Name: large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

Detta arbete stöds av bidrag BIO2017-83184-R och BIO2017-91865-EXP från den spanska Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (samfinansierade FEDER fonder).

1. plasmid konstruktion
<ol><li>
Förstärka genom PCR (eller genom omvänd Transkription PCR om start från en RNA-mall) det cDNA som motsvarar RNA av intresse med hjälp av grundfärger med 5' förlängning för att tillåta montering i uttrycket Plasmiden. Undvik oönskade mutationer, använda en HiFi-DNA-polymeras.
	<ol>
<li>Om du vill infoga cDNA i uttrycket plasmiden med Gibson församling20, lägga till följande 5' tillägg till PCR primers: framåt, 5'-tctccccctcccaggt...

<ol>
	<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Research+on+Non-Coding+Ribonucleic+Acid+(RNA).">Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA).</a> Genes. 8 (12), (2017).</li><li>Hamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+approaches+to+RNA+aptamer+design.">In silico approaches to RNA aptamer design.</a> Biochimie. 145, 8-14 (2018).</li><li>Bobbin, M. L., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)-Based+Therapeutics:+Delivering+on+the+Promise?.">RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).</li><li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+for+Mosquito+and+Mosquito-Borne+Disease+Control.">RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control.</a> Insects. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expression+and+purification+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Methods. 54 (2), 267-273 (2011).</li><li>Kikuchi, Y., Umekage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nucleic+acids+of+the+marine+bacterium+Rhodovulum+sulfidophilum+and+recombinant+RNA+production+technology+using+bacteria.">Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+RNA+technology:+the+tRNA+scaffold.">Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold.</a> Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).</li><li>Batey, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+methods+for+native+expression+and+purification+of+RNA+for+structural+studies.">Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).</li><li>El Khouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+RNA-Protein+Complexes+in+Escherichia+coli.">Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli.</a> Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).</li><li>Ponchon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+RNA-protein+complexes+in+Escherichia+coli+and+applications+to+RNA+biology.">Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology.</a> Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).</li><li>Umekage, S., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+production+and+purification+of+circular+RNA+aptamer.">In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer.</a> Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).</li><li>Dar&#242;s, J. -. A., Aragon&#233;s, V., Cordero, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viroid-derived+system+to+produce+large+amounts+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids:+small+noncoding+infectious+RNAs+with+the+remakable+ability+of+autonomous+replication.">Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication.</a> Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).</li><li>Flores, R., Hern&#225;ndez, C., Mart&#237;nez de Alba, A. E., Dar&#242;s, J. A., Di Serio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+and+viroid-host+interactions.">Viroids and viroid-host interactions.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).</li><li>Di Serio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICTV+Virus+Taxonomy+Profile:+Avsunviroidae.">ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae.</a> The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).</li><li>Nohales, M. A., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroid+RNA+redirects+host+DNA+ligase+1+to+act+as+an+RNA+ligase.">Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).</li><li>Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+chloroplastic+isoform+of+tRNA+ligase+in+the+replication+of+viroids+belonging+to+the+family+Avsunviroidae.">Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggplant+latent+viroid:+a+friendly+experimental+system+in+the+family+Avsunviroidae.">Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).</li><li>Cordero, T., Ortol&#224;, B., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+Eggplant+Latent+Viroid+RNA+Circularization+by+the+Eggplant+tRNA+Ligase+in+Escherichia+coli.">Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li><li>Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-dimensional+electrophoretic+technique+for+the+detection+of+circular+viroids+and+virusoids.">A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids.</a> Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).</li><li>Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+electrophoretic+properties+of+solubilizable+disulfide+gels.">Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels.</a> Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).</li><li>Gigu&#232;re, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+structures+of+all+members+of+the+Avsunviroidae+family.">Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family.</a> Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).</li><li>L&#243;pez-Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+initiation+sites+of+eggplant+latent+viroid+strands+map+within+distinct+motifs+in+their+in+vivo+RNA+conformations.">The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations.</a> RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).</li></ol>

