Name: an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues at JoVE.com

Denne undersøgelse var sponsoreret af et tilskud af forskning fond KU Leuven (OT/14/097) givet til RH. TRV var postdoc stipendiat af CVE Research Foundation - Flandern (Belgien; Giver nummer - 12K0916N) og RH understøttes af klinisk forskning fond UZ Leuven.

1. forberede Graft væv til In vitro- undersøgelser
Bemærk: Tre typer af væv blev brugt: kvæg hjertesækken patch (BP), befrugtede Homograft (CH) og bovin halsfedt grafts (BJV). I tilfælde af BJV conduit og CH (væv behandles af den europæiske Homograft (EHB) og lagres i flydende nitrogen forudgående at bruge), blev både væg og utætte hjerteklapper foldere brugt. BP patch og BJV conduit blev købt fra producenter. Før brug, tø CH efter EHB instruktioner12</...

<ol>
	<li>Que, Y. A., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infective+endocarditis.">Infective endocarditis.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).</li><li>Werdan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+infective+endocarditis:+pathogen-host+interaction+and+risk+states.">Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states.</a> Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).</li><li>Moreillon, P., Que, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infective+endocarditis.">Infective endocarditis.</a> The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).</li><li>Jalal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+propensity+of+bovine+jugular+vein+material+to+bacterial+adhesions:+An+in+vitro+study.">Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study.</a> International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).</li><li>Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Review+of+Infective+Endocarditis+in+Patients+With+Bovine+Jugular+Vein+Valves+Compared+With+Other+Valve+Types.">A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types.</a> JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).</li><li>Malekzadeh-Milani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+predictors+of+Melody(R)+valve+endocarditis:+a+prospective+study.">Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study.</a> Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).</li><li>Hill, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+prosthetic+valve+infective+endocarditis.">Management of prosthetic valve infective endocarditis.</a> American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).</li><li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clumping+factor+A,+von+Willebrand+factor-binding+protein+and+von+Willebrand+factor+anchor+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall.">Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).</li><li>Fowler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+invasion+by+Staphylococcus+aureus+involves+a+fibronectin+bridge+between+the+bacterial+fibronectin-binding+MSCRAMMs+and+host+cell+beta1+integrins.">Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins.</a> European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).</li><li>Patti, J. M., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+adhesins+recognizing+extracellular+matrix+macromolecules.">Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).</li><li>Massey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-binding+protein+A+of+Staphylococcus+aureus+has+multiple,+substituting,+binding+regions+that+mediate+adherence+to+fibronectin+and+invasion+of+endothelial+cells.">Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).</li><li>Jashari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Belgian+and+European+experience+with+the+European+Homograft+Bank+(EHB)+cryopreserved+allograft+valves--assessment+of+a+20+year+activity.">Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity.</a> Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).</li><li>Cheatham, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+hemodynamic+outcomes+up+to+7+years+after+transcatheter+pulmonary+valve+replacement+in+the+US+melody+valve+investigational+device+exemption+trial.">Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial.</a> Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).</li><li>Que, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+fibronectin+binding+cooperate+for+valve+infection+and+invasion+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis.">Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).</li><li>Veloso, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adherence+to+graft+tissues+in+static+and+flow+conditions.">Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).</li><li>Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus,+master+manipulator+of+the+human+hemostatic+system.">Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).</li><li>Chiu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+increases+ICAM-1+and+decreases+VCAM-1+and+E-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-[alpha]+in+endothelial+cells.">Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).</li><li>Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+tissue+engineering:+a+new+laminar+flow+chamber+for+in+vitro+improvement+of+mechanical+tissue+properties.">Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties.</a> ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).</li><li>Veltrop, M. H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Species-+and+Strain-Dependent+Induction+of+Tissue+Factor+in+Human+Vascular+Endothelial+Cells.">Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).</li></ol>

Nylige kliniske observationer give særlig opmærksomhed til IE som en komplikation hos patienter har undergået ventil udskiftning af RVOT6,13. Dysfunktion af den implanterede ventil i IE er resultatet af bakteriel interaktion med for Intravaskulært transplantat fører til omfattende inflammatoriske og prokoagulant reaktioner1,14. Modellen præsenteres nye in vitro- tilladt os at undersøge hvi...

