Name: an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Questo studio è stato sponsorizzato da un grant di ricerca fondo KU Leuven (OT/14/097) dato a RH. TRV è stato borsista della Fondazione di ricerca FWO - Flanders (Belgio; Concedere il numero - 12K0916N) e RH è supportato dalla clinica ricerca fondo di UZ Lovanio.

1. preparazione dell'innesto tessuti per studi In Vitro
Nota: Sono stati utilizzati tre tipi di tessuti: innesti crioconservati omotrapianto (CH) e la vena giugulare bovina (BJV), patch di pericardio bovino (BP). In caso di BJV conduit e CH (tessuto trattati da Banca europea di omotrapianto (EHB) e conservati in azoto liquido prima dell'uso), sono stati utilizzati valvolari sia a parete. Patch di BP e BJV condotto sono stati acquistati dai produttori. Prima dell'uso, scongelare il CH se...

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Le osservazioni cliniche recenti dare consapevolezza speciale a IE come complicazione in pazienti sottoposti a sostituzione della valvola del RVOT6,13. Disfunzione della valvola impiantata in IE è il risultato dell'interazione batterica con l'innesto di endovascular che conduce al vasto infiammatorio e procoagulante reazioni1,14. Il modello presentato romanzo in vitro ci ha permesso di indagare ...

Staphylococcus aureus (S. aureus) impiega una varietà di strategie di virulenza di aggirare il sistema di difesa immunitaria ospite colonizzando superfici biologiche o non biologici impiantate nella circolazione umana, che porta a gravi infezioni intravascolari come sepsi e IE1,2,3,4,5. Resti di IE un importante trattamento complicanze nei pazienti dopo l'impianto di valvole cardiache protesiche mentre singoli fattori che contribuiscono all'insorgenza di IEare non ancora pienamente compreso6,7. In condizioni di flusso, batteri ritrovarvi con le forze di taglio, di cui hanno bisogno per superare allo scopo di rispettare il vaso muro8. Modelli, che consentono di studiare l'interazione tra batteri e tessuto della valvola prostetica o endotelio sotto flusso, sono di interesse in quanto riflettono la situazione in vivo più.
Parecchi meccanismi specifici facilitano l'aderenza batterica alle cellule endoteliali (ECs) e alla matrice subendothelial esposta (ECM) che porta alla colonizzazione dei tessuti e alla maturazione delle vegetazioni, essendo essenziali punti iniziali in IE9. Varie proteine di superficie stafilococciche o MSCRAMMs (microbiche superficiale componenti riconoscere molecole matrice adesiva) sono stati descritti come mediatori di adesione di cellule dell'ospite e di proteine ECM interagendo con le molecole come fibronectina, fattore di fibrinogeno, collagene e von Willebrand (VWF)8,10,11. Tuttavia, in considerazione di pieghevole intra-molecolari di alcuni fattori di virulenza, per lo più studiati in condizioni statiche, molte di queste interazioni possono avere rilevanza diversa nelle infezioni endovascolari nel sangue circolante.
Pertanto, vi presentiamo un interno progettato in vitro flusso parallelo-piastra camera modello, che permette di valutare l'aderenza batterica ai diversi componenti della ECM ed ECs nel contesto degli innesti del tessuto impiantato in posizione RVOT. L'obiettivo generale del metodo descritto in questo lavoro è quello di studiare i meccanismi di interazione tra batteri e tessuti sottostanti endovascular in condizioni di flusso, che sono strettamente legate all'ambiente in vivo degli agenti patogeni di circolazione sanguigna come S. aureus. Questo nuovo approccio si concentra sulla suscettibilità delle superfici di tessuto di innesto di aderenza batterica per identificare potenziali fattori di rischio per lo sviluppo di Internet Explorer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium</td>
			<td>Synovis Surgical Innovations, USA</td>
			<td>PC-0404SN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Jugular Vein conduits (BJV)</td>
			<td>Contegra conduit; Medtronic Inc, USA</td>
			<td>M333105D001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH cryopreserved homograft</td>
			<td>European Homograft Bank (EHB)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acu-Punch</td>
			<td>Acuderm Inc, USA</td>
			<td>P850 (8 mm); P1050 (10 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Albumin</td>
			<td>Flexbumin; Baxter, Belgium</td>
			<td>BE171464 
			LOT:16G12C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Fluka, Steinheim, Germany</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heart infusion broth (BHI)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS).</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>21878-100MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (MODEL ISM444B)</td>
			<td>Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>631942-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa</td>
			<td>142-6044</td>
			<td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td>
			<td>29027886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>87206462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6140.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well on Lumox detachable</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6150.101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel - surgical Blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Silicone Tubing, 1/8&#34;ID x 1/4&#34;OD</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-95702-06</td>
			<td>Temperature range: &#8211;80 to 200&#176;C 
			Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PharMed BPT Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>AY242012</td>
			<td>Autoclavable 30 min at 121&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon LMT-55 Tubing</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics&#8482;</td>
			<td>15312022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat</td>
			<td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td>
			<td>300-0042</td>
			<td>230V, 90VA, 50Hz</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues

Vari Tubi valvolati e stent-montate valvole sono utilizzati per sostituzione della valvola di efflusso del ventricolo destro (RVOT) del tratto in pazienti con cardiopatia congenita. Quando si utilizza materiali protesici tuttavia, questi innesti sono suscettibili di infezioni batteriche e varie risposte dell'ospite.
Identificazione dei fattori batterici e host che svolgono un ruolo vitale in endovascular aderenza dei microrganismi è di importanza per comprendere meglio la fisiopatologia di insorgenza di infezioni come l'endocardite infettiva (IE) e di sviluppare misure preventive strategie. Pertanto, lo sviluppo di modelli competenti a indagare adesione batterica in condizioni fisiologiche taglio è necessario. Qui, descriviamo l'uso di una nuova concezione in vitro aspersione camera basato su piastre parallele che permette che lo studio di aderenza batterica ai diversi componenti dei tessuti dell'innesto esposto come matrice extracellulare, cellule endoteliali e zone inerti . Questo metodo combinato con formazione di colonie (CFU) contando unitàè adeguato per valutare la propensione di materiali d'innesto all'adesione batterica sotto flusso. Ulteriormente, il sistema dell'alloggiamento di flusso potrebbe essere utilizzato per studiare il ruolo di emocomponenti in adesione batterica in condizioni di taglio. Abbiamo dimostrato che l'origine del tessuto, loro morfologia superficiale e la specificità di specie batteriche non sono i principali fattori determinanti in aderenza batterica all'innesto di tessuti utilizzando il nostro modello di aspersione in-House progettata in vitro .

Per comprendere meglio i meccanismi dietro IE sviluppo, questo modello consente la valutazione di batterico e tessuto connesso fattori presenti nella situazione in vivo dell'inizio di infezione.
In dettaglio, l'approccio di romanzo in vitro permette di quantificare adesione batterica in condizioni di flusso ai tessuti diversi innesto irrorando fluorescente identificati batteri sopra i tessuti esercitan...

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An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Descriviamo un interno progettato in vitro camera modello di flusso, che permette l'indagine di aderenza batterica all'innesto di tessuti.

Un modello In Vitro di un sistema di perfusione di piatti paralleli per studiare l'aderenza batterica per l'innesto di tessuti

