión de 5' para permitir el montaje en el plásmido de expresión. Para evitar las mutaciones no deseadas, utilice una DNA polimerasa de alta fidelidad.
	<ol>
<li>Para insertar el cDNA en el plásmido de expresión por Gibson Asamblea20, agregar las siguientes extensiones de 5' ...

<ol>
	<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Research+on+Non-Coding+Ribonucleic+Acid+(RNA).">Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA).</a> Genes. 8 (12), (2017).</li><li>Hamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+approaches+to+RNA+aptamer+design.">In silico approaches to RNA aptamer design.</a> Biochimie. 145, 8-14 (2018).</li><li>Bobbin, M. L., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)-Based+Therapeutics:+Delivering+on+the+Promise?.">RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).</li><li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+for+Mosquito+and+Mosquito-Borne+Disease+Control.">RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control.</a> Insects. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expression+and+purification+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Methods. 54 (2), 267-273 (2011).</li><li>Kikuchi, Y., Umekage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nucleic+acids+of+the+marine+bacterium+Rhodovulum+sulfidophilum+and+recombinant+RNA+production+technology+using+bacteria.">Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+RNA+technology:+the+tRNA+scaffold.">Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold.</a> Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).</li><li>Batey, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+methods+for+native+expression+and+purification+of+RNA+for+structural+studies.">Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).</li><li>El Khouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+RNA-Protein+Complexes+in+Escherichia+coli.">Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli.</a> Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).</li><li>Ponchon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+RNA-protein+complexes+in+Escherichia+coli+and+applications+to+RNA+biology.">Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology.</a> Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).</li><li>Umekage, S., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+production+and+purification+of+circular+RNA+aptamer.">In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer.</a> Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).</li><li>Dar&#242;s, J. -. A., Aragon&#233;s, V., Cordero, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viroid-derived+system+to+produce+large+amounts+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids:+small+noncoding+infectious+RNAs+with+the+remakable+ability+of+autonomous+replication.">Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication.</a> Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).</li><li>Flores, R., Hern&#225;ndez, C., Mart&#237;nez de Alba, A. E., Dar&#242;s, J. A., Di Serio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+and+viroid-host+interactions.">Viroids and viroid-host interactions.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).</li><li>Di Serio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICTV+Virus+Taxonomy+Profile:+Avsunviroidae.">ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae.</a> The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).</li><li>Nohales, M. A., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroid+RNA+redirects+host+DNA+ligase+1+to+act+as+an+RNA+ligase.">Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).</li><li>Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+chloroplastic+isoform+of+tRNA+ligase+in+the+replication+of+viroids+belonging+to+the+family+Avsunviroidae.">Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggplant+latent+viroid:+a+friendly+experimental+system+in+the+family+Avsunviroidae.">Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).</li><li>Cordero, T., Ortol&#224;, B., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+Eggplant+Latent+Viroid+RNA+Circularization+by+the+Eggplant+tRNA+Ligase+in+Escherichia+coli.">Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li><li>Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-dimensional+electrophoretic+technique+for+the+detection+of+circular+viroids+and+virusoids.">A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids.</a> Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).</li><li>Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+electrophoretic+properties+of+solubilizable+disulfide+gels.">Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels.</a> Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).</li><li>Gigu&#232;re, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+structures+of+all+members+of+the+Avsunviroidae+family.">Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family.</a> Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).</li><li>L&#243;pez-Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+initiation+sites+of+eggplant+latent+viroid+strands+map+within+distinct+motifs+in+their+in+vivo+RNA+conformations.">The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations.</a> RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).</li></ol>

Durante la investigación los ELVd secuencia y estructura requisitos implicados en el reconocimiento por la berenjena Arnt Ligasa, nos dimos cuenta de que la expresión conjunta de ambas moléculas en el host no e. coli conducido a una inesperado gran acumulación de Viroide circular se forma en las células bacterianas19. Comprendimos que la gran acumulación de Viroide RNA en e. coli probablemente fue consecuencia de expresar Co una molécula de ARN altamente estable, como el r...

