Name: an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues at JoVE.com

Deze studie werd gesponsord door een subsidie van het onderzoek Fonds KU Leuven (OT/14/097) gegeven aan RH. TRV was Postdoctoral Fellow van de onderzoeksstichting FWO - Vlaanderen (België; Verlenen van nummer - 12K0916N) en RH wordt ondersteund door het klinische onderzoek Fonds van UZ Leuven.

1. voorbereiding Graft weefsels van In Vitro Studies
Opmerking: Drie soorten weefsels werden gebruikt: boviene hartzakje patch (BP), Cryopreserved Homograft (CH) en boviene halsslagader transplantaties (BJV). In het geval van BJV conduit en CH (weefsel door de Europese Bank voor Homograft (EHB) verwerkt en opgeslagen in vloeibare stikstof voorafgaand aan het gebruiken), werden zowel de muur en de terugstroming folders gebruikt. BP patch en BJV conduit werden gekocht van de fabrikanten. ...

<ol>
	<li>Que, Y. A., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infective+endocarditis.">Infective endocarditis.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).</li><li>Werdan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+infective+endocarditis:+pathogen-host+interaction+and+risk+states.">Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states.</a> Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).</li><li>Moreillon, P., Que, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infective+endocarditis.">Infective endocarditis.</a> The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).</li><li>Jalal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+propensity+of+bovine+jugular+vein+material+to+bacterial+adhesions:+An+in+vitro+study.">Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study.</a> International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).</li><li>Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Review+of+Infective+Endocarditis+in+Patients+With+Bovine+Jugular+Vein+Valves+Compared+With+Other+Valve+Types.">A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types.</a> JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).</li><li>Malekzadeh-Milani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+predictors+of+Melody(R)+valve+endocarditis:+a+prospective+study.">Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study.</a> Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).</li><li>Hill, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+prosthetic+valve+infective+endocarditis.">Management of prosthetic valve infective endocarditis.</a> American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).</li><li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clumping+factor+A,+von+Willebrand+factor-binding+protein+and+von+Willebrand+factor+anchor+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall.">Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).</li><li>Fowler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+invasion+by+Staphylococcus+aureus+involves+a+fibronectin+bridge+between+the+bacterial+fibronectin-binding+MSCRAMMs+and+host+cell+beta1+integrins.">Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins.</a> European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).</li><li>Patti, J. M., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+adhesins+recognizing+extracellular+matrix+macromolecules.">Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).</li><li>Massey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-binding+protein+A+of+Staphylococcus+aureus+has+multiple,+substituting,+binding+regions+that+mediate+adherence+to+fibronectin+and+invasion+of+endothelial+cells.">Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).</li><li>Jashari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Belgian+and+European+experience+with+the+European+Homograft+Bank+(EHB)+cryopreserved+allograft+valves--assessment+of+a+20+year+activity.">Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity.</a> Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).</li><li>Cheatham, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+hemodynamic+outcomes+up+to+7+years+after+transcatheter+pulmonary+valve+replacement+in+the+US+melody+valve+investigational+device+exemption+trial.">Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial.</a> Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).</li><li>Que, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+fibronectin+binding+cooperate+for+valve+infection+and+invasion+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis.">Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).</li><li>Veloso, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adherence+to+graft+tissues+in+static+and+flow+conditions.">Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).</li><li>Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus,+master+manipulator+of+the+human+hemostatic+system.">Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).</li><li>Chiu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+increases+ICAM-1+and+decreases+VCAM-1+and+E-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-[alpha]+in+endothelial+cells.">Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).</li><li>Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+tissue+engineering:+a+new+laminar+flow+chamber+for+in+vitro+improvement+of+mechanical+tissue+properties.">Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties.</a> ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).</li><li>Veltrop, M. H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Species-+and+Strain-Dependent+Induction+of+Tissue+Factor+in+Human+Vascular+Endothelial+Cells.">Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).</li></ol>

Recente klinische waarnemingen geven speciale alertheid IE als een complicatie bij patiënten die klep vervanging van de RVOT6,13heeft ondergaan. Dysfunctie van de geïmplanteerde klep in IE is het gevolg van bacteriële interactie met de endovasculaire prothese leidt tot uitgebreide inflammatoire en procoagulatie reacties1,14. De gepresenteerde nieuwe in vitro model konden we onderzoeken als ver...