Även forskning av ELVd ordningsföljd och struktur krav inblandade i erkännandet av den aubergine tRNA-ligase, märkte vi att samtidig uttryck av båda molekyler i den icke-host E. coli ledde till en oväntat stor ackumulation av viroid cirkulär former i bakterieceller19. Vi förstod att stor ansamling av viroid RNA i E. coli troligen var en följd av samtidig uttrycker en mycket stabil RNA-molekyl, såsom den relativt liten (333 nt), mycket baserat-Parade, cirkulär viroid, o...

I motsats till DNA och proteiner är protokoll för lätt, effektiv och kostnadseffektiv produktion av stora mängder RNA inte riklig. Men, forskning och industri efterfrågan ökande mängder av dessa biomolekyler att undersöka deras unika biologiska egenskaper1, eller att vara anställd i sofistikerade biotekniska tillämpningar, inbegripet deras användning som mycket specifika aptamers 2, terapeutiska medel3eller selektiv bekämpningsmedel4. In vitro-transkription och kemisk syntes används ofta i forskning för att producera RNA. Dessa metoder innebär viktiga begränsningar när stora mängder av produkterna som krävs. Logiska alternativet är att använda den endogena transkription maskinen av levande celler, följt av en reningsprocess att separera RNASEN sevärdheter från cellulära följeslagare. Efter denna strategi har metoder utvecklats för att producera rekombinant RNAs i bakterieceller, såsom lab-vänliga Escherichia coli5 eller den marina lila phototrophic alpha-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. de flesta metoder att producera rekombinant RNA i bakterier lita på uttrycket av en infödd mycket stabil RNA byggnadsställning, såsom en tRNA eller en rRNA, där RNA av intresse är isatt7. Detta ställer nödvändigheten av att släppa RNA av intresse ur chimära molekylen, om förekomsten av extra RNA är ett problem för den efterföljande program8. Ett annat begrepp i rekombinant RNA bioteknik är produktionen av rekombinant ribonukleoprotein-komplex som kan vara den önskade produkten i sig. eller används som en skyddande strategi för att öka stabiliteten i RNA av intresse9, 10. Likaså har produktionen av cirkulär RNAs också föreslagits som en strategi för att generera mer stabila produkter11.
Vi har nyligen utvecklat en ny metod för att producera stora mängder rekombinant RNA i E. coli som deltar i tre av ovanstående begrepp: införande av RNA av intresse i en mycket stabil cirkulär RNA byggnadsställning och samtidig uttryck för den rekombinant RNA med en samverkande protein till sannolikt producera en stabil ribonukleoprotein komplex som ackumuleras i anmärkningsvärda mängder i bakteriell celler12. I motsats till tidigare utveckling använde vi en RNA byggnadsställning helt främmande för E. coli, nämligen en viroid. Viroider är en mycket speciell typ av smittämnen av högre växter som uteslutande består av en relativt liten (246-401 nt) mycket bas-parat cirkulär RNA13. Intressant, viroider icke-kodande RNAs och utan någon hjälp från sina egna proteiner, de ska kunna slutföra komplexa smittsamma cykler i den infektera värdar14. Dessa cykler inkludera RNA-till-RNA replikeringen i kärnor eller kloroplaster, beroende på familjen viroid —Pospiviroidae eller Avsunviroidae, respektive — rörelse genom den smittade anläggningen och skatteflykt av värd defensiva svar. Viroider måste rangordnas bland de mest stabila RNAs i naturen, till följd av att en naken cirkulär RNA och med att överleva i den ogästvänliga miljön i anläggningen infekterade celler. Detta boende kan göra viroider särskilt lämplig som ställningar att stabilisera rekombinant RNA i biotekniska metoder. Dessutom, är den nya metoden baserad på Co uttryck för viroid ställningen med ett samverkande växtprotein. Viroider replikera genom en rullande-cirkel mekanism i vilken värd enzymer rekryteras för att katalysera de olika stegen i processen. Särskilt vissa viroider, närmare bestämt de som tillhör familjen Avsunviroidae15, innehåller ribozymerna som också deltar i replikeringen. Beroende på viroid Art medieras transkription av viroid RNAs av värden RNA-polymeras II eller chloroplastic kärn-kodade RNApolymerasen (NEP). Viroid RNA bearbetning verkar vara katalyseras av en värd typ III RNase, även om i viroider med ribozymerna Oligomera RNA klyva intermediärer själv under replikeringen. Slutligen, de resulterande viroid monomersna är circularized, beroende på familjen viroid, genom den värd DNA-ligase 1 eller den chloroplastic isoformen tRNA ligase16,17. Detta sista enzym är involverat i ligering av monomera former av viroider i familjen Avsunviroidae, som aubergine latent viroid (ELVd)18.
