Name: an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי מענק של לופן KU קרן מחקר (OT 14 097) שניתנה RH. TRV היה בחור דוקטורט של קרן המחקר FWO - פלנדרס (בלגיה; להעניק מספר - 12K0916N) ו RH הוא נתמך על ידי קרן מחקר קליני של UZ לוון.

1. מכינים את השתלת רקמות ללימודי במבחנה
הערה: שלושה סוגים של רקמות שימשו: תיקון קרום הלב שור (BP), שתלי מאותו מין Cryopreserved (CH), ומוחלף שור (BJV). במקרה של צינור BJV ושר (רקמות מעובד על ידי הבנק האירופי מאותו מין (אב) ומאוחסנים לפני השימוש בחנקן נוזלי), שימשו קיר והן valvular פליירים. BP תיק...

<ol>
	<li>Que, Y. A., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infective+endocarditis.">Infective endocarditis.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).</li><li>Werdan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+infective+endocarditis:+pathogen-host+interaction+and+risk+states.">Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states.</a> Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).</li><li>Moreillon, P., Que, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infective+endocarditis.">Infective endocarditis.</a> The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).</li><li>Jalal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+propensity+of+bovine+jugular+vein+material+to+bacterial+adhesions:+An+in+vitro+study.">Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study.</a> International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).</li><li>Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systematic+Review+of+Infective+Endocarditis+in+Patients+With+Bovine+Jugular+Vein+Valves+Compared+With+Other+Valve+Types.">A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types.</a> JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).</li><li>Malekzadeh-Milani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+and+predictors+of+Melody(R)+valve+endocarditis:+a+prospective+study.">Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study.</a> Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).</li><li>Hill, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+prosthetic+valve+infective+endocarditis.">Management of prosthetic valve infective endocarditis.</a> American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).</li><li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clumping+factor+A,+von+Willebrand+factor-binding+protein+and+von+Willebrand+factor+anchor+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall.">Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).</li><li>Fowler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+invasion+by+Staphylococcus+aureus+involves+a+fibronectin+bridge+between+the+bacterial+fibronectin-binding+MSCRAMMs+and+host+cell+beta1+integrins.">Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins.</a> European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).</li><li>Patti, J. M., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+adhesins+recognizing+extracellular+matrix+macromolecules.">Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).</li><li>Massey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-binding+protein+A+of+Staphylococcus+aureus+has+multiple,+substituting,+binding+regions+that+mediate+adherence+to+fibronectin+and+invasion+of+endothelial+cells.">Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).</li><li>Jashari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Belgian+and+European+experience+with+the+European+Homograft+Bank+(EHB)+cryopreserved+allograft+valves--assessment+of+a+20+year+activity.">Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity.</a> Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).</li><li>Cheatham, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+hemodynamic+outcomes+up+to+7+years+after+transcatheter+pulmonary+valve+replacement+in+the+US+melody+valve+investigational+device+exemption+trial.">Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial.</a> Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).</li><li>Que, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrinogen+and+fibronectin+binding+cooperate+for+valve+infection+and+invasion+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis.">Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).</li><li>Veloso, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adherence+to+graft+tissues+in+static+and+flow+conditions.">Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).</li><li>Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus,+master+manipulator+of+the+human+hemostatic+system.">Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).</li><li>Chiu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+increases+ICAM-1+and+decreases+VCAM-1+and+E-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-[alpha]+in+endothelial+cells.">Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).</li><li>Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+tissue+engineering:+a+new+laminar+flow+chamber+for+in+vitro+improvement+of+mechanical+tissue+properties.">Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties.</a> ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).</li><li>Veltrop, M. H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Species-+and+Strain-Dependent+Induction+of+Tissue+Factor+in+Human+Vascular+Endothelial+Cells.">Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).</li></ol>

תצפיות קליניות האחרונות נותן מודעות מיוחדת IE כמו סיבוך בחולים שעברו החלפת שסתום של6,RVOT13. תפקוד לקוי של השסתום מושתל ב- IE הוא התוצאה של חיידקי אינטראקציה עם השתל endovascular שמוביל נרחב דלקתיות ו procoagulant תגובות1,14. המודל הציג הרומן <em...

