Name: an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Diese Studie wurde gesponsert durch einen Zuschuss von der Research Fund KU Leuven (OT/14/097), RH gegeben. TRV war Postdoctoral Fellow der FWO Research Foundation - Flandern (Belgien; Gewährungsnummer - 12K0916N) und RH stützt sich auf die klinische Forschung Fonds UZ Leuven.

1. Vorbereitung Graft Gewebe für In-vitro- Studien
Hinweis: Drei Arten von Geweben wurden verwendet: Bovine Perikard Patch (BP), kryokonserviert Homograft (CH) und Rinder Halsschlagader Transplantate (BJV). Im Falle der BJV Conduit und CH (Gewebe durch europäische Homograft Bank (EHB) verarbeitet und gespeichert in flüssigem Stickstoff vor der Verwendung) dienten die Wand und Herzklappenfehler Flugblätter. BP-Patch und BJV Conduit wurden von den Herstellern gekauft. Vor dem Gebrauch...

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Neuere klinische Beobachtungen geben besondere Aufmerksamkeit auf IE als Komplikation bei Patienten nach einer Klappenersatz des RVOT6,13. Dysfunktion der implantierten Ventil im IE ist das Ergebnis der bakteriellen Interaktion mit der endovaskuläre Prothese führt zu umfangreichen Entzündungs- und gerinnungsfördernden Reaktionen1,14. Präsentiert neue in-vitro- Modell erlaubt uns zu untersuch...

Staphylococcus aureus (S. Aureus) beschäftigt eine Vielzahl von Virulenz Strategien zur Umgehung der Host Immunabwehr besiedeln biologische oder nicht-biologischen Oberflächen implantiert in den menschlichen Kreislauf, führt zu schweren intravaskuläre Infektionen wie Sepsis und IE1,2,3,4,5. IE bleibt eine wichtige Behandlung verbundene Komplikation bei Patienten nach Implantation der Prothese Herzklappen während der einzelnen Faktoren für das Auftreten von IEare nicht noch völlig verstanden6,7. Unter Strömungsbedingungen begegnen Bakterien Scherkräfte, die sie benötigen, zu überwinden, um das Schiff Wand8einhalten. Modelle, die studieren des Zusammenspiel zwischen Bakterien und prothetische Ventil Gewebe oder Endothel unter Strömung zu ermöglichen, sind von Interesse, da sie die in-Vivo -Situation mehr widerspiegeln.
Mehrere spezifische Mechanismen ermöglichen bakterielle Einhaltung der Endothelzellen (ECs) und der exponierten subendothelial Matrix (ECM) führt zu Gewebe Kolonisation und Reifung der Vegetationen, wesentlichen frühen Schritte in IE9. Verschiedene Staphylokokken Oberflächenproteine oder MSCRAMMs (mikrobielle DGM-Komponenten erkennen Haftmatrix Moleküle) wurden als Vermittler der Adhäsion Wirtszellen und ECM Proteine beschrieben durch die Interaktion mit Molekülen wie Fibronektin, Fibrinogen, Kollagen und von-Willebrand-Faktor (VWF)8,10,11. Jedoch haben viele dieser Interaktionen aufgrund intramolekularer Falte der einige Virulenzfaktoren, meist unter statischen Bedingungen untersucht unterschiedliche Relevanz endovaskuläre Infektion im Blut zirkulieren.
Deshalb präsentieren wir ein Inhouse gestalteten in-vitro- Parallel-Platte Fluss Kammer-Modell, ermöglicht die Beurteilung der bakteriellen Einhaltung der verschiedenen Komponenten von ECM und ECs im Zusammenhang mit Gewebetransplantate in die RVOT-Position implantiert. Das allgemeine Ziel des in dieser Arbeit beschriebenen Verfahrens ist es, Mechanismen der Interaktion zwischen Bakterien und darunter liegende endovaskuläre Gewebe in Strömungsverhältnisse, die eng, für die in-Vivo -Umwelt Blutkreislauf Krankheitserreger wie verbunden sind zu studieren S. Aureus. Dieser neuartige Ansatz konzentriert sich auf die Anfälligkeit der Transplantat Gewebe Oberflächen zu bakteriellen Einhaltung der Risikofaktoren für die Entwicklung von IE zu identifizieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium</td>
			<td>Synovis Surgical Innovations, USA</td>
			<td>PC-0404SN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Jugular Vein conduits (BJV)</td>
			<td>Contegra conduit; Medtronic Inc, USA</td>
			<td>M333105D001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH cryopreserved homograft</td>
			<td>European Homograft Bank (EHB)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acu-Punch</td>
			<td>Acuderm Inc, USA</td>
			<td>P850 (8 mm); P1050 (10 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Albumin</td>
			<td>Flexbumin; Baxter, Belgium</td>
			<td>BE171464 
			LOT:16G12C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Fluka, Steinheim, Germany</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heart infusion broth (BHI)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS).</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>21878-100MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (MODEL ISM444B)</td>
			<td>Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>631942-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa</td>
			<td>142-6044</td>
			<td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td>
			<td>29027886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>87206462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6140.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well on Lumox detachable</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6150.101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel - surgical Blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Silicone Tubing, 1/8&#34;ID x 1/4&#34;OD</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-95702-06</td>
			<td>Temperature range: &#8211;80 to 200&#176;C 
			Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PharMed BPT Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>AY242012</td>
			<td>Autoclavable 30 min at 121&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon LMT-55 Tubing</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics&#8482;</td>
			<td>15312022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat</td>
			<td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td>
			<td>300-0042</td>
			<td>230V, 90VA, 50Hz</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues

Rechtsventrikuläre Abfluss-Darm-Trakt (RVOT) Klappenersatz bei Patienten mit angeborenen Herzfehlern dienen verschiedene Ventil Leitungen und Ventile Stent montiert. Bei Verwendung von prothetische Materialien jedoch, sind diese Transplantate anfällig für bakterielle Infektionen und verschiedene Host Antworten.
Identifizierung von Bakterien und Host Faktoren, die eine entscheidende bei endovaskulären Einhaltung von Mikroorganismen Rolle ist wichtig zum besseren Verständnis die Pathophysiologie der das Auftreten von Infektionen wie infektiöse Endokarditis (IE) und präventiv zu entwickeln Strategien. Daher muss die Entwicklung zuständigen Modelle, bakterielle Adhäsion unter physiologischen scher Bedingungen zu untersuchen. Hier beschreiben wir die Verwendung einer neu gestalteten in-vitro- Perfusion Kammer basierend auf parallelen Platten, die ermöglicht, dass die Untersuchung der bakteriellen Einhaltung der verschiedenen Komponenten des Transplantats Gewebe ausgesetzt wie extrazelluläre Matrix, Endothelzellen und inerte Bereiche . Diese Methode kombiniert mit koloniebildenden Stückzählen (CFU) ist ausreichend, um die Neigung des Knochenmaterials gegen bakterielle Adhäsion unter Strömung zu bewerten. Könnte die Flow-Kammer-System weiterverwendet werden, die Rolle von Blutbestandteilen in bakterielle Adhäsion unter Scherung Bedingungen zu untersuchen. Wir bewiesen, dass die Quelle der Gewebe, ihre Oberflächenmorphologie und Bakterienarten Spezifität sind nicht die großen bestimmenden Faktoren im bakteriellen Einhaltung Gewebe Transplantat durch unsere hauseigene gestaltete in-vitro- Perfusion Modell.

Besseres Verständnis die Mechanismen hinter IE Entwicklung, dieses Modell ermöglicht die Auswertung der bakteriellen und Gewebe verbundenen Faktoren zu präsentieren, in der in-Vivo -Situation der Infektion auftreten.
Im Detail, die neuartige in-vitro- Ansatz ermöglicht die bakterielle Adhäsion in Strömungsverhältnisse zu verschiedenen Transplantat Geweben quantifizieren von Vorrichtung Eindringm...

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An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Wir beschreiben eine Inhouse entwickelten in-vitro- Flow Kammer-Modell, ermöglicht die Untersuchung der bakteriellen Einhaltung Gewebe Transplantat.

