Name: an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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本研究は、RH に与えられた研究基金ルーヴェン (OT/14/097) の助成金によって後援されました。TRV は FWO 研究財団 - フランダース (ベルギー; 博士研究員許可番号 - 12K0916N) と RH は UZ ルーヴェン臨床研究基金でサポートされます。

1.体外研究移植組織の準備
注: 組織の 3 つのタイプは使用された: ウシ心膜パッチ (BP)、凍結保存同種 (CH) および牛の頚静脈移植 (BJV)。BJV 導管、CH (組織処理欧州同種銀行 (エッブ) によって、液体窒素を使用する前に格納されている) の場合は、壁と弁のリーフレットの両方が使用されました。BP パッチと BJV 電線管は、メーカーから購入しました。使用前に次のエッ?...

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	<li>Que, Y. A., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infective+endocarditis.">Infective endocarditis.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).</li><li>Werdan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+infective+endocarditis:+pathogen-host+interaction+and+risk+states.">Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states.</a> Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).</li><li>Moreillon, P., Que, Y. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+hemodynamic+outcomes+up+to+7+years+after+transcatheter+pulmonary+valve+replacement+in+the+US+melody+valve+investigational+device+exemption+trial.">Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial.</a> Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).</li><li>Que, Y. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+stress+increases+ICAM-1+and+decreases+VCAM-1+and+E-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-[alpha]+in+endothelial+cells.">Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).</li><li>Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. 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最近の臨床所見は、慢性6,13の弁置換術を受けた患者における合併症として IE に特別な意識を与えます。IE で注入弁の機能不全は、広範な炎症と凝血促進反応1,14につながる血管グラフトと細菌の相互作用の結果です。提示された新規の in vitroモデルでは、組織構造および細菌性因子の相違が生?...

黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌) は、さまざまな病原性敗血症など重症の血管内感染につながる人間の循環注入生物や非生物の表面を植民地化ホストの免疫の防衛システムを回避する戦略を採用していて、IE1,2,3,4,5。IE のまま患者の IEare の発症に貢献することの個々 の要因がまだ完全に理解6,7人工心臓弁の移植後合併症が重要な治療に関連付けられています。流れの条件の下で細菌が発生せん断力容器壁8に準拠するために克服する必要があります。彼らはより多くの体内の状況を反映して、流れの下で血管内皮細胞や人工弁組織細菌間の相互作用を研究することで、モデル、関心です。
いくつかの特定のメカニズムは、血管内皮細胞 (Ec) へと組織の植民地化と植生、IE9の重要な初期の手順の中の成熟に至る露出内皮下マトリックス (ECM) に細菌の付着を促進します。様々 なブドウ球菌表面蛋白または MSCRAMMs (認識性接着剤マトリックス分子微生物表面部材) が, フィブロネクチンなどの分子との相互作用によって宿主細胞と ECM タンパク質の付着仲介人として記載されています。フィブリノーゲン、コラーゲン、フォン ・ ヴィレブランド因子 (VWF)8,10,11。ただし、大抵静的な条件で研究のいくつかの病原因子の分子内折りたたみの観点からこれらの相互作用の多くは循環血液中血管内感染の異なる関連性にあります。
本稿で、社内に設計された体外平行平板流チャンバー モデル、慢性位置に注入する組織移植のコンテキストで ECM と ECs のさまざまなコンポーネントへの細菌付着の評価を可能にします。この作品で説明されているメソッドの全体的な目的は細菌やよう血液中の病原体の生体内環境に密接に関連の流れの条件の基になる血管内の組織間の相互作用のメカニズムを研究するには黄色ブドウ球菌。この斬新なアプローチは、IE の開発のための潜在的なリスク要因を識別するために細菌の付着を移植組織表面の感受性に焦点を当てています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium</td>
			<td>Synovis Surgical Innovations, USA</td>
			<td>PC-0404SN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Jugular Vein conduits (BJV)</td>
			<td>Contegra conduit; Medtronic Inc, USA</td>
			<td>M333105D001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH cryopreserved homograft</td>
			<td>European Homograft Bank (EHB)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acu-Punch</td>
			<td>Acuderm Inc, USA</td>
			<td>P850 (8 mm); P1050 (10 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Albumin</td>
			<td>Flexbumin; Baxter, Belgium</td>
			<td>BE171464 
			LOT:16G12C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Fluka, Steinheim, Germany</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heart infusion broth (BHI)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS).</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>21878-100MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (MODEL ISM444B)</td>
			<td>Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>631942-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa</td>
			<td>142-6044</td>
			<td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td>
			<td>29027886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>87206462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6140.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well on Lumox detachable</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6150.101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel - surgical Blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Silicone Tubing, 1/8&#34;ID x 1/4&#34;OD</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-95702-06</td>
			<td>Temperature range: &#8211;80 to 200&#176;C 
			Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PharMed BPT Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>AY242012</td>
			<td>Autoclavable 30 min at 121&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon LMT-55 Tubing</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics&#8482;</td>
			<td>15312022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat</td>
			<td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td>
			<td>300-0042</td>
			<td>230V, 90VA, 50Hz</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues

様々 なバルブ付き導管とステントに取り付けられたバルブは、先天性心疾患患者における右室流出路 (慢性) 弁置換に使用されます。しかし補綴用材料を使用して、これらの移植が細菌感染と様々 な宿主反応を受けやすいです。
重要な役割を果たす微生物の血管内付着細菌とホスト因子の同定が重要である感染性心内膜炎 (IE) などの感染症の発症の病態生理を理解し、予防を開発するには戦略。そのため、生理学的せん断条件下で細菌の付着を調査する有能なモデルの開発が必要です。ここでは、新しく設計された体外灌流チャンバー平行平板に基づく移植組織のさまざまなコンポーネントへの細菌付着に関する研究など細胞外マトリックス、内皮細胞および不活性領域を公開することができますの使用について述べる.このメソッドはコロニー形成と組み合わせるユニット (CFU) カウントは移植材の流れの下で細菌の粘着の方の傾向を評価する適切な。さらに、流れ溜まりされる可能性がありますせん断条件下で細菌の付着の血液成分の役割を調査するため。我々 は、組織、形態、および菌種特異性のソースは当社社内に設計された体外灌流モデルを用いた組織を移植への細菌付着の主要な決定要因ではないことを示した。

背後にあるメカニズムを理解するIE の開発、このモデルにより、細菌の評価と感染症発症の体内状況に存在する関連付けられた組織因子。
詳しくは、新規体外アプローチにより、3-10 ダインの生理的な範囲でせん断応力を発揮する組織に蛍光に分類された細菌を灌によって異なる移植組織へのフロー条...

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An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