Staphylococcus aureus (S. aureus) מעסיקה במגוון אסטרטגיות התקפה אלימה כדי לעקוף את מערכת ההגנה החיסונית המארח להמדינות משטחים ביולוגי או הלא-ביולוגיים מושתלים במחזור האנושי, אשר מוביל לזיהומים קרישה תוך-כלית חמורות כגון אלח דם, IE1,2,3,4,5. שרידים IE לטיפול חשוב הקשורים סיבוך בחולים לאחר ההשתלה של מסתמי לב תותב תוך בודדים גורמים התורמים תחילתה של IEare לא אך מובן לחלוטין6,7. תחת תנאי זרימה, חיידקים מפגש כוחות גזירה, אשר הם צריכים להתגבר על מנת לדבוק קיר הספינה8. מודלים, אשר מאפשרים לימוד יחסי הגומלין בין חיידקים לבין רקמת שסתום תותבת או אנדותל תחת זרימה, הן עניין הם משקפים ויוו המצב יותר.
מספר מנגנונים מסוימים להקל על הדבקות חיידקים לתאי אנדותל (ECs) וכדי חשוף subendothelial המטריקס (ECM) המוביל קולוניזציה רקמת ההבשלה של גידולים, להיות צעדים חיוניים מוקדם ב- IE9. Staphylococcal פני שטח חלבונים שונים או MSCRAMMs (חיידקים משטח רכיבי זיהוי מולקולות מטריקס דבק) תוארו כמתווכים של אדהזיה לתאי המארח, ECM חלבונים על ידי אינטראקציה עם מולקולות כגון fibronectin, פיברינוגן, קולגן, Willebrand פון פקטור (VWF)8,10,11. עם זאת, על רקע קיפול אינטרה-מולקולרית של כמה גורמים התקפה אלימה, למד בעיקר בתנאים סטטי, רבים של אינטראקציות אלה ייתכן רלוונטיות שונים זיהומים endovascular במחזור הדם.
לכן, אנו מציגים ללא צורך במיקור חוץ מעוצב במבחנה במקביל-plate זרימה קאמרית מודל, אשר מאפשר את ההערכה של חיידקי ההקפדה מרכיבים שונים של ECM ו ECs בהקשר של רקמות השתלים מושתלים התנוחה RVOT. המטרה הכללית של השיטה המתוארת בעבודה זו היא ללמוד מנגנונים של האינטראקציה בין חיידקים ורקמות הבסיסית endovascular בתנאים זרימה, אשר קשורה קשר הדוק הסביבה ויוו של פתוגנים למחזור הדם כגון S. aureus. גישה חדשנית זו מתמקדת הרגישות של שתל משטחי רקמות כדי הדבקות חיידקים כדי לזהות גורמי סיכון פוטנציאלי לפיתוח של IE.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium</td>
			<td>Synovis Surgical Innovations, USA</td>
			<td>PC-0404SN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Jugular Vein conduits (BJV)</td>
			<td>Contegra conduit; Medtronic Inc, USA</td>
			<td>M333105D001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH cryopreserved homograft</td>
			<td>European Homograft Bank (EHB)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acu-Punch</td>
			<td>Acuderm Inc, USA</td>
			<td>P850 (8 mm); P1050 (10 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Albumin</td>
			<td>Flexbumin; Baxter, Belgium</td>
			<td>BE171464 
			LOT:16G12C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Fluka, Steinheim, Germany</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heart infusion broth (BHI)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS).</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>21878-100MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (MODEL ISM444B)</td>
			<td>Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>631942-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa</td>
			<td>142-6044</td>
			<td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td>
			<td>29027886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>87206462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6140.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well on Lumox detachable</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6150.101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel - surgical Blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Silicone Tubing, 1/8&#34;ID x 1/4&#34;OD</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-95702-06</td>
			<td>Temperature range: &#8211;80 to 200&#176;C 
			Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PharMed BPT Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>AY242012</td>
			<td>Autoclavable 30 min at 121&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon LMT-55 Tubing</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics&#8482;</td>
			<td>15312022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat</td>
			<td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td>
			<td>300-0042</td>
			<td>230V, 90VA, 50Hz</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues

תעלות valved שונים ושסתומים רכוב סטנט משמשים עבור יצוא נכון חדרית בדרכי (RVOT) החלפת שסתום בחולים עם מחלת לב מולדת. בעת השימוש בחומרים תותבת עם זאת, אלה שתלי רגישים זיהומים חיידקיים ותגובות מארח שונים.
זיהוי גורמים בקטריאלי, המארח לשחק תפקיד חיוני endovascular הדבקות של מיקרואורגניזמים, יש חשיבות כדי להבין טוב יותר את הפתופיזיולוגיה של תחילת זיהומים כמו אנדוקרדיטיס זיהומית (IE) וכדי לפתח מניעתי אסטרטגיות. לפיכך, פיתוח מודלים המוסמכת לחקור אדהזיה חיידקי בתנאים הטיה פיזיולוגית נחוצה. כאן, אנו מתארים את השימוש החדש תוכנן במבחנה זלוף תא בהתבסס על לוחות מקבילים המאפשר שהמחקר של חיידקי ההקפדה מרכיבים שונים של השתלת רקמות כגון חשוף מטריצה חוץ-תאית, תאי אנדותל ואזורי אינרטי . שיטה זו בשילוב עם המושבה יוצרי יחידה (CFU) סופר מספיקה להעריך של הנטייה של שתל חומרים לקראת הדבקה חיידקית תחת זרימה. בהמשך, מערכת קאמרית הזרימה עשויה לשמש כדי לחקור את התפקיד של רכיבי הדם אדהזיה חיידקי בתנאים הטיה. להדגים כי המקור של רקמות, שלהם מורפולוגיה משטח וספציפיות חיידקים אינם היזע הגדולות בחיידקיים ההקפדה להשתיל רקמות באמצעות מודלי שלנו ללא צורך במיקור חוץ מעוצב במבחנה זלוף.