En contraste con el ADN y las proteínas, los protocolos para producción fácil, eficiente y rentable de grandes cantidades de ARN no son abundantes. Sin embargo, investigación e industria demanda cantidades crecientes de estas biomoléculas para investigar sus propiedades biológicas únicas1, o a emplearse en sofisticadas aplicaciones biotecnológicas, incluyendo su uso como aptámeros altamente específicos 2, agentes terapéuticos3o pesticidas selectivo4. Transcripción in vitro y la síntesis química se utilizan en la investigación para producir RNA. Sin embargo, estos métodos implican limitaciones importantes cuando se requieren grandes cantidades de los productos. La alternativa lógica es utilizar la maquinaria de transcripción endógena de las células vivas, seguido por un proceso de purificación para separar el ARN de interés de los compañeros celulares. Siguiendo esta estrategia, se han desarrollado métodos para producir arn recombinante en células bacterianas, tales como el ambiente de laboratorio de Escherichia coli5 o la Marina púrpura fototrófica alfa-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. mayoría de los métodos para producir arn recombinante en las bacterias dependen de la expresión de un andamio de RNA muy estable nativa, tales como inserta de un tRNA o un rRNA, en el cual el RNA de interés es7. Esto impone la necesidad de liberar el RNA de interés fuera de la molécula quimérica, si la presencia de ARN extra es un problema para las aplicaciones posteriores8. Otro concepto en recombinante biotecnología de RNA es la producción de complejos de ribonucleoproteína recombinante puede ser el producto deseado por sí o usado como una estrategia protectora para aumentar la estabilidad del ARN de interés9, 10. Del mismo modo, la producción de RNAs circular también ha sugerido como una estrategia para generar productos más estable11.
Recientemente hemos desarrollado un nuevo método para producir grandes cantidades de RNA recombinante en e. coli que participa en tres de los conceptos anteriores: la inserción del RNA de interés en un andamio de RNA circular muy estable y la expresión conjunta de la células de RNA recombinante con una proteína interacción probable producir un complejo de ribonucleoproteína estable que se acumula en cantidades notables en bacterianas12. En contraste con los desarrollos anteriores, se utilizó un andamio de RNA totalmente ajeno a e. coli, es decir, un Viroide. Los viroides son un tipo muy particular de agentes infecciosos de plantas superiores que están constituidos exclusivamente por una relativamente pequeña (246-401 nt) muy vinculado a base de RNA circular13. Curiosamente, los viroides son no-codificación RNAs y, sin la ayuda de sus propias proteínas, que son capaces de completar ciclos infecciosos complejos en los anfitriones infectados14. Estos ciclos incluyen la replicación del ARN a ARN en el núcleo o cloroplastos, dependiendo de la familia de Viroide:Pospiviroidae o Avsunviroidae, respectivamente — movimiento a través de la planta infectada y la evasión de la respuesta defensiva del huésped. Viroides deben ser alineados entre los RNAs más estables en la naturaleza, como consecuencia de ser un ARN circular desnudo y tener que sobrevivir en el hostil ambiente de células de la planta infectada. Esta propiedad hace que los viroides particularmente conveniente como andamios para estabilizar recombinantes RNA en enfoques biotecnológicos. Además, el nuevo método se basa en la co-expresión del andamio Viroide con una interacción proteína vegetal. Viroides se replican mediante un mecanismo de círculo rodante en que host son reclutadas enzimas para catalizar las distintas etapas del proceso. En particular algunos viroides, concretamente aquellos que pertenecen a la familia Avsunviroidae15, contienen ribozimas que también participan en la replicación. Dependiendo de la especie de Viroide, transcripción de Viroide RNAs está mediada por el host de polimerasa II del RNA o el cloroplástico nuclear codificado polimerasa del RNA (NEP). Procesamiento Viroid RNA parece ser catalizado por un host Rnasa tipo III, aunque en viroides con ARN los ribozimas intermedios uno partirá durante la replicación. Por último, los monómeros resultantes del Viroide están circular, dependiendo de la familia de Viroide, por el ligase de la DNA del anfitrión 1 o la isoforma cloroplástico de tRNA ligase16,17. Esta última enzima participa en la ligadura de las formas monoméricas de los viroides de la familia Avsunviroidae, como berenjena viroid latente (ELVd)18.
En el curso de un trabajo para analizar los requisitos de ELVd secuencia y estructurales que determinan el reconocimiento de la berenjena (Solanum melongena L.) Arnt Ligasa, hemos creado un sistema experimental basado en expresión conjunta de ambas moléculas en e. coli 19. nos dimos cuenta que ELVd transcripciones de más que unidad Self-cleave eficientemente en las células de e. coli a través de los ribozimas de cabeza de martillo incrustado y que los monómeros resultantes de Viroide y 5'-hidroxilo 2', 3'-fosfodiéster termini circular eficientemente por la berenjena Co expresado Arnt Ligasa. Más aún, el ARN Viroide circular resultante alcanzó una inesperada alta concentración en e. coli, superiores a las de los rRNAs endógeno12. Ausencia de replicación intermedios indica falta de amplificación ELVd ARN a ARN en las células bacterianas. Curiosamente, la inserción de RNAs heterólogos en una posición determinada de la molécula de Viroide tuvo un efecto moderado en la acumulación de la circular derivados de Viroide RNAs12. Estas observaciones nos hacen imaginar un método para producir grandes cantidades de recombinante RNAs en bacterias. En este método, se insertan los cDNAs correspondientes a los RNAs de interés en el cDNA ELVd y el ARN quimérico resultante se expresa en e. coli a través de un promotor constitutivo fuerte. Para que el sistema de trabajo, e. coli debe transformarse conjuntamente con un plásmido para expresar la berenjena Arnt Ligasa. La transcripción más que unidad ELVd derivado es procesada por los ribozimas de cabeza de martillo incrustado y los monómeros resultantes con los términos apropiados son reconocidos y circular por el Arnt Ligasa Co expresado. Así, el ARN de interés se inserta en un andamio circular muy estable de la molécula circular de Viroide. Este ARN quimérico recombinante es probablemente más estabilizada dentro de las células de e. coli por la formación de un complejo a través de la interacción con los Arnt Ligasa ribonucleoproteína. Con este método (ver protocolo más adelante), RNA aptámeros, hairpin RNAs y otros RNAs estructurados han sido fácilmente producidos en cantidades de decenas de miligramos por litro de cultivo de e. coli en condiciones de laboratorio regulares y purificada a homogeneidad tomando ventaja de circularidad12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bpi I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010</td>
			<td>D1 low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131008.1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>Ba2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>48045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>X1402.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131785.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucloSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>22740588.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69387-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115(DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref. Timmons et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C 0113.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1211</td>
			<td>87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131509.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122333.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131020.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>FE04791000</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3691,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap DEAE Sepharose FF column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5055-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTAprime plus liquid chromatography system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>11001313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamyde</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1089,1000</td>
			<td>2K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>146392.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2940,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0937,2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Bis(acryloyl)cystamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4929-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli

Con el aumento de interés en la biología del RNA y el uso de moléculas de ARN en aplicaciones biotecnológicas sofisticadas, los métodos para producir grandes cantidades de ARN recombinante son limitados. Aquí, describimos un protocolo para producir grandes cantidades de RNA recombinante en Escherichia coli , basado en la expresión de una molécula quimérica que contiene el ARN de interés en un andamio de Viroide y una planta de Arnt Ligasa. Los viroides son RNAs circular relativamente pequeños, no codificante, altamente vinculado de base que son infecciosos a las plantas superiores. El anfitrión planta Arnt Ligasa es una enzima reclutada por viroides que pertenecen a la familia Avsunviroidae, como berenjena viroid latente (ELVd), para mediar la circularización del RNA durante la replicación del Viroide. Aunque ELVd no replicar en e. coli, un precursor de ELVd eficientemente es transcrito por la ARN polimerasa de e. coli y procesado por la ribozimas de cabeza de martillo incrustado en células bacterianas, y los monómeros resultantes son circular por el Co expresado Arnt Ligasa alcanzando una notable concentración. La inserción de un RNA de interés en el andamio ELVd permite la producción de decenas de miligramos de recombinantes RNA por litro de cultivo bacteriano en condiciones de laboratorio regulares. Una fracción principal del producto RNA es circular, una característica que facilita la purificación del ARN recombinante a homogeneidad virtual. En este protocolo, un complementario DNA (cDNA) correspondiente del ARN de interés se inserta en una particular posición del cDNA ELVd en un plásmido de expresión que se utiliza, a lo largo de los plásmidos expresar Co berenjena Arnt Ligasa, para transformar e. coli. Coexpresión de ambas moléculas bajo el control de promotores constitutivos fuertes conduce a la producción de grandes cantidades de ARN recombinante. El ARN recombinante puede ser extraído de las células bacterianas y separado de la mayor parte del ARN bacteriano aprovechando su circularidad.

Para producir RNA recombinante en e. coli utilizando el sistema derivado ELVd12, el RNA de interés se injerta en un andamio ELVd ARN. Este ARN quimérico es co expresado a lo largo de la berenjena Arnt Ligasa de e. coli. Una vez procesado, troceados y circular, el ARN circular quimérico, de la que sobresale el RNA de interés, probablemente forma una ribonucleoproteína complejo con la enzima berenjena Co expresó que alcanza notable concentraci...

