Name: large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

Bu eser hibe BIO2017-83184-R ve BIO2017-91865-EXP gelen İspanyol "gayri resmi" de Ciencia, Innovación y Universidades (ortak sermayeli FEDER fonlar) tarafından desteklenmiştir.

1. plazmid İnşaat
<ol><li>
PCR (veya Ters transkripsiyon bir RNA şablonundan yola PCR) yükseltmek RNA ifade plazmid derlemeye izin vermek için 5' uzantısıyla primerler kullanılarak ilgi karşılık gelen cDNA. İstenmeyen mutasyonlar önlemek için yüksek sadakat DNA polimeraz kullanın.
	<ol>
<li>CDNA ifade plazmid Gibson derleme20tarafından eklemek için aşağıdaki 5' uzantıları PCR astar ekle: ileri, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; geri...

<ol>
	<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Research+on+Non-Coding+Ribonucleic+Acid+(RNA).">Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA).</a> Genes. 8 (12), (2017).</li><li>Hamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+silico+approaches+to+RNA+aptamer+design.">In silico approaches to RNA aptamer design.</a> Biochimie. 145, 8-14 (2018).</li><li>Bobbin, M. L., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+(RNAi)-Based+Therapeutics:+Delivering+on+the+Promise?.">RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise?.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).</li><li>Airs, P. M., Bartholomay, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Interference+for+Mosquito+and+Mosquito-Borne+Disease+Control.">RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control.</a> Insects. 8 (1), 4 (2017).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+expression+and+purification+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Methods. 54 (2), 267-273 (2011).</li><li>Kikuchi, Y., Umekage, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+nucleic+acids+of+the+marine+bacterium+Rhodovulum+sulfidophilum+and+recombinant+RNA+production+technology+using+bacteria.">Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria.</a> FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268 (2018).</li><li>Ponchon, L., Dardel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+RNA+technology:+the+tRNA+scaffold.">Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold.</a> Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).</li><li>Batey, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+methods+for+native+expression+and+purification+of+RNA+for+structural+studies.">Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies.</a> Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).</li><li>El Khouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+RNA-Protein+Complexes+in+Escherichia+coli.">Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli.</a> Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).</li><li>Ponchon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-expression+of+RNA-protein+complexes+in+Escherichia+coli+and+applications+to+RNA+biology.">Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology.</a> Nucleic Acids Research. 41 (15), e150 (2013).</li><li>Umekage, S., Kikuchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+production+and+purification+of+circular+RNA+aptamer.">In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer.</a> Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).</li><li>Dar&#242;s, J. -. A., Aragon&#233;s, V., Cordero, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+viroid-derived+system+to+produce+large+amounts+of+recombinant+RNA+in+Escherichia+coli.">A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1904 (1904).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids:+small+noncoding+infectious+RNAs+with+the+remakable+ability+of+autonomous+replication.">Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication.</a> Current Research Topics in Plant Virology. , 295-322 (2016).</li><li>Flores, R., Hern&#225;ndez, C., Mart&#237;nez de Alba, A. E., Dar&#242;s, J. A., Di Serio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroids+and+viroid-host+interactions.">Viroids and viroid-host interactions.</a> Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).</li><li>Di Serio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICTV+Virus+Taxonomy+Profile:+Avsunviroidae.">ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae.</a> The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).</li><li>Nohales, M. A., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viroid+RNA+redirects+host+DNA+ligase+1+to+act+as+an+RNA+ligase.">Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).</li><li>Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+chloroplastic+isoform+of+tRNA+ligase+in+the+replication+of+viroids+belonging+to+the+family+Avsunviroidae.">Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae.</a> Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).</li><li>Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eggplant+latent+viroid:+a+friendly+experimental+system+in+the+family+Avsunviroidae.">Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae.</a> Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).</li><li>Cordero, T., Ortol&#224;, B., Dar&#242;s, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+Analysis+of+Eggplant+Latent+Viroid+RNA+Circularization+by+the+Eggplant+tRNA+Ligase+in+Escherichia+coli.">Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli.</a> Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans.">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).</li><li>Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-dimensional+electrophoretic+technique+for+the+detection+of+circular+viroids+and+virusoids.">A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids.</a> Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).</li><li>Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+electrophoretic+properties+of+solubilizable+disulfide+gels.">Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels.</a> Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).</li><li>Gigu&#232;re, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+the+structures+of+all+members+of+the+Avsunviroidae+family.">Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family.</a> Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).</li><li>L&#243;pez-Carrasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+initiation+sites+of+eggplant+latent+viroid+strands+map+within+distinct+motifs+in+their+in+vivo+RNA+conformations.">The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations.</a> RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).</li></ol>