כדי להבין טוב יותר את המנגנונים מאחורי IE פיתוח, מודל זה מאפשר הערכת בקטריאלי ולהציג גורמים רקמות הקשורים במצב ויוו תחילת הזיהום.
בפירוט, הגישה הרומן במבחנה מאפשר לכמת אדהזיה חיידקי בתנאי זרימה לרקמות שונות השתל על ידי פרפו?...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues at JoVE.com

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

אנו מתארים שבאתר מעוצב במבחנה זרימה קאמרית מודל, אשר מאפשר החקירה של חיידקי ההקפדה להשתיל רקמות.

מודל במבחנה של מערכת מקבילה-Plate זלוף ללמוד חיידקי ההקפדה להשתיל רקמות

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בפתוגנזה של אנדוקרדיטיס מדביק, ופתוביוגרמות דרך שדות כגון יחסי הגומלין בין חיידקים, תאי דם ותאי אנדותל רירית שרירים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתלי הרקמה עשויים להיחשף ישירות לאינטראקציות הדדיות עם מטרות שונות, כגון חיידקים, טסיות דם וחלבונים בתנאי זרימה מתוקנים. המשמעות של טכניקה זו להרחיב את הטיפול שלנו של אנדוקרדיטיס מדביק, כי זה יכול לפענח אינטראקציות מולקולריות חשובות וגורמים המניעים להדביק גבוה של רקמות מסוימות.שיטה זו מספקת תובנה לתוך פתוגנזה של היווצרות צמחייה. זה יכול להיות ישים גם במחקרים החוקרים חן כלי דם, ניידות התא, ביטוי תאים גנים. כדי להתחיל את הפרוטוקול, למקם ביופסיה רקמה מוכן בעבר 10 מילימטרים קוטר, ואת אותו עובי בין מגלשת מיקרוסקופ וניקוב מעגלי שמונה מילימטר, אטם גומי עם המשטח הפנימי פונה כלפי מעלה, כדי ליצור קשר עם ההשעיה החיידקית.התמקד בכיוון השתלת הרקמה בעת הנחתו במחזיק. ודאו שהמשטח הפנימי של הרקמה כבר חשוף למחזור הדם כדי ליצור קשר עם המדיום הניסיוני שלכם. לאחר מכן, הכנס את המחזיק שלך עם הרקמה לתוך גיליון אטם כי הוא מוטבע במסגרת המתכת התחתונה של התא.חבר את מסגרת המתכת העליונה עם גיליון אטם המתאים על החלק התחתון של התא עם מחזיק הרקמה שהוכן בעבר. ואז להרכיב את התא כולו עם שמונה ברגים ולבורג אגוזים. ודא כי גובה התא הוא תמיד זהה על פני שתלים באמצעות caliper או סרגל.לאחר מכן חבר את תא הזרימה עם משאבה פריסטואלית. ואז לחבר את מאגר הנוזלים 400 מיליליטר עם הצינורות. לנטרל את הרקמות עם 100 מתלים מיליליטר של עשרה עד שבעת המושבה שכותרתו פלואורסצנטית להרכיב יחידות מלוחים מאגר פוספט עם הלחץ הטהור של שלושה סועדים לסנטימטר מרובע וקצב זרימה מתאים של ארבעה מיליליטר לדקה במשך שעה אחת באמצעות המשאבה peristaltic ואת מאגר החיידקים.Recirculate ברציפות ההשעיה חיידקי 100 מיליליטר באמצעות אותו מאגר איסוף. לאחר תדלוק, לפרק את התא כדי לשחרר את השתל. לשטוף את פיסת הרקמה פעמיים עם ארבעה מיליליטר של PBS בצלחת 12 גם באמצעות שייקר מסלולית במשך שלוש דקות.ואז לחתוך את החלק הפנימי של השתל באמצעות אגרוף ביופסיה העור עם קוטר קטן יותר. מניחים כל ביופסיה רקמה לתוך צינור נפרד 14 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של סטרילי 0.9% נתרן כלורי. לנתק את החיידקים מן הרקמה באמצעות אמבטיה sonication במשך 10 דקות.הכינו צינור יחיד של 14 מיליליטר עם 10 מיליליטר של סטרילי 0.9% נתרן כלורי כדי לבצע דילול סדרתי של ההשעיה החיידקית המתקבלת לאחר sonication. תייג את הצינור מספר שתיים. הכן שלושה צינורות 14 מיליליטר עם 10 מיליליטר של סטרילי 0.9% נתרן כלורי עבור דילול סדרתי של ההשעיה החיידקית הראשונית נלקח לניסוי שפע.תייג את הצינורות מספר שלוש, מספר ארבע ומספר חמש. לאחר מכן, לאבטח שלוש צלחות אגר, אחד עבור חליטה חיידקית, אחד עבור חליטה שליטה של PBS, והשלישי עבור ההשעיה החיידקית הראשונית המשמשת חליטות. סמן שלושה סקטורים לכל צלחת לניסוי הרקמה באופן הבא:10-1, 10-3 ו- 10-4.