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella patogenesi dell'endocardite infettiva e dei pathobiogrammi attraverso campi come l'interazione tra batteri, cellule del sangue e cellule endoteliali che rivestono muscolatura. Il principale vantaggio di questa tecnica è che gli innesti tissutali potrebbero essere direttamente esposti a interazioni reciproche con vari bersagli, come batteri, piastrine e proteine in condizioni di flusso standardizzate. L'implicazione di questa tecnica si estende alla nostra terapia dell'endocardite infettiva, perché può svelare importanti interazioni molecolari e fattori che guidano un'elevata infettività di alcuni tessuti.Questo metodo fornisce informazioni sulla patogenesi della formazione della vegetazione. Può anche essere applicabile in studi che studiano la permeabilità vascolare, la mobilità cellulare e l'espressione delle cellule geniche. Per iniziare il protocollo, posizionare una biopsia tissutale precedentemente preparata di 10 millimetri di diametro e lo stesso spessore tra uno scivolo del microscopio e una perforazione circolare di otto millimetri e una guarnizione di gomma con la superficie interna rivolta verso l'alto, per contattare la sospensione batterica.Concentrarsi sull'orientamento dell'innesto tissutale mentre è posizionato nel supporto. Assicurarsi che la superficie interna del tessuto sia già esposta alle facce del flusso sanguigno fino a contattare il mezzo sperimentale. Quindi, inserire il supporto con il tessuto nella guarnizione incorporata nel telaio metallico inferiore della camera.Attaccare il telaio in metallo superiore con la relativa guarnizione sul fondo della camera con il porta tessuto inserito in precedenza. Quindi montare l'intera camera con otto viti e dadi a vite. Assicurarsi che l'altezza della camera sia sempre la stessa tra gli innesti utilizzando una pinza o un righello.Collegare quindi la camera di flusso con una pompa peristaltica. Quindi collegare il serbatoio del fluido da 400 millilitri con i tubi. Perfondi i tessuti con sospensioni da 100 millilitri da dieci alle sette unità di formazione della colonia etichettate fluorescentmente in salina tamponata con fosfato con lo stress pura di tre dines per centimetro quadrato e la corrispondente portata di quattro millilitri al minuto per un'ora utilizzando la pompa peristaltica e il serbatoio batterico.Ricircolare continuamente le sospensioni batteriche da 100 millilitri utilizzando lo stesso serbatoio di raccolta. Dopo la perfusione, smontare la camera per rilasciare l'innesto. Lavare il pezzo di tessuto due volte con quattro millilitri di PBS in una piastra da 12 pozzetti usando uno shaker orbitale per tre minuti.Quindi tagliare la parte interna dell'innesto usando un punzone di biopsia della pelle con un diametro inferiore. Mettere ogni biopsia tissutale in un tubo separato da 14 millilitri contenente un millilitro di cloruro di sodio sterile 0,9%. Staccare i batteri dal tessuto utilizzando un bagno di sonicazione per 10 minuti.Preparare un singolo tubo da 14 millilitri con 10 millilitri di cloruro di sodio sterile allo 0,9% per effettuare diluizioni seriali della sospensione batterica ottenuta dopo la sonicazione. Etichettare il tubo numero due. Preparare tre tubi da 14 millilitri con 10 millilitri di cloruro sterile allo 0,9% di sodio per le diluizioni seriali della sospensione batterica iniziale portata all'esperimento di profusione.Etichettare i tubi numero tre, numero quattro e numero cinque. Successivamente, fissare tre piastre di agar, una per la perfusione batterica, una per la perfusione di controllo del PBS e la terza per la sospensione batterica iniziale utilizzata per le perfusioni. Etichettare tre settori per piastra per l'esperimento tissutale nel modo seguente:10-1, 10-3 e 10-4.Per contare il numero di unità che formano colonie nella perfusazione batterica, etichettare la piastra come segue:10-1, 10-3, 10-5 e 10-7. Vortice i tubi contenenti la biopsia tissutale per 15 secondi ciascuno, per effettuare diluizioni seriali. Per preparare le diluizioni seriali, trasferire 100 microlitri del tubo numero uno nel tubo numero due e vortice del tubo per mescolare accuratamente la soluzione.Stendere 100 microlitri del contenuto del tubo numero uno e numero due nei settori corrispondenti, 10-1 e 10-3 della piastra di agar. Quindi distribuire 10 microlitri di tubo numero due sul settore 10 quattro. Ripetere questo passaggio quattro volte per ottenere quattro escrezioni separate da ogni volume di 10 microlitri.Per preparare le diluizioni seriali della coltura iniziale, prima vortice la diluizione per 15 secondi e trasferire 100 microlitri di sospensione batterica al tubo numero tre, e mescolare vigorosamente mediante vortice. Aggiungere 100 microlitri di tubo numero tre al tubo numero quattro e mescolare di nuovo. Ripetere la procedura per il tubo numero cinque dal tubo numero quattro.Distribuire 100 microlitri del contenuto dei tubi numero tre, numero quattro, numero cinque e la coltura iniziale etichettata rispettivamente sui settori 10-3, 10-5, 10-7 e 10-1 della piastra di agar del sangue. Lasciare le piastre di agar nel sangue sotto il cappuccio laminare per asciugare all'aria le diffondezioni batteriche, in genere per 10 minuti. Successivamente, posizionare le piastre a 37 gradi Celsius per l'incubazione notturna.Dopo l'incubazione notturna, conta le colonie batteriche per ottenere il numero di CFC. In condizioni di stress pura, è stato osservato un simile attaccamento batterico attraverso i vari tessuti di innesto sia per l'infezione da stafilococco aureo che per l'infezione da stafilococco epidermidis. Seguendo le procedure, lo streptococco sanguinis ha mostrato una significativa riduzione dell'aderenza alla parete spettrale giugulare bovina, rispetto alla macchia di pericardio bovino.Quando si confrontano le tre specie di batteri, lo streptococco sanguinis presenta un'adesione significativamente inferiore alla parete spettrale giugulare bovina in relazione allo stafilococco aureo e allo stafilococco epidermidis. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di aver preparato tessuti corretti della stessa testa. Garantirà condizioni simili in tutti i campioni di esperimento e ridurrà al minimo la variabilità dei dati tra diverse serie di esperimenti.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare i complessi sistemi di disturbo passo dopo passo arricchendo i loro approcci modello in vitro con diversi elementi per costruire una piena complessità vicino allo stato medico.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Clonal Genetic Tracing utilizzando il mouse Corfetti per studiare i tessuti mineralizzati

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Ibridazione dell'intero Monte In Situ negli embrioni di pesce zebra e nella formazione dei tubi, analisi dei prodotti iPSC-EC per studiare il ruolo dell'endoglin nello sviluppo vascolare

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...