私たちは、社内に設計された体外流れ商工会議所モデル、移植組織の細菌付着の検討を可能にするについて説明します。

移植組織の細菌付着を勉強する平行平板灌流システムのIn Vitroモデル

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

この方法は、細菌、血液細胞、筋肉を裏打ちする内皮細胞間の相互作用などの分野を通じて、感染性心内膜炎の病因の主要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、組織移植片が標準化された流れの条件で細菌、血小板、タンパク質などの様々な標的との相互相互作用に直接さらされる可能性があることです。この技術の意味は、重要な分子相互作用と特定の組織の高い感染性を促進する要因を解明することができるので、感染性心内膜炎の治療にも及ぶ。この方法は、植生形成の病因に関する洞察を提供する。血管透過性、細胞移動性、遺伝子細胞発現を調査する研究にも応用可能です。プロトコルを開始するには、以前に調製した組織生検を直径10ミリメートル、顕微鏡スライドと8ミリメートルの円形穿孔の間に同じ厚さと、内面を上に向けたゴム製ガスケットを置き、細菌懸濁液に接触させる。ホルダーに入れたまま組織移植の向きに焦点を合わせます。組織の内面が既に血流面に露出していることを確認し、実験媒体に接触するようにしてください。次に、チャンバーの下部の金属フレームに埋め込まれているガスケットシートに組織を持つホルダーを挿入します。上部の金属フレームと対応するガスケットシートを、以前に挿入した組織ホルダーを使用してチャンバの底部に取り付けます。その後、8本のネジとネジナットでチャンバー全体を取り付けます。キャリパーまたは定規を使用して、チャンバーの高さが常に移植片全体で同じであることを確認します。次に、流れチャンバを蠕動ポンプで接続します。その後、チューブで400ミリリットルの流体貯留層を接続します。蠕動ポンプと細菌貯留層を使用して1時間あたり3回の食事と毎分4ミリリットルの対応する流量の完全なストレスを持つリン酸緩衝生理食塩水の7つの蛍光標識コロニー形成ユニットに100ミリリットルの懸濁液を100ミリリットルの組織を浸透させます。同じ回収槽を使用して100ミリリットルの細菌懸濁液を連続的に再循環させる。灌流後、チャンバーを解体して移植片を放出する。軌道シェーカーを使用して12ウェルプレートで4ミリリットルのPBSで組織片を2回洗浄します。次に、より小さい直径の皮膚生検パンチを使用して移植片の内側部分を切断する。各組織生検を、1ミリリットルの無菌0.9%塩化ナトリウムを含む別々の14ミリリットルチューブに入れる。10分間超音波処理浴を使用して組織から細菌を取り外します。10ミリリットルの無菌0.9%塩化ナトリウムを用いた単一の14ミリリットルチューブを準備し、超音波処理後に得られた細菌懸濁液の連続希釈液を作ります。チューブ番号 2 にラベルを付けます。10ミリリットルの無菌0.9%塩化ナトリウムを用いて、14ミリリットルのチューブを3本用意し、最初の細菌懸濁液を実験に取り込んだ。チューブ番号3、4番、5番にラベルを付けます。次に、3枚の寒天プレートを確保し、1つは細菌灌流用、1つはPBSの制御灌流用、3つ目は灌流に使用される初期細菌懸濁液用に備える。次の方法で組織実験のためのプレートあたり3つのセクターにラベルを付けます:10-1、10-3、および10-4。細菌の浸透中のコロニー形成単位の数を数えるために、次のようにプレートにラベルを付ける:10-1、10-3、10-5、および10-7。各15秒間、組織生検を含むチューブをボルテックスし、連続希釈液を作る。シリアル希釈液を調製するには、チューブ番号1の100マイクロリットルをチューブナンバー2に移し、チューブをボルテックスして溶液を完全に混合します。チューブ番号1とナンバー2の内容物の100マイクロリットルを、寒天板の10-1と10-3の対応するセクターに広げます。その後、セクター10 4にチューブナンバー2の10マイクロリットルを広げます。このステップを4回繰り返して、10マイクロリットルの各体積から4つの別々の成長を得る。初期培養の連続希釈を調製するために、まず15秒間希釈し、100マイクロリットルの細菌懸濁液をチューブ3に移し、渦によって激しく混合した。チューブ番号4にチューブ番号3の100マイクロリットルを追加し、再び混合します。チューブ番号4からチューブ番号5の手順を繰り返します。チューブ番号3、ナンバー4、5、および標識された初期培養物の内容物の100マイクロリットルを、それぞれ血液寒天板の10-3、10-5、10-7、および10-1のセクターに広げる。薄層フードの下に血液寒天プレートを残して、細菌の広がりを空気乾燥させ、通常は10分間乾燥させる。その後、プレートを摂氏37度に置き、一晩のインキュベーションを行います。一晩インキュベーションした後、細菌コロニーを数えてCFUsの数を得る。全くのストレス状態下では、ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌感染の両方について、様々な移植片組織にわたる同様の細菌付着が観察された。手順に従って、レンサ球菌サンギニスは、牛の心膜パッチと比較した場合、牛頸静脈壁への付着の有意な減少を示した。3種の細菌を比較すると、サングイニスは、ブドウ球菌およびブドウ球菌表皮症に関連して、牛頸静脈壁への接着性が有意に低い。この手順を試みる間、同じ頭部の正しい組織を準備することを忘れないでください。すべての実験標本で同様の条件を保証し、異なる一連の実験間のデータ変動を最小限に抑えます。その開発後、この技術は、研究者が医学的地位に近い完全な複雑さを構築するために、異なる要素を持つ彼らのインビトロモデルアプローチを豊かにすることによって、段階的に複雑な障害システムを探求することを可能にします。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

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小説<em&gt;例OVO</emニワトリ胚のシステムで心臓内血行動態を変えるために&gt;バンディングテクニック

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

前駆細胞が媒介する肝細胞の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

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in vitroおよびin vivoモデルで角膜内皮間葉転換を研究します

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

軟骨細胞分化のDNAメチル化レベルを定量化する5-mCドットブロットアッセイ<em&gt;インビトロ</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

大人の耳の皮膚の共焦点顕微鏡を全取り付ける: 神経血管分岐の形態形成と免疫細胞の分布を検討するモデル システム

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

ニワトリ胚組織の開発培養法

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

多嚢胞性卵巣症候群を研究するハイパーアンドロゲン マウス モデル

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

Assessment of Oxidative Damage in the Primary Mouse Ocular Surface Cells/Stem Cells in Response to Ultraviolet-C (UV-C) Damage

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紫外C(UV-C)損傷に対する主なマウス眼表面細胞/幹細胞における酸化的損傷の評価

The ocular surface is subjected to regular wear and tear due to various environmental factors. Exposure to UV-C radiation constitutes an occupational ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

ミネラル化組織を研究するために紙吹雪マウスを用いてクローン遺伝トレース

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...