ELVd sırası ve yapısı gereksinimleri tanıma patlıcan tRNA ligaz ile ilgili araştırma yaparken, biz liderliğindeki viroid dairesel büyük beklenmedik bir birikimi olmayan ana bilgisayar E. coli hem moleküllerin Co bu ifadeyi fark formları bakteri hücreleri19. Biz viroid RNA E. coli olarak büyük birikimi en büyük olasılıkla son derece kararlı bir RNA molekülü, nispeten küçük gibi ortak ifade sonucu olduğunu anladım (333 nt), son derece dayalı eşleştiri...

DNA ve proteinler aksine kolay, verimli ve düşük maliyetli üretim RNA büyük miktarda protokollerde bol değildir. Ancak, biyoteknolojik uygulamaları, çok özel aptamers olarak bunların kullanımı da dahil olmak üzere araştırma ve Sanayi talep onların benzersiz biyolojik özellikleri1araştırmak veya istihdam için bu biomolecules miktarda artan sofistike 2, terapötik ajanlar3veya selektif pestisit4. İn vitro transkripsiyon ve kimyasal sentez yaygın olarak araştırmada RNA üretmek için kullanılır. Ancak, büyük miktarda ürün gerekli olduğunda bu yöntemler önemli sınırlamalar gerektirecektir. Mantıksal alternatif hücresel arkadaşları faiz RNA'lar ayırmak için bir arıtma işlemi ardından yaşam hücrelerinin endojen transkripsiyon makine kullanmaktır. Bu stratejiyi yöntemleri geliştirilmiştir laboratuvar dostu gibi bakteri hücreleri içinde rekombinant RNA'ların üretmek için Escherichia coli5 veya deniz mor Kemotrofik Alfa-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. bir tRNA ya da RNA ilgi olduğu bir rRNA7eklenen gibi bakterilerde rekombinant RNA üretmek için pek çok yöntem bir yerel son derece kararlı RNA iskele ifade üzerinde güveniyor. İlave RNA varlığı8karşıdan akış uygulamaları için bir sorun ise bu çıkar chimeric molekül RNA bırakmadan gerekliliği getirir. Başka bir kavram olarak rekombinant RNA biyoteknoloji istenen ürün başına olabilir veya faiz9RNA kararlılığını artırmak için koruyucu bir strateji olarak kullanılan rekombinan Ribonükleoprotein kompleksleri yapımıdır, 10. Benzer şekilde, dairesel RNA'ların üretimi daha istikrarlı ürünleri11oluşturmak için bir strateji olarak sürülmüştür.
Biz son zamanlarda üç yukarıdaki kavramlar katılan E. coli rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için yeni bir yöntem geliştirdik: son derece kararlı bir dairesel RNA iskele ilgi RNA ve ortak bir ifade ekleme bakteriyel dikkate değer miktarlarda biriken büyük olasılıkla istikrarlı Ribonükleoprotein karmaşık üretmek için rekombinant RNA etkileşen bir protein ile12hücreleri. Aksine önceki gelişmeler, E. coliiçin yani bir viroid tamamen yabancı bir RNA iskele kullandık. Viroids sadece nispeten küçük tarafından (246-401 nt) oluşturulan daha yüksek bitkilerin bulaşıcı ajanlar çok özel bir türü vardır son derece Bankası eşleştirilmiş dairesel RNA13. İlginçtir, viroids RNA'ların kodlamayan ve kendi proteinler hiçbir yardımıyla, onlar virüslü ana14karmaşık bulaşıcı döngüleri tamamlamak mümkündür. Bu döngüleri çekirdeği veya kloroplast, viroid aile bağlı olarak RNA, RNA-RNA çoğaltma dahil —Pospiviroidae veya Avsunviroidae, sırasıyla — hareket virüslü bitki ve konak savunma yanıtının kaçakçılığı. Viroids doğada, çıplak bir dairesel RNA olmak ve enfekte bitki hücreleri düşmanca bir ortamda hayatta kalmak sahip bir sonucu olarak en istikrarlı RNA'ların arasında yer gerekir. Bu özellik viroids iskele rekombinant RNA biyoteknolojik yaklaşımlar stabilize etmek için özellikle uygun hale getirebilir. Buna ek olarak, yeni yöntemi ile etkileşen bir bitki protein viroid iskele iş ifade temel alır. Viroids hangi ana enzimler işleminin farklı adımları katalizler işe bir haddeleme-daire mekanizması ile çoğaltma. Özellikle bazı viroids, özellikle bu aile Avsunviroidae15' e, ait Ayrıca çoğaltmaya katılan çokluğunun içerir. Viroid tür bağlı olarak, viroid RNA transkripsiyonu RNA polimeraz II ana bilgisayar veya chloroplastic kodlanmış nükleer RNA polimeraz (NEP) tarafından aracılık ettiği. Viroid RNA işleme görünmek-e doğru ev sahibi tarafından katalize tip III RNase, her ne kadar viroids ile çokluğunun oligomeric RNA içinde ara ürün çoğaltma sırasında kendi kendine ayırmak. Son olarak, elde edilen viroid monomerleri, viroid aile bağlı olarak, ana bilgisayar DNA ligaz 1 veya chloroplastic izoformu tRNA ligaz16,17circularized. Bu son enzim ligasyonu patlıcan gizli viroid (ELVd)18gibi aile Avsunviroidae, viroids monomeric formları ilgilenmektedir.