כדי לספור את מספר היחידות יוצרות המושבה בהתבולות החיידקיות, סמן את הלוח כדלקמן: 10-1, 10-3, 10-5 ו- 10-7. מערבולת הצינורות המכילים את ביופסיית הרקמה במשך 15 שניות כל אחד, כדי לבצע דילול סדרתי. כדי להכין את הדילולים הסדרתיים, להעביר 100 microliters של צינור מספר אחד לצינור מספר שתיים, ומערבולת הצינור לערבב ביסודיות את הפתרון.להפיץ 100 microliters של התוכן של צינור מספר אחד ומספר שתיים על המגזרים המתאימים, 10-1 ו 10-3 של צלחת אגר. ואז להפיץ 10 microliters של צינור מספר שתיים על מגזר 10 ארבעה. חזור על שלב זה ארבע פעמים כדי להשיג ארבע גידולים נפרדים מכל נפח של 10 microliters.כדי להכין דילול סדרתי של התרבות הראשונית, מערבולת ראשונה את הדילול במשך 15 שניות ולהעביר 100 microliters של השעיה חיידקית לצינור מספר שלוש, ומערבבים במרץ על ידי מערבולת. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של צינור מספר שלוש לצינור מספר ארבע ומערבבים שוב. חזור על ההליך לצינור מספר חמש מצינור מספר ארבע.להפיץ 100 microliters של התוכן של צינורות מספר שלוש, מספר ארבע, מספר חמש, ואת התרבות הראשונית שכותרתו בהתאמה על מגזרים 10-3, 10-5, 10-7, ו 10-1 של צלחת אגר הדם. השאירו את צלחות אגר הדם מתחת למכסה המנוע למינאר כדי לייבש את התפשטות החיידקים, בדרך כלל במשך 10 דקות. לאחר מכן, מניחים את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עבור דגירה לילה.לאחר הדגירה לילה, לספור את המושבות חיידקי כדי להשיג את מספר CFUs. בתנאי לחץ, התקשרות חיידקית דומה על פני רקמות השתל השונות נצפתה הן עבור סטפילוקוקוס אוראוס והן זיהום אפידרמידיס סטפילוקוקוס. בעקבות ההליכים, סטרפטוקוקוס sanguinis הפגין הפחתה משמעותית של דבקות בקיר וריד הצווארי, בהשוואה לתיקון פריקארדיום bovine.כאשר משווים את שלושת המינים של חיידקים, סטרפטוקוקוס sanguinis מציג הידבקות נמוכה משמעותית לקיר וריד הצווארי של חזיר ביחס סטפילוקוקוס aureus ו staphylococcus epidermidis. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהכין רקמות נכונות של אותו ראש. הוא יבטיח תנאים דומים בכל דגימות הניסוי וימזער את השונות בנתונים בין סדרות ניסויים שונות.לאחר התפתחותה, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את מערכות ההפרעה המורכבות באופן צעד אחר צעד על ידי העשרת הגישות שלהם במודל החוץ-חוץ-חוץ-מערכתי עם אלמנטים שונים כדי לבנות מורכבות מלאה קרוב למצב הרפואי.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

רומן<em&gt; אקס אובו</em&gt; טכניקת פסים לאלטר ופרמטרים המודינמיים intracardiac במערכת עוף עוברי

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

במבחנה מודלים Vivo ללמוד קרנית האנדותל-mesenchymal מעבר

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

5-mc נקודה כתם Assay לכמת את מתילציה DNA רמת Chondrocyte Dedifiationiation<em&gt; במבחנה</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

כולה-הר מיקרוסקופיה קונפוקלית לעור מבוגר האוזן: מערכת מודל ללמוד מורפוגנזה מסעף נוירו-וסקולרית והפצה תא החיסון

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

מודל Hyperandrogenic העכבר ללמוד תסמונת השחלות הפוליציסטיות

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C UV-C Damage

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

מעקב גנטי שבטים באמצעות עכבר קונפטי למחקר רקמות מינרליזציה

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...