Staphylococcus aureus (S. aureus) beskæftiger en række virulens strategier til at omgå immunforsvaret værtssystemet koloniserer biologiske eller ikke-biologiske overflader implanteres i det menneskelige omsætning, hvilket fører til alvorlige intravaskulær infektioner såsom sepsis og IE1,2,3,4,5. IE er fortsat et vigtigt behandling forbundet komplikation hos patienter efter implantation af kunstige hjerteklapper mens individuelle faktorer, der bidrager til udbrud af IEare ikke endnu fuldt ud forstået6,7. Under strømningsforhold støder bakterier shear styrker, som de skal overvinde for at overholde fartøj væg8. Modeller, som gør det muligt at studere samspillet mellem bakterier og proteser ventil væv eller endotel under flow, er af interesse, da de afspejler i vivo situationen mere.
Flere specifikke mekanismer lette bakteriel tilslutning i endothelial celler (ECs) og til den eksponerede subendothelial matrix (ECM) fører til væv kolonisering og modning af vegetationen, er væsentlige tidlige trin i IE9. Forskellige stafylokokker overflade proteiner eller MSCRAMMs (mikrobielle overflade komponenter anerkende klæbende matrix molekyler) er blevet beskrevet som mediatorer af adhæsion værtsceller og ECM proteiner ved at interagere med molekyler såsom fibronektin, fibrinogen, kollagen og von Willebrands faktor (VWF)8,10,11. Men i betragtning af intra molekylære foldning af nogle virulens faktorer, for det meste studerede under statiske forhold, mange af disse interaktioner kan have forskellige relevans i endovaskulære infektioner i cirkulerende blod.
Derfor præsenterer vi en in-house designet i vitro parallel-plade flow kammer model, som giver mulighed for vurdering af bakteriel tilslutning til forskellige komponenter af ECM og ECs i forbindelse med væv grafts implanteret i RVOT position. Det overordnede formål med metoden i dette arbejde er at studere mekanismer af interaktion mellem bakterier og underliggende endovaskulære væv i flow betingelser, som er tæt knyttet til blodbanen patogener i vivo miljø som S. aureus. Denne nye fremgangsmåde fokuserer på modtagelighed for graft væv overflader til bakteriel tilslutning til at identificere potentielle risikofaktorer for udvikling af IE.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium</td>
			<td>Synovis Surgical Innovations, USA</td>
			<td>PC-0404SN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Jugular Vein conduits (BJV)</td>
			<td>Contegra conduit; Medtronic Inc, USA</td>
			<td>M333105D001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH cryopreserved homograft</td>
			<td>European Homograft Bank (EHB)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acu-Punch</td>
			<td>Acuderm Inc, USA</td>
			<td>P850 (8 mm); P1050 (10 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Albumin</td>
			<td>Flexbumin; Baxter, Belgium</td>
			<td>BE171464 
			LOT:16G12C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Fluka, Steinheim, Germany</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heart infusion broth (BHI)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS).</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>21878-100MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (MODEL ISM444B)</td>
			<td>Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>631942-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa</td>
			<td>142-6044</td>
			<td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td>
			<td>29027886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>87206462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6140.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well on Lumox detachable</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6150.101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel - surgical Blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Silicone Tubing, 1/8&#34;ID x 1/4&#34;OD</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-95702-06</td>
			<td>Temperature range: &#8211;80 to 200&#176;C 
			Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PharMed BPT Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>AY242012</td>
			<td>Autoclavable 30 min at 121&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon LMT-55 Tubing</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics&#8482;</td>
			<td>15312022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat</td>
			<td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td>
			<td>300-0042</td>
			<td>230V, 90VA, 50Hz</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues

Forskellige ventil ledningsanlæg og stent monterede ventiler bruges til højre ventrikel udstrømning tarmkanalen (RVOT) ventil udskiftning hos patienter med medfødt hjertesygdom. Når du bruger proteser materialer dog, er disse grafts modtagelige for bakterielle infektioner og forskellige vært svar.
Identifikation af bakterie og vært faktorer, der spiller en afgørende rolle for endovaskulære overholdelsen af mikroorganismer er af betydning for bedre at forstå Patofysiologi af udbrud af infektioner såsom infektiøs endocarditis (IE) og at udvikle forebyggende strategier. Udviklingen af kompetente modeller at undersøge bakteriel adhæsion fysiologiske shear betingelser er derfor nødvendigt. Her, beskriver vi brugen af en nyligt udformet i vitro perfusion kammer baseret på parallelle plader der giver mulighed for undersøgelse af bakteriel tilslutning til forskellige komponenter af transplantat væv såsom fritliggende ekstracellulære matrix, endotelceller og inert områder . Denne metode kombineres med kolonidannende enhed (CFU) tælle er tilstrækkelige til at vurdere graft materialer tilbøjelighed mod bakteriel adhæsion under flow. Yderligere kan på, flow kammer system bruges til at undersøge rollen af blodkomponenter i bakteriel adhæsion shear betingelser. Vi viste, at kilden til væv, deres overflade morfologi og bakteriearter specificitet ikke er de store afgørende faktorer i bakteriel tilslutning til pode væv ved hjælp af vores in-house designet i vitro perfusion model.