Patlıcan (Solanum melongena L.) tarafından tanıma belirleyen sıralı ve yapısal gereksinimlerini ELVd analiz etmek için bir çalışma sırasında tRNA ligaz, biz ortak ifade E. coli hem moleküllerin dayalı deneysel bir sistem kurmak 19. biz birim daha uzun ELVd transkript verimli katıştırılmış hammerhead çokluğunun ile E. coli hücrelerde kendi kendine ayırmak olduğunu ve elde edilen viroid monomerleri ile 5'-hidroksil ve 2' 3'-fosfodiester termini olduğunu fark verimli bir şekilde birlikte ifade patlıcan tRNA ligaz tarafından circularized. Daha da, elde edilen dairesel viroid RNA E. coli, beklenmeyen bir yüksek konsantrasyon endojen rRNA'lar12olanların aşan ulaştı. Çoğaltma intermediates yokluğu ELVd RNA, RNA-RNA amplifikasyon bu bakteri hücreleri içinde eksikliği gösterilir. İlginçtir, viroid molekülünün belirli bir konumda Contegra RNA'ları ekleme döngüsel viroid kaynaklı RNA'ların12birikimi ılımlı bir etkisi vardı. Bu gözlem bize rekombinant RNA'ların bakterilerde büyük miktarlarda üretmek için bir yöntem öngörülüyor yaptı. Bu yöntemde, faiz RNA'lar için karşılık gelen cDNAs ELVd cDNA eklenir ve elde edilen chimeric RNA güçlü bir bünye organizatörü E. coli ifade edilir. Sistemin çalışması için E. coli patlıcan tRNA ligaz ifade etmek için bir plazmid ile birlikte dönüştürülmesi gerekir. ELVd elde edilen birim daha uzun transkript katıştırılmış hammerhead çokluğunun tarafından işlenir ve uygun termini ile elde edilen monomerleri tanınır ve ortak ifade tRNA ligaz tarafından circularized. Bu şekilde ilgi RNA çok kararlı bir dairesel iskele viroid dairesel molekülünün oluşan eklenir. Bu rekombinant chimeric RNA en büyük ihtimal daha fazla bir Ribonükleoprotein tRNA ligaz ile etkileşimi aracılığıyla karmaşık oluşumu tarafından E. coli hücrelerin içinde stabilize. Bu yöntemi kullanarak (bkz: protokolü aşağıdaki), RNA aptamers, saç tokası RNA'ların ve diğer yapısal RNA'ların edilmiş kolayca litre başına miligram E. coli kültür düzenli laboratuvar koşullarında onlarca miktarda üretilen ve alarak homojenliği için saf Döngüsellik12avantajı.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bpi I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Conda</td>
			<td>8010</td>
			<td>D1 low EEO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1086,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131008.1214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1152,0025</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>E2621S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Clean &#38; Concentrator</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D4003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eporator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli DH5&#945;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18265-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>Ba2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>48045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131659.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Intron Biotechnology</td>
			<td>25999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0839,0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-gal</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>X1402.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131785.1611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucloSpin Plasmid</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>22740588.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli BL21(DE3)</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>69387-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli HT115(DE3)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ref. Timmons et al., 2001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C 0113.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122329.1211</td>
			<td>87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131509.1210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>122333.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>131020.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>FE04791000</td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A3691,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur S 0.2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap DEAE Sepharose FF column</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-5055-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTAprime plus liquid chromatography system</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>11001313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamyde</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A1089,1000</td>
			<td>2K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7279-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>146392.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2940,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A0937,2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8026-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8242;-Bis(acryloyl)cystamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4929-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

large-scale production of recombinant rnas on a circular scaffold using a viroid-derived system in escherichia coli