Ein In-vitro- Modell eines Systems Parallel-Platte Perfusion, bakteriellen Einhaltung der Gewebe Transplantat zu studieren

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselweisen Fragen in der Pathogenese der infektiösen Endokarditis zu beantworten, und Pathobiogramme durch Felder wie das Zusammenspiel zwischen Bakterien, Blutzellen, und Endothelzellen Auskleidung Muskulatur. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Gewebetransplantate direkt gegenseitigen Wechselwirkungen mit verschiedenen Zielen ausgesetzt sein könnten, wie Bakterien, Thrombozyten und Proteine unter standardisierten Strömungsbedingungen. Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf unsere Therapie von infektiöser Endokarditis, weil sie wichtige molekulare Wechselwirkungen und Faktoren entwirren kann, die eine hohe Infektiosität bestimmter Gewebe antreiben.Diese Methode gibt Einblick in die Pathogenese der Vegetationsbildung. Es kann auch in Studien zur Untersuchung der vaskulären Durchlässigkeit, Zellmobilität und Genzellexpression anwendbar sein. Um das Protokoll zu beginnen, legen Sie eine zuvor vorbereitete Gewebebiopsie mit einem Durchmesser von 10 Millimetern und der gleichen Dicke zwischen einem Mikroskopschlitten und einer kreisförmigen Perforation von acht Millimetern sowie eine Gummidichtung mit der nach oben gerichteten Innenfläche auf, um die bakterielle Suspension zu kontaktieren.Konzentrieren Sie sich auf die Gewebetransplantatausrichtung, während Sie im Halter platziert werden. Stellen Sie sicher, dass die innere Oberfläche des Gewebes bereits der Blutbahn ausgesetzt ist, um Ihr experimentelles Medium zu kontaktieren. Als nächstes legen Sie Ihren Halter mit dem Gewebe in das Dichtungsblech ein, das in den unteren Metallrahmen der Kammer eingebettet ist.Befestigen Sie den oberen Metallrahmen mit der entsprechenden Dichtungsfolie mit dem zuvor eingesetzten Gewebehalter an der Unterseite der Kammer. Dann montieren Sie die gesamte Kammer mit acht Schrauben und Schraubenmuttern. Stellen Sie sicher, dass die Kammerhöhe bei Transplantaten immer gleich ist, indem Sie einen Bremssattel oder ein Lineal verwenden.Als nächstes verbinden Sie die Durchflusskammer mit einer peristaltischen Pumpe. Dann verbinden Sie das 400 Milliliter Flüssigkeitsreservoir mit den Rohren. Durchdringen Sie die Gewebe mit 100 Milliliter Suspensionen von zehn bis sieben fluoreszierend markierten Koloniebildenden Einheiten in Phosphat gepufferter Saline mit der schieren Spannung von drei Dines pro Quadratzentimeter und der entsprechenden Durchflussrate von vier Millilitern pro Minute für eine Stunde mit der peristaltischen Pumpe und dem Bakterienreservoir.Rezirkulieren Sie kontinuierlich die 100 Milliliter bakterielle Suspension mit dem gleichen Sammelbehälter. Nach der Durchblutung die Kammer demontieren, um das Transplantat freizusetzen. Waschen Sie das Gewebestück zwei Mal mit vier MilliliterPBS in einer 12-Well-Platte mit einem Orbital-Shaker für drei Minuten.Dann schneiden Sie den inneren Teil des Transplantats mit einem Hautbiopsie-Punch mit einem kleineren Durchmesser. Legen Sie jede Gewebebiopsie in eine separate 14-Milliliter-Röhre mit einem Milliliter sterilem 0,9%Natriumchlorid. Lösen Sie die Bakterien mit einem Beschallungsbad 10 Minuten lang aus dem Gewebe.Bereiten Sie eine einzelne 14-Milliliter-Röhre mit 10 Milliliter sterilem 0,9%Natriumchlorid vor, um serielle Verdünnungen der bakteriellen Suspension nach der Beschallung zu machen. Beschriften Sie das Rohr Nummer zwei. Bereiten Sie drei 14 Milliliter-Röhren mit 10 Milliliter sterilem 0,9%Natriumchlorid für serielle Verdünnungen der anfänglichen bakteriellen Suspension vor, die zum Profusionsexperiment gebracht wurde.Beschriften Sie die Rohre Nummer drei, Zahl vier und Nummer fünf. Als nächstes sichern Sie drei