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Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Producción a gran escala de ARN recombinante en un andamio Circular utilizando un sistema derivado de Viroide en Escherichia coli

Aquí, presentamos un protocolo para producir grandes cantidades de RNA recombinante en Escherichia coli Co expresando un ARN quimérico que contiene el ARN de interés en un andamio de Viroide y una planta de Arnt Ligasa. El principal producto es una molécula circular que facilita la purificación a homogeneidad.

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Este método puede ayudar a producir grandes cantidades de ARN recombinantes de interés para su aplicación en la investigación o la industria. La principal ventaja es que el ARN recombinante se produce en Escherichia coli en un proceso barato que se puede escalar fácilmente. Es importante destacar que el ARN se produce en un andamio circular de ARN, lo que facilita la purificación a la homogeneidad.A diferencia del ADN o las proteínas, los ARN de interés no se producen fácilmente en grandes cantidades en sistemas biofactores, como un cultivo de Escherichia coli. Nuestro método se basa en la coexpresión del ARN de interés insertado en un andamio circular altamente estable y aplicando un ligasel que media la circularización del ARN. El andamio circular de ARN deriva de un viroide patentado.Los viroides son relativamente pequeños, no enrollados, ARN circulares altamente emparejados con base que son infecciosos para algunas plantas más altas. Podemos producir decenas de miligramos del ARN recombinante por litro de cultivo bacteriano en condiciones regulares de laboratorio. Para comenzar este procedimiento, amplíe el ADNc por PCR como se describe en el protocolo de texto.A continuación, agregue 100 nanogramos del plásmido pLELVd-BZB a un tubo de 0,5 mililitros. Agregue 10 U del tipo de enzima de restricción DE IIS BpiI y suficiente búfer G para crear una reacción de 20 microlitrotros. Incubar a 37 grados centígrados durante una hora para digerir el plásmido.Después de esto, separar los productos de PCR y digestión por electroforesis en un gel de agarosa del uno por ciento en tampón TAE. Manchar el gel agitando en 200 mililitros de bromuro de etidio a una concentración de 0,5 microgramos por mililitro. Usando un transiluminador UV, visualice el ADN.Utilice un bisturí para cortar las bandas correspondientes al ADNv amplificado y al plásmido digerido BpiI. Usando columnas de gel de sílice, ele los DNA de los fragmentos de gel. Cuantificar la concentración del ADN mediante análisis espectrofotométrico.Configure una reacción de Gibson Assembly utilizando el ADNv amplificado y el plásmido digerido. Incubar a 50 grados centígrados durante una hora. Luego, usa una columna de gel de sílice para purificar la reacción.Después de electroporar células competentes de E.coli DH5-Alpha, recoger varias colonias blancas y transferirlas a medio LB líquido. Cultivar las colonias durante la noche a 37 grados centígrados. A continuación, utilice un kit de miniprep para purificar los plásmidos, y analice sus tamaños por electroforesis en un gel de agarosa del uno por ciento en tampón TAE.En primer lugar, co-electroporar la cepa E.coli seleccionada con el derivado pLELVd-BZB que contiene el ADNc correspondiente al ARN de interés y el plásmido P15LTRNISM para co-expresar la berenjena tRNA ligase. Transfiera el medio líquido SOC a la cubeta de electroporación para recuperar las células, e incubar a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, placar las bacterias en medio sólido LB que contiene 50 microgramos por mililitro ampicilina, y 34 microgramos por mililitrolitrol.Incubar a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, añadir 250 mililitros de medio líquido de TB, que contiene 50 microgramos por mililitro ampicilina, y 34 microgramos por mililitrolitor cloranfenicol, a un matraz Erlenmeyer desconcertado de un litro. Recuperar el E. coli incubado, y luego elegir una colonia e inocular el medio en el matraz.Incubar a 37 grados centígrados con agitación vigorosa a 180 RPM durante 12 a 16 horas antes de cosechar la bacteria. Vierta el cultivo de E. coli cosechado en una botella centrífuga de 250 mililitros y gire las células a 14.000 G durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 30 mililitros de agua.Transfiera esta suspensión a un tubo centrífugo y vuelva a girar las células utilizando las condiciones anteriores. Deseche el sobrenadante y agregue 10 mililitros de tampón de cromatografía al pellet celular. Vórtice para resuspender las celdas en el búfer.Añadir un volumen de fenol: cloroformo y vórtice vigorosamente para romper las células. Luego, centrifugar a las 12.000 G durante 10 minutos. Recuperar la fase acuosa, añadir un volumen de cloroformo, y vórtice vigorosamente.Centrifugar a 12.000 G durante 10 minutos. Después de esto, filtre la preparación del ARN a través de un filtro de jeringa de 45 micrómetros. Purifique el ARN utilizando una columna de amina de etanol dietilétil de un mililitro conectada a un sistema de cromatografía líquida.Ajuste el caudal a un mililitro por minuto y equilibre la columna con 10 mililitros de tampón de cromatografía. A continuación, cargue la muestra y lave la columna con 10 mililitros de tampón