For bedre at forstå mekanismerne bag IE udvikling, denne model giver mulighed for evaluering af bakteriel og væv i forbindelse faktorer til stede i infektion debut i vivo situation.
Detaljeret, Roman i vitro tilgang gør det muligt for at kvantificere bakteriel adhæsion i strømningsforhold til forskellige graft væv af perfusing fluorescently mærket bakterier over væv øve shear understreger i de...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues at JoVE.com

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Vi beskriver en in-house designet i vitro flow kammer model, som giver mulighed for undersøgelse af bakteriel tilslutning til at pode væv.

En In Vitro Model af en Parallel-plade Perfusion System at studere bakteriel tilslutning til at pode væv

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i patogenesen af infektiøs endocarditis, og patobiograms gennem felter såsom samspillet mellem bakterier, blodlegemer, og endotelceller foring muskulatur. Den største fordel ved denne teknik er, at vævstransplantater kan være direkte udsat for gensidige interaktioner med forskellige mål, såsom bakterier, blodplader, og proteiner i standardiserede flow betingelser. Konsekvenserne af denne teknik omfatter vores behandling af infektiøs endocarditis, fordi det kan optrævle vigtige molekylære interaktioner og faktorer, der driver høj infektiøshed af visse væv.Denne metode giver indsigt i patogenesen af vegetationsdannelse. Det kan også anvendes i undersøgelser, der undersøger vaskulær permeabilitet, cellemobilitet og genecelleekspression. For at begynde protokollen, placere en tidligere forberedt væv biopsi 10 millimeter i diameter, og den samme tykkelse mellem et mikroskop dias og en otte millimeter cirkulær perforering, og en gummipakning med den indre overflade vender opad, at kontakte bakteriel suspension.Fokuser på vævstransplantor orienteringen, mens den placeres i holderen. Sørg for, at den indvendige overflade af vævet allerede er udsat for blodbanen ansigter op for at kontakte din eksperimentelle medium. Sæt derefter din holder med vævet i pakningsarket, der er indlejret i kammerets bundmeramme.Fastgør den øverste metalramme med den tilsvarende pakningsplade på bunden af kammeret med den tidligere indsatte vævsholder. Derefter monteres hele kammeret med otte skruer og skruedømninger. Sørg for, at kammerhøjden altid er den samme på tværs af grafts ved hjælp af en caliper eller lineal.Næste forbinde flow kammer med en peristaltisk pumpe. Tilslut derefter 400 millilitervæskebeholderen med rørene. Gennemgafler væv med 100 milliliter suspensioner af ti til de syv fluorescerende mærkede koloni danner enheder i fosfat buffered saltvand med ren og skær stress på tre dines per kvadratcentimeter og tilsvarende strømningshastighed på fire milliliter i minuttet i en time ved hjælp af peristaltiske pumpe og bakteriel reservoir.Recirkulation kontinuerligt 100 milliliter bakteriel suspension ved hjælp af samme indsamling reservoir. Efter perfusion, demontere kammeret for at frigive transplantatet. Vævsstykket vaskes to gange med fire milliliter PBS i en 12-brøndsplade med en orbitalshasker i tre minutter.Skær derefter den indre del af transplantatet ved hjælp af en hudbiopsi punch med en mindre diameter. Hvert vævsbiopsi anbringes i et separat 14 milliliterrør, der indeholder en milliliter steril 0,9 % natriumchlorid. Løsrive bakterierne fra vævet ved hjælp af et sonikeringsbad i 10 minutter.Der fremstilles et enkelt 14 milliliterrør med 10 milliliter steril 0,9 % natriumchlorid for at foretage serielle fortyndinger af bakteriesuspensionen opnået efter sonikering. Mærl røret nummer to. Der forberedes tre 14 milliliterrør med 10 milliliter steril 0,9 % natriumchlorid til serielle fortyndinger af den indledende bakterieaffjedring, der blev taget til eksfusionsforsøget.Mærl rørene nummer tre, nummer fire og nummer fem. Dernæst sikre tre agar plader, en for bakteriel perfusion, en for kontrol perfusion af PBS, og den tredje for den oprindelige bakteriel suspension anvendes til perfusions. Mærl tre sektorer pr. plade til vævseksperimentet på følgende måde:10-1, 10-3 og 10-4.Hvis