I ett arbete att analysera sekvens och strukturella krav i ELVd bestämma erkännande av äggplanta (Solanum melongena L.) tRNA ligase, vi satt upp ett experimentella system baserat på samtidig uttryck av båda molekyler i E. coli 19. vi märkte att längre-än-unit ELVd avskrifter själv klyva effektivt i E. coli celler via den inbäddade hammerhead ribozymerna och att de resulterande viroid monomersna med 5'-hydroxylgruppen och 2', 3'-phosphodiester termini var effektivt circularized av ligase med samtidig uttryckt aubergine i tRNA. Ännu mer, nådde den resulterande cirkulär viroid RNA en oväntat hög koncentration i E. coli, överstiger de av endogena rRNAs12. Avsaknad av replikering intermediärer anges bristande ELVd RNA-till-RNA amplifiering i dessa bakterieceller. Intressant, hade införande av heterologa RNAs i ett visst läge av viroid molekylen en måttlig effekt på ackumulering av cirkulär viroid-derived RNAs12. Dessa observationer fick oss att föreställa sig en metod för att producera stora mängder rekombinant RNAs i bakterier. I denna metod, de cDNAs som motsvarar RNASEN sevärdheter infogas i den ELVd cDNA och den resulterande chimära RNA uttrycks i E. coli genom en stark konstitutiva promotorn. För att systemet ska fungera, måste E. coli omvandlas tillsammans med en plasmid att uttrycka den aubergine tRNA-ligase. ELVd-derived längre-än-enheten utskriften bearbetas av den inbäddade hammerhead ribozymerna och de resulterande monomersna med lämpliga termini är erkänt och circularized av de Co uttryckt tRNA-ligase. Detta sätt sätts RNA av intresse in i en mycket stabil cirkulär byggnadsställning bestående av viroid cirkulär molekylen. Detta rekombinant chimär RNA är troligen ytterligare stabiliseras inne i E. coli cellerna genom bildandet av en komplex genom interaktion med tRNA ligase ribonukleoprotein. Med den här metoden (se protokoll nedan), RNA aptamers, hårnål RNAs och andra strukturerade RNAs har enkelt produceras i mängder på tiotals milligram per liter av E. coli kultur i regelbundna laboratoriemiljö och renas till homogenitet tar Fördelen med loopkontroll12.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bpi I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010</td>
			<td>D1 low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131008.1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>Ba2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>48045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>X1402.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131785.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucloSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>22740588.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69387-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115(DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref. Timmons et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C 0113.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1211</td>
			<td>87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131509.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122333.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131020.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>FE04791000</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3691,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap DEAE Sepharose FF column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5055-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTAprime plus liquid chromatography system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>11001313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamyde</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1089,1000</td>
			<td>2K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>146392.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2940,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0937,2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Bis(acryloyl)cystamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4929-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli

Med ökande intresse för RNA-biologi och användning av RNA-molekyler i sofistikerade biotekniska tillämpningar, är metoder att producera stora mängder rekombinant RNAs begränsad. Här beskriver vi ett protokoll för att producera stora mängder rekombinant RNA i Escherichia coli baserat på samtidig uttryck för en chimär molekyl som innehåller RNA intresse en viroid byggnadsställning och en växt tRNA ligase. Viroider är relativt små, icke-kodande, mycket bas-parat cirkulär RNAs som är smittsamma till högre växter. Mottagande anläggningen tRNA ligase är ett enzym som rekryterats av viroider som tillhör familjen Avsunviroidae, såsom aubergine latent viroid (ELVd), för att medla RNA circularization under viroid replikering. Även om ELVd inte replikeras i E. coli, en ELVd föregångare är effektivt transkriberas av E. coli RNApolymerasen och bearbetas av den inbäddade hammerhead ribozymerna i bakterieceller, och de resulterande monomersna är circularized av den tillsammans uttryckt tRNA ligase når en anmärkningsvärd koncentration. Införandet av en RNA av intresse i ELVd ställningen möjliggör produktion av tiotals milligram rekombinant RNA per liter bakteriekulturen i regelbundna laboratorieförhållanden. En huvudsakliga bråkdel av produktens RNA är cirkulär, en funktion som underlättar rening av rekombinant RNA till virtuella homogenitet. I detta protokoll infogas ett kompletterande DNA (cDNA) motsvarande RNA sevärdheter i en viss position av den ELVd cDNA i ett uttryck plasmiden som används, längs plasmiden tillsammans uttrycka aubergine tRNA ligase, för att omvandla E. coli. Samtidig uttryck av båda molekyler under kontroll av stark konstituerande initiativtagare leder till produktion av stora mängder rekombinant RNA. Rekombinant RNA kan utvinnas från bakteriecellerna och separerade från huvuddelen av bakteriell RNAs utnyttja dess loopkontroll.

För att producera rekombinant RNA i E. coli använda ELVd-härledda system12, ympas RNA sevärdheter in i en ELVd RNA byggnadsställning. Denna chimär RNA är samtidig uttryckt längs den aubergine tRNA-ligase i E. coli. När behandlat, klyvs och circularized, bildar chimär cirkulär RNA, som sticker ut RNA av intresse, sannolikt ett komplex med samtidig uttryckt aubergine enzymet som når anmärkningsvärda koncentration i bakteriecellerna (<s...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Storskalig produktion av rekombinant RNAs på en cirkulär byggnadsställning Viroid-härledda System med i Escherichia coli

Här presenterar vi ett protokoll för att producera stora mängder rekombinant RNA i Escherichia coli genom samtidig uttrycker en chimär RNA som innehåller RNA intresse en viroid byggnadsställning och en växt tRNA ligase. Den viktigaste produkten är en cirkulär molekyl som underlättar rening till homogenitet.