Giderek artan bir ilgi RNA biyoloji ve sofistike biyoteknolojik uygulamaları RNA molekülleri kullanımı, rekombinant RNA'ların büyük miktarlarda üretmek için yöntemler sınırlıdır. Burada, biz bir viroid iskele ve bir bitki ilgi RNA içeren chimeric molekülünün ortak ifade dayalı Escherichia coli rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için bir protokol tarif tRNA ligaz. Viroids daha yüksek bitkilerin bulaşıcı nispeten küçük, kodlamayan, son derece Bankası eşleştirilmiş dairesel RNA'lar vardır. Ana bitki tRNA ligaz olan RNA daireselleşmesi viroid çoğaltma sırasında aracılık Avsunviroidae, patlıcan gizli viroid (ELVd), gibi ailesine ait viroids tarafından işe bir enzim. Her ne kadar ELVd E. coliçoğaltmak değil, bir ELVd öncül verimli E. coli RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu ve bakteri hücreleri içinde katıştırılmış hammerhead çokluğunun tarafından işlenen ve elde edilen monomerleri tarafından circularized ortak ifade tRNA ligaz dikkate değer bir konsantrasyon ulaşan. Bir RNA ilgi ELVd iskele içine ekleme normal laboratuvar koşullarında bakteriyel kültürünün litre başına rekombinant RNA miligram onlarca üretimini sağlar. RNA ürün ana bir kısmını yuvarlaktır sanal homojenliği için rekombinant RNA arıtma kolaylaştırır bir özellik. Bu protokol için tamamlayıcı DNA (cDNA) faiz RNA için karşılık gelen bir ELVd cDNA belirli bir pozisyon, patlıcan tRNA ligaz, ortak ifade etmek için plazmid E. colidönüştürmek için kullanılan bir ifade plazmid olarak eklenir. Güçlü kurucu Rehberleri kontrol altında her iki moleküllerin ortak ifade rekombinant RNA büyük miktarda üretim için açar. Rekombinant RNA bakteriyel hücrelerinden çıkarılan ve onun Döngüsellik yararlanarak bakteriyel RNA'ların toplu ayrılmış.

Rekombinant RNA E. coli ELVd kaynaklı sistem12kullanarak üretmek için faiz RNA bir ELVd RNA iskele aşılı. Bu chimeric RNA E. colipatlıcan tRNA ligaz boyunca ortak ifade. İşlenen, i ciddi ve circularized sonra chimeric dairesel RNA, RNA ilgi içinden dışarı çıkar, büyük olasılıkla bir Ribonükleoprotein bakteri hücreleri ( dikkat çekici konsantrasyon ulaşır ortak ifade patlıcan enzim ile karmaşık formla...

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli at JoVE.com

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Escherichia coli içinde Viroid kaynaklı bir sistemi kullanarak dairesel bir iskele üzerinde rekombinant RNA'ların büyük ölçekli üretim

Burada, ortak ilgi bir viroid iskele ve bir bitki RNA içeren bir chimeric RNA ifade ederek Escherichia coli rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için bir protokol mevcut tRNA ligaz. Ana ürün arıtma homojenliği için kolaylaştırır dairesel bir moleküldür.