Staphylococcus aureus (S. aureus) maakt gebruik van een verscheidenheid van virulentie strategieën te omzeilen het immuunsysteem verdediging hostsysteem koloniseren van biologische of niet-biologische oppervlakken geïmplanteerd in de menselijke circulatie, hetgeen tot ernstige intravasculaire infecties zoals sepsis leidt en IE1,2,3,4,5. IE blijft een belangrijke behandeling verbonden complicatie bij patiënten na implantatie van prothetische hartkleppen terwijl individuele factoren die bijdragen aan het begin van de IEare niet nog volledig begrepen6,7. Onder stromingscondities tegenkomen bacteriën schuintrekken krachten, die ze moeten overwinnen om te voldoen aan het vaartuig muur8. Modellen, waarmee het samenspel tussen bacteriën en prothetische ventiel weefsel of endotheel onder stroom te bestuderen, zijn van belang als zij de in vivo situatie meer weerspiegelen.
Verschillende specifieke mechanismen vergemakkelijken bacteriële aanhankelijkheid naar endotheliale cellen (ECs) en naar de blootgestelde subendothelial matrix (ECM) leiden tot weefsel kolonisatie en rijping van vegetaties, essentiële eerste stappen in IE9wordt. Diverse Staphylococcus oppervlakte-eiwitten of MSCRAMMs (microbiële oppervlakte componenten herkennen adhesieve matrix moleculen) worden omschreven als bemiddelaars wrijvingscoëfficiënt naar host cellen en aan ECM eiwitten door interactie met moleculen zoals fibronectin, fibrinogeen, collageen en von Willebrand factor (VWF)8,10,11. Echter met het oog op de intra moleculaire vouwen van sommige virulentiefactoren, meestal studeerde in statische toestand, kunnen veel van deze interacties hebben verschillende relevantie in endovasculair infecties in het bloed circuleren.
Daarom presenteren we een in-house ontworpen in vitro parallel-plaat flow kamer model, waarmee de beoordelingvan bacteriële aanhankelijkheid aan verschillende onderdelen van ECM en ECs in het kader van weefsel transplantaten geïmplanteerd in de positie van de RVOT. Het algemene doel van de in dit werk beschreven methode is om te studeren van mechanismen van interactie tussen bacteriën en onderliggende endovasculair weefsels in stromingscondities, die nauw verband houden met het milieu in vivo van bloedbaan ziekteverwekkers zoals S. aureus. Deze nieuwe aanpak richt zich op de gevoeligheid van graft weefsel oppervlakken om bacteriële aanhankelijkheid aan het identificeren van mogelijke risicofactoren voor de ontwikkeling van IE.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium</td>
			<td>Synovis Surgical Innovations, USA</td>
			<td>PC-0404SN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Jugular Vein conduits (BJV)</td>
			<td>Contegra conduit; Medtronic Inc, USA</td>
			<td>M333105D001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH cryopreserved homograft</td>
			<td>European Homograft Bank (EHB)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acu-Punch</td>
			<td>Acuderm Inc, USA</td>
			<td>P850 (8 mm); P1050 (10 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Albumin</td>
			<td>Flexbumin; Baxter, Belgium</td>
			<td>BE171464 
			LOT:16G12C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Fluka, Steinheim, Germany</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heart infusion broth (BHI)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS).</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>21878-100MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (MODEL ISM444B)</td>
			<td>Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>631942-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa</td>
			<td>142-6044</td>
			<td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td>
			<td>29027886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>87206462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6140.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well on Lumox detachable</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6150.101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel - surgical Blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Silicone Tubing, 1/8&#34;ID x 1/4&#34;OD</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-95702-06</td>
			<td>Temperature range: &#8211;80 to 200&#176;C 
			Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PharMed BPT Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>AY242012</td>
			<td>Autoclavable 30 min at 121&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon LMT-55 Tubing</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics&#8482;</td>
			<td>15312022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat</td>
			<td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td>
			<td>300-0042</td>
			<td>230V, 90VA, 50Hz</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues

Verschillende ventielen leidingen en kleppen stent gemonteerde worden gebruikt voor de vervanging van de klep van rechts-ventriculaire uitstroom tractus (RVOT) bij patiënten met aangeboren hartafwijkingen. Wanneer using prothetische materialen toch, zijn deze protheses gevoelig voor bacteriële infecties en verschillende antwoorden van de gastheer.
Identificatie van bacteriële en gastheer factoren die een vitale rol in de endovasculaire hechting van micro-organismen spelen is van belang om de pathofysiologie van het intreden van infecties zoals infectieuze endocarditis (IE) beter te begrijpen en om preventieve strategieën. Daarom is de ontwikkeling van bevoegde modellen te onderzoeken van bacteriële hechting fysiologische schuintrekken omstandigheden noodzakelijk. Hier beschrijven we het gebruik van een nieuw ontworpen in vitro perfusie kamer op basis van parallelle platen waarmee dat de studie van bacteriële aanhankelijkheid aan verschillende onderdelen van graft weefsels zoals blootgesteld extracellulaire matrix, endotheliale cellen en inerte gebieden . Deze methode in combinatie met de kolonie-vormende eenheid (CFU) tellen is voldoende om te evalueren van de neiging van graft materialen naar bacteriële hechting onder stroom. Verder kan, de stroomsysteem van de kamer worden gebruikt om te onderzoeken van de rol van bloedbestanddelen in bacteriële hechting schuintrekken omstandigheden. We toonden aan dat de bron van weefsel, hun bovengrondse morfologie en bacteriesoorten specificiteit zijn niet de belangrijkste bepalende factoren in bacteriële aanhankelijkheid aan weefsels met behulp van onze in-house ontworpen in vitro perfusie model enten.