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Denna metod kan bidra till att producera stora mängder rekombinanta RNAs av intresse för tillämpning inom forskning eller industri. Den största fördelen är att rekombinant RNA produceras i Escherichia coli i en billig process som lätt kan skalas upp. Viktigt är att RNA produceras på en cirkulär RNA-byggnadsställning, vilket underlättar rening till homogenitet.I motsats till DNA eller proteiner, RNAs av intresse är inte lätt produceras i stora mängder i biofabriker, en sådan Escherichia coli kultur. Vår metod bygger på co-uttryck för RNA av intresse införas i en mycket stabil cirkulär byggnadsställning och tillämpa en ligase som förmedlar RNA cirkulärisering. Den cirkulära RNA-byggnadsställningen härstammar från en patenterad viroid.Viroider är relativt små, icke-spolering, mycket bas-parade cirkulära RNAs som är smittsamma för vissa högre växter. Vi kan producera tiotals milligram av rekombinant RNA per liter bakteriekultur i vanliga laboratorieförhållanden. För att påbörja denna procedur, förstärka cDNA genom PCR som beskrivs i textprotokollet.Därefter lägger du till 100 nanogram av plasmid pLELVd-BZB till ett 0,5 milliliterrör. Lägg till 10 U av typ IIS-restriktionsenzymet BpiI och tillräckligt av buffert G för att skapa en 20 mikroliterreaktion. Inkubera vid 37 grader Celsius i en timme för att smälta plasmiden.Efter detta, separera PCR och rötningsprodukter genom elektrofores i en en procent agarosgel i TAE buffert. Fläcka gelen genom att skaka den i 200 milliliter ethidiumbromid vid en koncentration av 0,5 mikrogram per milliliter. Med hjälp av en UV-transilluminator, visualisera DNA.Använd en skalpell för att skära ut de band som motsvarar den förstärkta cDNA och BpiI rötad plasmid. Med hjälp av kiselgelkolumner elar du DNAs från gelfragmenten. Kvantifiera koncentrationen av DNA:t genom spektrofotometrisk analys.Inrätta en Gibson församlingen reaktion med hjälp av förstärkt cDNA och smält plasmid. Inkubera vid 50 grader Celsius i en timme. Använd sedan en kiselgelkolonn för att rena reaktionen.Efter electroporating kompetent E.coli DH5-Alpha Celler, plocka flera vita kolonier och överföra dem till flytande LB medium. Odla kolonierna över natten vid 37 grader Celsius. Därefter använder en miniprep kit för att rena plasmiderna, och analysera deras storlekar genom elektrofores i en en procent agarose gel i TAE buffert.Först co-electroporate den valda E.coli stam med både pLELVd-BZB derivat som innehåller cDNA motsvarar RNA av intresse och plasmiden P15LTRNISM att co-express aubergine tRNA ligase. Överför SOC flytande medium i elektroporationen cuvette att återvinna cellerna, och inkubera vid 37 grader Celsius i en timme. Sedan, platta bakterierna på LB fast medium som innehåller 50 mikrogram per milliliter ampicillin, och 34 mikrogram per milliliter kloramfenikol.Inkubera vid 37 grader Celsius över natten. Nästa dag, tillsätt 250 milliliter flytande TB medium, som innehåller 50 mikrogram per milliliter ampicillin, och 34 mikrogram per milliliter kloramfenikol, till en en liter förbryllad Erlenmeyer kolv. Hämta den ruvade E.Coli, och välj sedan en koloni och inokulera mediet i kolven.Inkubera vid 37 grader Celsius med kraftig skakning vid 180 RPM i 12 till 16 timmar innan du skördar bakterierna. Häll den skördade E.Coli-kulturen i en 250 milliliter centrifugflaska och snurra ner cellerna vid 14, 000 G i 10 minuter. Kasta supernatanten och resuspend cellerna i 30 milliliter vatten.Överför denna suspension till ett centrifugrör, och snurra ner cellerna igen med hjälp av de tidigare förhållandena. Kassera supernatanten och tillsätt 10 milliliter kromatografibuffert till cellpelletsen. Vortex för att återanvända cellerna i bufferten.Tillsätt en volym av fenol:kloroform och virvel kraftigt för att bryta cellerna. Sedan centrifug vid 12, 000 G i 10 minuter. Återvinna vattenfasen, tillsätt en volym av kloroform, och virvel kraftigt.Centrifugera vid 12, 000 G i 10 minuter. Efter detta filtrerar du RNA-preparatet genom ett 45 mikrometersprutfilter. Rena RNA med hjälp av en en milliliter diethyl etanol kolonn ansluten till ett vätskekromatografi system.Justera flödeshastigheten till en milliliter per minut, och jämvikt kolumnen med 