Agarplatten, eine für die bakterielle Perfusion, eine für die Kontrolle der Durchblutung von PBS und die dritte für die anfängliche bakterielle Suspension, die für Perfusionen verwendet wird. Beschriften Sie drei Sektoren pro Platte für das Gewebeexperiment auf folgende Weise: 10-1, 10-3 und 10-4.Um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten in der bakteriellen Perfusing zu zählen, beschriften Sie die Platte wie folgt:10-1, 10-3, 10-5 und 10-7. Wirbeln Sie die Röhren, die die Gewebebiopsie enthalten, jeweils 15 Sekunden lang, um serielle Verdünnungen zu machen. Um die seriellen Verdünnungen vorzubereiten, übertragen Sie 100 Mikroliter des Rohres Nummer eins auf Rohr Nummer zwei, und wirbeln Sie das Rohr gründlich, um die Lösung gründlich zu mischen.100 Mikroliter des Gehalts von Rohr Nummer eins und Zwei auf die entsprechenden Sektoren verteilen, 10-1 und 10-3 der Agarplatte. Dann verteilen 10 Mikroliter Rohr Nummer zwei auf Sektor 10 vier. Wiederholen Sie diesen Schritt viermal, um vier separate Wuchse von jedem Volumen von 10 Mikrolitern zu erhalten.Um serielle Verdünnungen der Anfangskultur vorzubereiten, wirbeln Sie zunächst die Verdünnung für 15 Sekunden aus und übertragen Sie 100 Mikroliter bakterielle Suspension auf Tube Nummer drei, und mischen Sie durch Wirbeln kräftig. 100 Mikroliter Rohr Nummer drei zu Rohr Nummer vier hinzufügen und erneut mischen. Wiederholen Sie den Vorgang für Rohr Nummer fünf aus Rohr Nummer vier.Verteilen Sie 100 Mikroliter des Gehalts der Tuben Nummer drei, Zahl vier, Zahl fünf und der beschrifteten Anfangskultur auf die Sektoren 10-3, 10-5, 10-7 und 10-1 der Blut-Agarplatte. Lassen Sie die Blut-Agar-Platten unter der laminaren Haube, um die bakteriellen Ausbreitungen an der Luft zu trocknen, in der Regel für 10 Minuten. Danach die Teller bei 37 Grad Celsius für die nächtliche Inkubation aufstellen.Zählen Sie nach der nächtlichen Inkubation die Bakterienkolonien, um die Anzahl der KBE zu erhalten. Unter reinen Stressbedingungen wurde eine ähnliche bakterielle Anhaftung über die verschiedenen Transplantatgewebe sowohl bei Staphylococcus aureus als auch bei Staphylococcus epidermidis beobachtet. Im Anschluss an die Verfahren, Streptococcus sanguinis zeigte signifikante Verringerung der Haftung an der Rinder jugular Venenwand, im Vergleich zu den Rinder perikardium Patch.Beim Vergleich der drei Bakterienarten stellt Streptococcus sanguinis eine signifikant geringere Haftung an der Rinderjugularvenenwand in Bezug auf Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis dar. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, richtige Gewebe desselben Kopfes vorbereitet zu haben. Es wird ähnliche Bedingungen für alle Versuchsproben gewährleisten und die Datenvariabilität zwischen verschiedenen Versuchsreihen minimieren.Nach ihrer Entwicklung ermöglicht diese Technik den Forschern, die komplexen Störungssysteme Schritt für Schritt zu erforschen, indem sie ihre In-vitro-Modellansätze mit verschiedenen Elementen anreichern, um die volle Komplexität in der Nähe des medizinischen Status aufzubauen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

Ein Roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding-Technik intrakardialer Hämodynamik in einem embryonalen Hühner System ändern

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

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In vitro und in vivo Modelle Corneal Endothelial-mesenchymale Transition zu studieren

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Ein 5-mC-Dot-Blot-Assay, der den DNA-Methylierungsgrad der Chondrozyten-Dedifferenzierung quantifiziert<em&gt; In vitro</em

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Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung

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