du vil tælle antallet af kolonidannende enheder i bakterieperfusing, skal du mærke pladen som følger:10-1, 10-3, 10-5 og 10-7. Vortex rørene indeholder vævsbiopsi i 15 sekunder hver, for at gøre serielle fortyndinger. For at forberede de serielle fortyndinger, overføre 100 mikroliter af rør nummer et til rør nummer to, og vortex røret til grundigt at blande opløsningen.Spred 100 mikroliter af indholdet af rør nummer et og nummer to på de tilsvarende sektorer, 10-1 og 10-3 af agarpladen. Derefter spredes 10 mikroliter af rør nummer to på sektor 10 fire. Gentag dette trin fire gange for at opnå fire separate vækster fra hvert volumen på 10 mikroliter.For at forberede serielle fortyndinger af den oprindelige kultur, første vortex fortynding i 15 sekunder og overføre 100 mikroliter af bakteriel suspension til rør nummer tre, og bland kraftigt ved vortexing. Tilføj 100 mikroliter af rør nummer tre til rør nummer fire og bland igen. Proceduren for rør nummer fem fra rør nummer fire gentages.Spred 100 mikroliter af indholdet af rør nummer tre, nummer fire, nummer fem, og den mærkede oprindelige kultur henholdsvis på sektorer 10-3, 10-5, 10-7, og 10-1 af blodet agar plade. Lad blod agar plader under laminar hætte til lufttørre bakterielle spreads, typisk i 10 minutter. Derefter skal du placere pladerne ved 37 grader Celsius til natten inkubation.Efter natten inkubation, tælle de bakterielle kolonier for at opnå antallet af CFUs. Under ren og skær stress betingelser, lignende bakteriel vedhæftet fil på tværs af de forskellige graft væv blev observeret for både stafylokokker aureus og stafylokokker epidermidis infektion. Efter procedurerne udviste streptococcus sanguinis en betydelig reduktion af overholdelsen af halspulsårevæggen sammenlignet med det kvægpericardiumplaster.Når man sammenligner de tre bakteriearter, streptococcus sanguinis præsenterer betydeligt lavere vedhæftning til kvæg halspulsåre væg i forhold til staphylococcus aureus og staphylococcus epidermidis. Mens du forsøger denne procedure, Er det vigtigt at huske at have forberedt korrekte væv af samme hoved. Det vil sikre lignende forhold på tværs af alle forsøgsprøver og minimere datavariationen mellem forskellige serier af eksperimenter.Efter sin udvikling, denne teknik giver forskerne mulighed for at udforske de komplekse lidelse systemer i en trin for trin måde ved at berige deres in vitro model tilgange med forskellige elementer til at opbygge fuld kompleksitet tæt på medicinsk status.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

En roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding Teknik til Alter intrakardielle Hæmodynamik i en Embryonale Kylling System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Udvikling af en Ethanol-induceret Fibrotiske Lever Model i Zebrafisk at studere progenitorcelle-medieret hepatocyt Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In vitro og in vivo modeller til at studere hornhindeendothel-mesenkymale Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

En 5-mC prikkeblot-analyse, der kvantificerer DNA-methyleringsniveauet for chondrocyt-differentiering<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Hele-mount Konfokal mikroskopi for voksne øre hud: et modelsystem til at studere Neuro-kar forgrening morfogenese og immun celle Distribution

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic kultur metode til at studere udviklingen af embryonale kylling væv

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

En Hyperandrogenic musen Model til at studere polycystisk ovariesyndrom

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Vurdering af oxidative skader i den primære mus okulære overfladeceller / stamceller som reaktion på Ultraviolet-C (UV-C) Skader

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonal genetisk sporing ved hjælp af Confetti-musen til at studere mineraliseret væv

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Whole-Mount In Situ Hybridization i Zebrafish Embryoner og Tube Formation Assay i iPSC-ECs at studere den rolle, Endoglin i vaskulær udvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...