Name: an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Cette étude a été financée par une subvention de la recherche fonds KU Leuven (OT/14/097) accordée aux RH. VRT a été stagiaire postdoctoral de la fondation de recherche de FWO - Vlaanderen (Belgique ; Grant Number - 12K0916N) et RH est pris en charge par le fonds de recherche clinique de UZ Leuven.

1. préparer la greffe de tissus pour des études In Vitro
Remarque : Trois types de tissus ont été utilisés : patch de péricarde bovin (BP), greffes Cryopreserved homogreffe (CH) et de la veine jugulaire de bovin (BJV). En cas de conduite BJV et CH (tissus traités par la Banque européenne de homogreffe (EHB) et stockés dans l’azote liquide avant de l’utiliser), le mur et les feuillets valvulaires ont été utilisés. Patch de BP et conduit BJV furent achetées chez les fab...

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Les observations cliniques récentes donnent spéciale sensibilisation à IE comme complication chez des patients ayant subi un remplacement valvulaire des RVOT6,13. Dysfonctionnement de la valve implantée dans IE est le résultat d’interactions bactériennes avec la prothèse endovasculaire, menant à une vaste inflammatoires et procoagulant réactions1,14. Le modèle présenté roman in vitro</em...

Staphylococcus aureus (S. aureus) emploie une variété de stratégies de virulence de contourner le système de défense immunitaire hôte coloniser les surfaces biologiques ou non biologiques, implantés dans la circulation humaine, ce qui conduit à des infections intravasculaires sévères comme la septicémie et IE1,2,3,4,5. Restes de IE un traitement important associé à complication chez les patients après l’implantation de prothèses valvulaires tandis que les facteurs individuels qui contribuent à l’apparition de IEare ne pas encore pleinement compris6,7. Conditions d’écoulement, bactéries rencontrent les forces de cisaillement, dont ils ont besoin pour surmonter afin de respecter le mur de navire8. Modèles, qui permettent d’étudier l’interaction entre les bactéries et tissu valvulaire prothétique ou endothélium sous flux, sont intéressantes car elles reflètent la situation in vivo plus.
Plusieurs mécanismes spécifiques facilitent l’adhérence des bactéries aux cellules endothéliales (ce) et à la matrice étant exposée (ECM) conduisant à la colonisation des tissus et la maturation des végétations, sont des étapes essentielles au début dans IE9. Diverses protéines de surface staphylococciques ou MSCRAMMs (surfaces composants microbiens en reconnaissant les molécules de la matrice adhésive) ont été décrits comme des médiateurs de l’adhérence aux cellules hôtes et aux protéines ECM en interagissant avec des molécules telles que la fibronectine, facteur de fibrinogène, de collagène et de von Willebrand (VWF)8,10,11. Toutefois, compte tenu de pliage intra moléculaire de certains facteurs de virulence, étudiés pour la plupart dans des conditions statiques, plusieurs de ces interactions peuvent avoir un rapport différent endovasculaire des infections dans le sang circulant.
Par conséquent, nous présentons un interne conçu in vitro plaques parallèles flux chambre modèle, qui permet l’évaluation de l’adhérence des bactéries aux différentes composantes d’ECM et ECs dans le cadre de greffes de tissus implantés dans la position de RVOT. L’objectif global de la méthode décrite dans le présent travail est d’étudier les mécanismes d’interaction entre les bactéries et les tissus sous-jacents endovasculaire dans des conditions d’écoulement, qui sont étroitement liées à l’environnement en vivo de pathogènes de circulation sanguine tels que S. aureus. Cette nouvelle approche met l’accent sur la sensibilité des surfaces tissus greffés à l’adhérence des bactéries à identifier les facteurs de risque potentiels pour le développement d’Internet Explorer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium</td>
			<td>Synovis Surgical Innovations, USA</td>
			<td>PC-0404SN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Jugular Vein conduits (BJV)</td>
			<td>Contegra conduit; Medtronic Inc, USA</td>
			<td>M333105D001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH cryopreserved homograft</td>
			<td>European Homograft Bank (EHB)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acu-Punch</td>
			<td>Acuderm Inc, USA</td>
			<td>P850 (8 mm); P1050 (10 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Albumin</td>
			<td>Flexbumin; Baxter, Belgium</td>
			<td>BE171464 
			LOT:16G12C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Fluka, Steinheim, Germany</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heart infusion broth (BHI)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS).</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>21878-100MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (MODEL ISM444B)</td>
			<td>Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>631942-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa</td>
			<td>142-6044</td>
			<td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td>
			<td>29027886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>87206462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6140.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well on Lumox detachable</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6150.101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel - surgical Blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Silicone Tubing, 1/8&#34;ID x 1/4&#34;OD</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-95702-06</td>
			<td>Temperature range: &#8211;80 to 200&#176;C 
			Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PharMed BPT Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>AY242012</td>
			<td>Autoclavable 30 min at 121&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon LMT-55 Tubing</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics&#8482;</td>
			<td>15312022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat</td>
			<td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td>
			<td>300-0042</td>
			<td>230V, 90VA, 50Hz</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues

Divers vannées conduites et vannes stent montés sont utilisés pour un remplacement valvulaire ventriculaire droite sortie voies (RVOT) chez les patients présentant une cardiopathie congénitale. Lorsque vous utilisez des matériaux prothétiques, cependant, ces greffes sont sensibles aux infections bactériennes et les différentes réactions de l’hôte.
Identification des facteurs bactériens et hôte qui jouent un rôle essentiel dans le respect du traitement endovasculaire des micro-organismes est d’importance pour mieux comprendre la physiopathologie de l’apparition d’infections telles que l’endocardite infectieuse (IE) et de développer la prévention stratégies. Par conséquent, l’élaboration de modèles compétentes pour enquêter sur l’adhérence bactérienne dans des conditions physiologiques de cisaillement est nécessaire. Nous décrivons ici l’utilisation d’une nouvellement conçu in vitro perfusion chambre basée sur des plaques parallèles qui permet que l’étude de l’adhérence des bactéries aux différentes composantes des tissus greffés exposés tels que la matrice extracellulaire, les cellules endothéliales et les zones inertes . Cette méthode combinée avec formant colonie (UFC) unité de comptage est suffisante pour évaluer la propension des matériaux de greffe à adhérence bactérienne sous flux. De plus, le système de chambre de flux peut-être servir d’enquêter sur le rôle des composants sanguins dans l’adhésion bactérienne dans des conditions de cisaillement. Nous avons démontré que la source du tissu, leur morphologie de la surface et la spécificité des espèces bactériennes ne sont pas les principaux facteurs déterminants dans l’adhérence des bactéries à la greffe de tissus à l’aide de notre modèle de perfusion interne conçu in vitro .

Pour mieux comprendre les mécanismes derrière IE développement, ce modèle permet l’évaluation de bactérien et facteurs de tissus associés présent dans la situation in vivo de l’apparition de l’infection.
En détail, l’approche novatrice en vitro permet de quantifier l’adhésion bactérienne dans des conditions d’écoulement aux tissus différents greffons en perfusant les bactéries...

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An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Nous décrivons un interne conçu in vitro chambre modèle d’écoulement, qui permet à l’enquête de l’adhérence des bactéries à la greffe de tissus.

Un modèle In Vitro d’un système de Perfusion de plaques parallèles pour étudier l’adhérence bactérienne pour greffer des tissus