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

Bu yöntem, araştırma veya endüstride uygulama için ilgi rekombinant RNA büyük miktarlarda üretmek için yardımcı olabilir. Ana avantajı rekombinant RNA kolayca ölçeklendirilebilir ucuz bir süreç içinde Escherichia coli üretilmektedir. Daha da önemlisi, RNA homojenliğe saflaştırmayı kolaylaştıran dairesel bir RNA iskelesi üzerinde üretilir.DNA veya proteinlerin aksine, rna'lar biyofabrika sistemlerinde, böyle bir Escherichia coli kültüründe kolayca üretilmez. Yöntemimiz, son derece istikrarlı bir dairesel iskeleye yerleştirilen ilgirRRr'In ortak ifadesine ve RNA daireselleşmesine aracılık eden bir ligaz uygulanmasına dayanmaktadır. Dairesel RNA iskelesi patentli bir viroidden türeyen bir iskeledir.Viroidler nispeten küçük, kıvrımsız, yüksek baz eşleştirilmiş dairesel RNA'lar bazı yüksek bitkilere bulaşıcıdır. Düzenli laboratuvar koşullarında bakteri kültürünün litre başına rekombinant RNA miligramonlarca üretebilir. Bu yordamı başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi PCR tarafından cDNA'yı yükseltin.Daha sonra, 0.5 mililitrelik bir tüp e plazmid pLELVd-BZB 100 nanogram ekleyin. Tip IIS restriksiyon enzimi BpiI 10 U ekleyin ve 20 mikrolitre reaksiyon oluşturmak için yeterli tampon G. Plazmidi sindirmek için bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat.Bundan sonra, PCR ve sindirim ürünleri elektroforez ile TAE tampon yüzde bir agarose jel ayrı. 200 mililitre ethidium bromür mililitre başına 0,5 mikrogram konsantrasyonda sallayarak jel leke. UV transilluminator kullanarak, DNA'yı görselleştirin.Güçlendirilmiş cDNA ve BpiI sindirilmiş plazmid karşılık gelen bantları kesmek için bir neşter kullanın. Silika jel sütunları kullanarak, jel parçaları NDAN NA'ları uzaklaştırın. DNA konsantrasyonunu spektrofotometrik analizle ölçün.Güçlendirilmiş cDNA ve sindirilmiş plazmid kullanarak Gibson Montaj reaksiyonu ayarlayın. Bir saat liğine 50 derecede kuluçkaya yat. Sonra, reaksiyon arındırmak için bir silika jel sütun kullanın.Yetkili E.coli DH5-Alfa Hücreleri elektroporating sonra, birkaç beyaz koloniler seçin ve sıvı LB orta aktarın. Kolonileri bir gecede 37 derecede büyütün. Daha sonra, plazmidleri arındırmak için bir miniprep kiti kullanın ve TAE tamponyüzde bir agarose jel elektroforez ile boyutlarını analiz.İlk olarak, seçilen E.coli türünü, patlıcan tRNA ligazını birlikte ifade etmek için rdna'ya karşılık gelen cDNA'yı ve plazmid P15LTRNISM'i içeren pLELVd-BZB türevi ile birlikte elektroporate. Hücreleri kurtarmak için soc sıvı ortamını elektroporasyon cuvette'sine aktarın ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, mililitre ampisilin başına 50 mikrogram ve mililitre kloramfenikol başına 34 mikrogram içeren LB katı ortamda bakteri plaka.Bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yat. Ertesi gün, mililitre ampisilin başına 50 mikrogram ve mililitre kloramfenikol başına 34 mikrogram içeren 250 mililitre sıvı TB ortamını bir litrelik şaşkın Erlenmeyer şişesine ekleyin. Kuluçkaya yatan E.Coli'yi alın ve sonra bir koloni seçin ve şişedeki ortamı aşılayın.Bakterileri hasat etmeden önce 180 RPM'de 12 ila 16 saat boyunca güçlü bir şekilde sallayarak 37 derecede kuluçkaya yatırın. Hasat edilen E.Coli kültürünü 250 mililitrelik bir santimetre şişeye dökün ve 14,000 G'de hücreleri 10 dakika boyunca aşağı çevirin. Supernatant atın ve su 30 mililitre hücreleri resuspend.Bu süspansiyonu bir santrifüj tüpüne aktarın ve önceki koşulları kullanarak hücreleri tekrar aşağı çevirin. Supernatant atın ve hücre pelet kromatografi tampon 10 mililitre ekleyin. Vortex arabellekteki hücreleri yeniden askıya almak için.Fenol bir hacim ekleyin: kloroform ve girdap şiddetle hücreleri kırmak için. Sonra, 12, 000 G'de 10 dakika santrifüj. Sulu fazı geri kazanım, bir hacim kloroform ekleyin ve girdap şiddetle.12,000 G'de 10 dakika santrifüj. Bundan sonra, RNA preparatını 45 mikrometreşırık filtresinden filtreleyin. Sıvı kromatografi sistemine bağlı bir mililitre likit etanol amin sütunu kullanarak RNA'yı arındırın.Akış hızını dakikada bir mililitreye ayarlayın ve kolonu 10 mililitre kromatografi tamponuyla dengeleyin. Daha sonra, örnek yük ve kromatografi tampon 10 mililitre ile sütun yıkayın. 