10 milliliter av kromatografi buffert. Därefter, ladda provet och tvätta kolonnen med 10 milliliter av kromatografi buffert. Elute RNA med 20 milliliter eluer buffert, och samla en milliliter alikvoter.Med hjälp av tvådimensionell polyakrylamidgelelektrofores, separera de cirkulära RNA från sina linjära motsvarigheter. Först förbereda en fem procent polyakrylamid gel i TBE buffert och innehåller åtta molar urea som beskrivs i textprotokollet. Blanda 20 mikroliter av RNA-preparaten med en volym lastningsbuffert.Inkubera vid 95 grader Celsius i ett värmeblock i 1,5 minuter, och sedan snap-cool på is. Ladda proverna i polyakrylamidgelen och kör elektroforesen vid lämpliga förhållanden för geldimensionen. Efter detta, fläcka gelen i 0,5 mikrogram per milliliter ethidiumbromid i 15 minuter.Tvätta den färgade gelen med vatten, och visualisera sedan RNA i UV-belysning. Elektroforesisk analys av flera rekombinanta plasmider där olika cDNAs sätts in visar olika migrationer vid jämförelse med pLELVd-BZB. Observera att pLELVd-BZB innehåller lacZ markören, som ersätts av cDNA motsvarar RNA av intresse, så medan migrationen beror på storleken på den insatta cDNA, kommer rekombinanta plasmider brukar migrera snabbare än kontrollplasmid.Produktionen av det rekombinanta RNA i co-electroporated bakteriekulturer övervakas genom att bryta cellerna och analysera RNA genom denaturering SIDA. Starka musikband kan ses, som motsvarar till tomma ELVd, och chimeric ELVd bildar, som olika RNAs av intresserar insattes i. Intressant nog ses en stor del av det rekombinanta RNA som en cirkulär form.Den huvudsakliga fraktionens cirkuläritet observeras genom att använda en kombination av två PAGes under denatureringsförhållanden vid hög och låg jonisk styrka. RNA-preparatet kan renas ytterligare genom anjonutbyteskromatografi. Som ses här, E.Coli RNA är effektivt behålls vid låg jonisk styrka, och därefter eluted vid hög jonisk styrka, med de flesta av RNA samlas in i fraktioner två och tre.Rekombinant RNA kan ytterligare renas till homogenitet genom 2-D-elektrofores. Detta protokoll möjliggör enkel produktion av stora mängder rekombinant RNA i Escherichia coli och rening till homogenitet tack vare den cirkulära slutprodukten. Kom ihåg att RNA av intresse resultat inbäddade i en cirkulär RNA byggnadsställning som härrör från en växt viroid.Om du vill separera båda moieties, måste du använda en standardstrategi, såsom ribozymes, DNAzymes eller RNase H.Avkastningen av detta protokoll beror på den särskilda RNA av intresse, som små RNAs sannolikt kommer att produceras i högre mängder än större. För större skala uttryck, ta hänsyn till att optimal tid att skörda bakterier beror på många faktorer, inklusive E.Coli stam, kultur medium, och odlingsförhållanden. Vi rekommenderar en preliminär tid kurs analys för att hitta den optimala produktionsfönstret i dina särskilda förhållanden.Kom ihåg att de rekombinanta RNA ackumuleras i bakterieceller övergående, och att de helt försvinner vid den senväxande fasen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Riktad Protein Förpackning inom yttre membranvesiklar från<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Design, produktion och rening

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detektering av den pH-beroende aktivitet för<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; och<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Kvantifiering av överflödet och laddning nivåer av överföring RNAs i Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En enkel metod för hög genomströmning kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Webbplats riktad mutagenes för In Vitro och i Vivo experiment exemplifieras med RNA interaktioner i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Användning av Alu Element som innehåller Minigenes för att analysera cirkulära RNA

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Rengörings medel-assisterad beredning av rekombinant Drosophila Atlastin i liposomer för lipid-blandning assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Platsspecifik lysin acetylering av histoner för nukleosomkonstitution med hjälp av genetisk kodexpansion i Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...