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans la pathogénie de l’endocardite infectieuse, et les pathobiogrammes à travers des domaines tels que l’interaction entre les bactéries, les cellules sanguines et les cellules endothéliales doublure musculature. Le principal avantage de cette technique est que les greffes de tissus peuvent être directement exposées à des interactions mutuelles avec diverses cibles, telles que les bactéries, les plaquettes et les protéines dans des conditions d’écoulement normalisées. L’implication de cette technique s’étend à notre thérapie de l’endocardite infectieuse, parce qu’elle peut démêler les interactions moléculaires importantes et les facteurs conduisant à l’infectiosité élevée de certains tissus.Cette méthode donne un aperçu de la pathogénie de la formation de végétation. Il peut également être applicable dans les études portant sur la perméabilité vasculaire, la mobilité cellulaire et l’expression des cellules géniques. Pour commencer le protocole, placez une biopsie tissulaire préparée précédemment de 10 millimètres de diamètre, et la même épaisseur entre une lame de microscope et une perforation circulaire de huit millimètres, et un joint en caoutchouc avec la surface intérieure face vers le haut, pour entrer en contact avec la suspension bactérienne.Concentrez-vous sur l’orientation de greffe de tissu tout en étant placé dans le support. Assurez-vous que la surface interne du tissu est déjà exposée aux faces sanguines jusqu’à contact avec votre milieu expérimental. Ensuite, insérez votre support avec le tissu dans la feuille de joint qui est intégrée dans le cadre métallique inférieur de la chambre.Fixez le cadre métallique supérieur avec la feuille de joint correspondante sur le fond de la chambre avec le support de tissu précédemment inséré. Montez ensuite toute la chambre avec huit vis et visser les écrous. Assurez-vous que la hauteur de la chambre est toujours la même sur les greffons à l’aide d’un étrier ou d’une règle.Ensuite, connectez la chambre d’écoulement avec une pompe périssaliste. Connectez ensuite le réservoir de liquide de 400 millilitres avec les tubes. Imprènuer les tissus avec des suspensions de 100 millilitres de dix à la colonie de sept étiquettes fluorescentes formant des unités en saline tamponnée de phosphate avec le stress de trois dîners par centimètre carré et le débit correspondant de quatre millilitres par minute pendant une heure en utilisant la pompe périssaltique et le réservoir bactérien.Recirculez continuellement la suspension bactérienne de 100 millilitres à l’aide du même réservoir de collecte. Après la perfusion, démonter la chambre pour libérer la greffe. Lavez le morceau de tissu deux fois avec quatre millilitres de PBS dans une plaque de 12 puits à l’aide d’un shaker orbital pendant trois minutes.Ensuite, coupez la partie interne de la greffe à l’aide d’un poinçon de biopsie de la peau avec un diamètre plus petit. Placez chaque biopsie tissulaire dans un tube séparé de 14 millilitres contenant un millilitre de chlorure stérile de sodium de 0,9 %. Détachez les bactéries du tissu à l’aide d’un bain de sonication pendant 10 minutes.Préparer un seul tube de 14 millilitres avec 10 millilitres de chlorure stérile de sodium de 0,9 % pour faire des dilutions périodiques de la suspension bactérienne obtenues après sonication. Étiquetez le tube numéro deux. Préparer trois tubes de 14 millilitres avec 10 millilitres de chlorure stérile de sodium de 0,9 % pour les dilutions périodiques de la suspension bactérienne initiale prise à l’expérience de profusion.Étiquetez les tubes numéro trois, numéro quatre et numéro cinq. Ensuite, fixez trois plaques d’agar, une pour la perfusion bactérienne, une pour la perfusion de contrôle de PBS, et la troisième pour la suspension bactérienne initiale utilisée pour les perfusions. Étiquetez trois secteurs par plaque pour l’expérience tissulaire de la manière suivante : 10-1, 10-3 et 10-4.Pour compter le nombre d’unités formant des colonies dans le perfusage bactérien, étiquetez la plaque comme suit : 10-1, 10-3, 10-5 et 10-7. Vortex les tubes contenant la biopsie tissulaire pendant 15 secondes chacun, pour faire des dilutions en série. Pour préparer les dilutions en série, transférez 100 microlitres du tube numéro un au tube numéro deux, et vortexez le tube pour bien mélanger la solution.Répartir 100 microlitres du contenu du tube numéro un et numéro deux sur les secteurs correspondants, 10-1 et 10-3 de la plaque d’agar. Ensuite, répartir 10 microlitres de tube numéro deux sur le secteur 10 quatre. Répétez cette étape quatre fois pour obtenir quatre croissances distinctes de chaque volume de 10 microlitres.Pour préparer les dilutions en série de la culture initiale, vortex d’abord la dilution pendant 15 secondes et transférer 100 microlitres de suspension bactérienne au tube numéro trois, et mélanger vigoureusement par vortex. Ajouter 100 microlitres de tube numéro trois au tube numéro quatre et mélanger à nouveau. Répétez la procédure pour le tube numéro cinq à partir du tube numéro quatre.Répartir 100 microlitres du contenu des tubes numéro trois, numéro quatre, numéro cinq, et la culture initiale étiquetée respectivement sur les secteurs 10-3, 10-5, 10-7, et 10-1 de la plaque d’agar de sang. Laissez les plaques d’agar de sang sous le capot laminaire sécher à l’air les tartinades bactériennes, généralement pendant 10 minutes. Ensuite, placez les plaques à 37 degrés Celsius pour l’incubation pendant la nuit.Après l’incubation d’une nuit, comptez les colonies bactériennes pour obtenir le nombre d’FC. Dans des conditions de stress, l’attachement bactérien semblable à travers les divers tissus de greffe a été observé pour l’infection de staphylococcus aureus et d’epidermidis de staphylocoque. Suivant les procédures, le streptocoque sanguinis a montré la réduction significative de l’adhérence à la paroi jugulaire bovine de veine, par rapport au patch bovin de péricardium.En comparant les trois espèces de bactéries, streptococcus sanguinis présente une adhérence significativement plus faible à la paroi veineuse jugulaire bovine par rapport au staphylocoque aureus et au staphylocoque epidermidis. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’avoir préparé les tissus corrects de la même tête. Il assurera des conditions similaires pour tous les spécimens expérimentaux et minimisera la variabilité des données entre les différentes séries d’expériences.Après son développement, cette technique permet aux chercheurs d’explorer les systèmes de troubles complexes étape par étape en enrichissant leurs approches modèles in vitro avec différents éléments pour accumuler toute la complexité proche de l’état médical.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Tracing génétique clonale à l'aide de la souris confettis pour étudier les tissus minéralisés

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hybridation in situ à monture entière chez les embryons de poissons zèbres et l’essai de formation de tubes dans iPSC-ECs pour étudier le rôle de l’Endoglin dans le développement vasculaire

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...