Om beter inzicht in de mechanismen achter IE ontwikkeling, dit model in staat stelt de evaluatie van bacteriële en weefsel verbonden factoren aanwezig is in de situatie in vivo van begin van de infectie.
In detail, de aanpak van nieuwe in vitro toestaat te kwantificeren van bacteriële hechting in stromingscondities aan verschillende graft weefsels door zoogdierlevercellen fluorescently geëtiketteerd...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues at JoVE.com

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We beschrijven een in-house ontworpen in vitro flow kamer model, waardoor het onderzoek naar bacteriële aanhankelijkheid aan het enten van de weefsels.

Een In Vitro Model van een Parallel-plaat perfusie-systeem te bestuderen van de naleving van de bacteriële om te enten van weefsels

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de pathogenese van infectieve endocarditis, en pathobiogrammen door gebieden zoals het samenspel tussen bacteriën, bloedcellen en endotheelcellen langs het spierstelsel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de weefseltransplantaten direct kunnen worden blootgesteld aan wederzijdse interacties met verschillende doelen, zoals bacteriën, bloedplaatjes en eiwitten in gestandaardiseerde stroomomstandigheden. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot onze therapie van infectieve endocarditis, omdat het belangrijke moleculaire interacties en factoren kan ontrafelen die een hoge infectiviteit van bepaalde weefsels stimuleren.Deze methode geeft inzicht in pathogenese van vegetatievorming. Het kan ook van toepassing zijn in studies onderzoeken vasculaire doorlaatbaarheid, celmobiliteit, en gencelexpressie. Om te beginnen met het protocol, plaats een eerder voorbereide weefselbiopsie 10 millimeter in diameter, en dezelfde dikte tussen een microscoop dia en een acht millimeter cirkelvormige perforatie, en een rubberen pakking met het binnenoppervlak naar boven gericht, om contact te maken met de bacteriële suspensie.Focus op de weefseltransplantatie oriëntatie terwijl geplaatst in de houder. Zorg ervoor dat het binnenoppervlak van het weefsel is al blootgesteld aan de bloedbaan gezichten tot contact opnemen met uw experimentele medium. Steek vervolgens uw houder met het weefsel in de pakkingplaat die is ingebed in het onderste metalen frame van de kamer.Bevestig het bovenste metalen frame met de bijbehorende pakkingplaat op de bodem van de kamer met de eerder ingebrachte weefselhouder. Monteer vervolgens de hele kamer met acht schroeven en schroefmoeren. Zorg ervoor dat de kamerhoogte altijd hetzelfde is over grafts met behulp van een remklauw of liniaal.Sluit vervolgens de flowkamer aan op een peristaltische pomp. Sluit vervolgens het vloeistofreservoir van 400 milliliter aan op de buizen. Doorsnede de weefsels met 100 milliliter suspensies van tien tot de zeven fluorescerende kolonievormende eenheden in fosfaat gebufferde zoutoplossing met de pure stress van drie dines per vierkante centimeter en de overeenkomstige stroomsnelheid van vier milliliter per minuut gedurende een uur met behulp van de peristieke pomp en het bacteriële reservoir.Recirculeren continu de 100 milliliter bacteriële suspensie met behulp van dezelfde collectie reservoir. Na perfusie demontage van de kamer om het transplantaat los te laten. Was het weefselstuk twee keer met vier milliliter PBS in een 12-put plaat met behulp van een orbitale shaker gedurende drie minuten.Snijd vervolgens het binnenste deel van het transplantaat met behulp van een huidbiopsie punch met een kleinere diameter. Plaats elke weefselbiopsie in een aparte buis van 14 milliliter met een milliliter steriele 0,9% natriumchloride. Maak de bacteriën 10 minuten los van het weefsel met behulp van een sonicatiebad.Bereid een enkele 14 milliliter buis met 10 milliliter steriele 0,9% natriumchloride om seriële verdunningen van de bacteriële suspensie verkregen na sonicatie te maken. Label de buis nummer twee. Bereid drie 14 milliliter buizen met 10 milliliter steriele 0,9% natriumchloride voor voor seriële verdunningen van de eerste bacteriële suspensie die naar het profusie-experiment wordt gebracht.Label de buizen nummer drie, nummer vier en nummer vijf. Vervolgens zet u drie agarplaten vast, één voor de bacteriële perfusie, een voor de