de cromatografía. Eluir el ARN con 20 mililitros de tampón de elución, y recoger un mililitro alícuotas.Usando electroforesis de gel de poliacrilamida bidimensional, separe los ARN circulares de sus contrapartes lineales. En primer lugar, preparar un gel de poliacrilamida del cinco por ciento en tampón TBE y que contenga ocho urea molares como se describe en el protocolo de texto. Mezclar 20 microlitros de las preparaciones de ARN con un volumen de búfer de carga.Incubar a 95 grados centígrados en un bloque de calentamiento durante 1,5 minutos, y luego enfriar sobre hielo. Cargue las muestras en el gel de poliacrilamida y ejecute la electroforesis en las condiciones adecuadas para la dimensión del gel. Después de esto, manche el gel en 0,5 microgramos por mililitro de bromuro de etidio durante 15 minutos.Lave el gel manchado con agua y luego visualice el ARN bajo la luz UV. El análisis electroforético de varios plásmidos recombinantes en los que se insertan diferentes cDNAs muestran diferentes migraciones en comparación con pLELVd-BZB. Tenga en cuenta que pLELVd-BZB contiene el marcador lacZ, que es reemplazado por el ADNc correspondiente al ARN de interés, por lo que si bien la migración depende del tamaño del ADNr insertado, los plásmidos recombinantes generalmente migrarán más rápido que el plásmido de control.La producción del ARN recombinante en cultivos bacterianos co-electroporados se controla rompiendo las células y analizando el ARN desnaturalizado. Se pueden ver bandas fuertes, que corresponden a formas vacías de ELVd y ELVd quiméricos, en las que se insertaron diferentes ARN de interés. Curiosamente, una fracción importante del ARN recombinante se ve como una forma circular.La circularidad de la fracción principal se observa mediante el uso de una combinación de dos PAGEs en condiciones de desnaturalamiento a alta y baja resistencia iónica. La preparación del ARN se puede purificar aún más mediante cromatografía de intercambio de aniones. Como se ve aquí, el ARN de E. coli se retiene eficientemente a baja resistencia iónica, y posteriormente se elue a alta resistencia iónica, con la mayor parte del ARN se recoge en fracciones dos y tres.El ARN recombinante se puede purificar aún más a la homogeneidad mediante la electroforesis 2-D. Este protocolo permite la fácil producción de grandes cantidades de ARN recombinante en Escherichia coli y purificación a homogeneidad gracias a la circularidad del producto final. Recuerde que el ARN de interés resulta incrustado en un andamio de ARN circular derivado de un viroide de la planta.Si desea separar ambas mitades, debe utilizar una estrategia estándar, como ribozimas, DNAzymes o RNase H.El rendimiento de este protocolo depende del ARN particular de interés, ya que es probable que los ARN pequeños se produzcan en cantidades más altas que las más grandes. Para expresiones a mayor escala, tenga en cuenta que el tiempo óptimo para cosechar bacterias depende de muchos factores, incluyendo la cepa E. coli, medio de cultivo y condiciones de cultivo. Recomendamos un ensayo preliminar de curso de tiempo para encontrar la ventana de producción óptima en sus condiciones particulares.Recuerde que los ARN recombinantes se acumulan en las células bacterianas de forma transitoria, y que desaparecen por completo en la fase de crecimiento tardío.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

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Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Diseño, Producción y Purificación

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Investigación

Bioquímica

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

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Detección de la actividad dependiente del pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Acompañante HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; y<em&gt; En Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

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El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

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Cuantificación de la abundancia y la carga de los niveles de ARN de transferencia en Escherichia coli

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A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

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Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

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Mutagénesis sitio-dirigida para In Vitro e In Vivo experimentos, ejemplificados con las interacciones de la ARN en Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

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Uso de Minigenes que contienen elementos Alu para analizar ARN circulares

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Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

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Reconstitución asistida por detergente de Drosophila Atlastin recombinante en liposomas para ensayos de mezcla de lípidos

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Sitio Específico De La Acetilación De Lisina De Histonas Para La Reconstitución De Nucleosomas Utilizando La Expansión Del Código Genético En Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...