20 mililitre elütion tamponu ile RNA elute ve bir mililitre aliquots toplamak.İki boyutlu poliakrilamid jel elektroforez kullanarak dairesel RNA'ları doğrusal benzerlerinden ayırır. İlk olarak, TBE tampon yüzde beş poliakrilamid jel hazırlamak ve metin protokolünde belirtildiği gibi sekiz azı üre içeren. 20 mikrolitre RNA preparatını bir hacim yükleme tamponuyla karıştırın.Bir ısıtma bloğunda 95 derecede 1,5 dakika kuluçkaya yat, sonra da buzüzerinde soğutun. Örnekleri poliakrilamid jeline yükleyin ve elektroforezi jel boyutu için uygun koşullarda çalıştırın. Bundan sonra, 15 dakika boyunca mililitre ethidium bromür başına 0,5 mikrogram jel leke.Lekeli jeli suyla yıkayın ve Uv ışığı altında RNA'yı görselleştirin. Farklı cDNA'ların yerleştirildiği çeşitli rekombinant plazmidlerin elektroforetik analizi pLELVd-BZB ile karşılaştırıldığında farklı göçler göstermektedir. pLELVd-BZB'nin, ilginin RNA'sına karşılık gelen cDNA ile değiştirilen lacZ işaretçisini içerdiğini unutmayın, bu nedenle geçiş eklenen cDNA'nın boyutuna bağlı yken, rekombinant plazmidler genellikle kontrol plazmidinden daha hızlı göç eder.Co-elektroporated bakteri kültürlerinde rekombinant RNA üretimi hücreleri kırma ve PAGE denatüre tarafından RNA analiz tarafından izlenir. Farklı RNA'ların yerleştirildiği boş ELVd ve şemerik ELVd formlarına karşılık gelen güçlü bantlar görülebilir. İlginçtir, rekombinant RNA önemli bir kısmını dairesel bir form olarak görülüyor.Ana fraksiyonun daireselliği, yüksek ve düşük iyonik mukavemette denatüre koşullar altında iki PAGE kombinasyonu kullanılarak gözlenir. RNA preparatı, aniyon değişimi kromatografisi ile daha da saflaştırılabilir. Burada görüldüğü gibi, E.Coli RNA verimli düşük iyonik mukavemette tutulur, ve daha sonra yüksek iyonik mukavemette eluted, RNA çoğu kesirler iki ve üç toplanan ile.Rekombinant RNA 2-B elektroforez ile homojenliğe daha da arındırılabilir. Bu protokol, escherichia coli'de büyük miktarlarda rekombinant RNA'nın kolay üretilmesine ve nihai ürünün daireselliği sayesinde homojenliğe saflaştırılmasına olanak sağlar. Bir bitki viroidinden elde edilen dairesel Bir RNA iskelesine gömülü rna faiz sonuçları olduğunu unutmayın.Her iki moieties ayırmak istiyorsanız, küçük RNA büyük olanlardan daha yüksek miktarlarda üretilmesi muhtemeldir, bu protokolün verimi ilgi belirli RNA bağlıdır ribozymes, DNAzymes veya RNase H.The gibi standart bir strateji kullanmanız gerekir. Daha büyük ölçekli ifadeler için, bakterileri hasat etmek için en uygun zamanın E.Coli suşu, kültür ortamı ve yetiştirme koşulları gibi birçok faktöre bağlı olduğunu göz önünde bulundurun. Özel koşullarınızda en uygun üretim penceresini bulmak için bir ön zaman kursu tgelincesi öneririz.Rekombinant RNA'ların bakteri hücrelerinde geçici olarak biriktiğini ve geç büyüme evresinde tamamen yok olduklarını unutmayın.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Miktar bolluk ve Escherichia coli olarak Transfer RNA'ların düzeyde şarj

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site yönettiği Mutagenesis in Vitro ve Escherichia Coli etkileşimlerde RNA ile örneği Vivo deneyler için

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

Dairesel RNA'ları Analiz Etmek Için Minigen İçeren Alu Elementin Kullanımı

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Escherichia coli'de Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Nükleozom Rekonses için Histonların Siteye Özgü Lizin Asetilasyonu

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...