controleperfusie van PBS en de derde voor de eerste bacteriële suspensie die wordt gebruikt voor perfusies. Label drie sectoren per plaat voor het weefselexperiment op de volgende manier:10-1, 10-3 en 10-4.Als u het aantal kolonievormende eenheden in de bacteriële perfusing wilt tellen, labelt u de plaat als volgt:10-1, 10-3, 10-5 en 10-7. Vortex de buizen met de weefselbiopsie gedurende 15 seconden per stuk, om seriële verdunningen te maken. Om de seriële verdunningen voor te bereiden, breng 100 microliters van buis nummer één over naar buis nummer twee en draaikolk de buis om de oplossing grondig te mengen.Verspreid 100 microliter van de inhoud van buis nummer één en nummer twee over de overeenkomstige sectoren, 10-1 en 10-3 van de agarplaat. Dan verspreid 10 microliters van buis nummer twee op sector 10 vier. Herhaal deze stap vier keer om vier afzonderlijke gezwellen te verkrijgen van elk volume van 10 microliter.Om seriële verdunningen van de oorspronkelijke cultuur voor te bereiden, eerste vortex de verdunning gedurende 15 seconden en overdracht 100 microliter bacteriële suspensie naar buis nummer drie, en meng krachtig door vortexing. Voeg 100 microliters buis nummer drie toe aan buis nummer vier en meng opnieuw. Herhaal de procedure voor buis nummer vijf van buis nummer vier.Verspreid 100 microliters van de inhoud van buizen nummer drie, nummer vier, nummer vijf, en de gelabelde initiële cultuur respectievelijk op sectoren 10-3, 10-5, 10-7, en 10-1 van de bloed agar plaat. Laat de bloedagar platen onder de laminaire kap aan de lucht drogen van de bacteriële spreads, meestal gedurende 10 minuten. Plaats daarna de platen op 37 graden Celsius voor nachtelijke incubatie.Tel na nachtelijke incubatie de bacteriële kolonies om het aantal CDU's te verkrijgen. Onder pure stress voorwaarden, soortgelijke bacteriële gehechtheid over de verschillende graft weefsels werd waargenomen voor zowel staphylococcus aureus en staphylococcus epidermidis infectie. Volgens de procedures vertoonde streptococcus sanguinis een aanzienlijke vermindering van de aanhankelijkheid aan de boviene halsaderwand, in vergelijking met de vederneusardiumpatch.Bij het vergelijken van de drie soorten bacteriën, streptococcus sanguinis presenteert aanzienlijk lagere hechting aan de boviene halsader wand ten opzichte van staphylococcus aureus en staphylococcus epidermidis. Tijdens een poging deze procedure, het is belangrijk om te onthouden te hebben voorbereid juiste weefsels van hetzelfde hoofd. Het zal zorgen voor vergelijkbare omstandigheden in alle experimentmonsters en de variabiliteit van gegevens tussen verschillende reeksen experimenten minimaliseren.Na de ontwikkeling stelt deze techniek onderzoekers in staat om de complexe wanordesystemen stap voor stap te verkennen door hun in vitro modelbenaderingen te verrijken met verschillende elementen om volledige complexiteit op te bouwen in de buurt van de medische status.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

Een roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding techniek voor Intracardiale Hemodynamica Alter in een embryonale Chicken System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In vitro en in vivo modellen voor de studie van het hoornvlies endotheel-mesenchymale transitie

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

Een 5-m-dot-blot-analyse die het DNA-methyleringsniveau van chondrocytedifferentiatie quantificeert<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Organotypic cultuur methode om te studeren van de ontwikkeling van embryonale kip weefsels

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Een muismodel van Hyperandrogenic te bestuderen polycysteus ovarium syndroom

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

Beoordeling van oxidatieve schade in de primaire muis oculaire oppervlaktecellen / stamcellen in reactie op Ultraviolet-C (UV-C) Schade

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonale genetische tracing met de confetti muis om gemineraliseerde weefsels te bestuderen

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Whole-Mount In Situ Hybridisatie in Zebrafish Embryo's en Tube Formation Assay in iPSC-ECs om de rol van Endoglin in vasculaire ontwikkeling te bestuderen

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...