Name: an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Este estudio fue patrocinado por una beca de la investigación fondo KU Leuven (OT/14/097) a RH. TRV fue Becario Postdoctoral de la Fundación de investigación FWO - Flandes (Bélgica; Concesión número - 12K0916N) y RH es apoyado por el fondo de investigación clínica de UZ Lovaina.

1. preparación de tejidos de injerto In Vitro estudios
Nota: Se utilizaron tres tipos de tejidos: parche de pericardio bovino (BP), injertos de homoinjerto criopreservado (CH) y la vena yugular bovina (BJV). En caso de conducto BJV y CH (tejido por el Banco Europeo de homoinjerto (EHB) y almacenado en nitrógeno líquido antes de usar), la pared y valvas valvulares fueron utilizados. Parche de BP y conducto BJV fueron comprados a los fabricantes. Antes de utilizar, descongele CH siguie...

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Observaciones clínicas recientes dan especial sensibilización a IE como complicación en pacientes sometido a reemplazo de la válvula del TSVD6,13. Disfunción de la válvula implantada en IE es el resultado de la interacción bacteriana con el injerto endovascular conduce a extenso inflamatorios y procoagulantes reacciones1,14. El modelo presenta novela en vitro nos permitió investigar si la...

Staphylococcus aureus (S. aureus) emplea una variedad de estrategias de virulencia para eludir el sistema de defensa inmune huésped colonizar superficies biológicas o no biológicas implantadas en la circulación humana, que conduce a infecciones intravasculares graves como sepsis y IE1,2,3,4,5. Restos de IE un importante tratamiento asociado de complicación en los pacientes después de la implantación de válvulas cardíacas protésicas y factores individuales que contribuyen a la aparición de IEare no todavía completamente entendido6,7. Bajo condiciones de flujo, las bacterias encuentran fuerzas de esquileo, que necesitan vencer para adherirse a la pared de vaso8. Modelos, que permiten estudiar la interacción entre bacterias y tejido de válvula protésica o endotelio bajo flujo, son de interés ya que reflejan la situación en vivo más.
Varios mecanismos específicos facilitan la adherencia bacteriana a las células endoteliales (ECs) y la matriz subendothelial expuestas (ECM) hacia la colonización de tejidos y la maduración de la vegetación, siendo los primeros pasos esenciales en IE9. Diversas proteínas superficiales Estafilocócicas o MSCRAMMs (componentes superficiales microbianos reconociendo las moléculas adhesivas de la matriz) han sido descritos como mediadores de adherencia a las células del huésped y las proteínas de la ECM interactuando con moléculas como la fibronectina, fibrinógeno, colágeno y von Willebrand factor (FvW)8,10,11. Sin embargo, en vista de plegamiento intra moleculares de algunos factores de virulencia, sobre todo estudiados en condiciones estáticas, muchas de estas interacciones pueden tener diferente importancia en infecciones endovasculares en la sangre circulante.
Por lo tanto, presentamos un casa diseñada en vitro placas paralelas cámara modelo de flujo, que permite la evaluación de la adherencia bacteriana a diferentes componentes de la ECM y ECs en el contexto de los injertos de tejido implantado en la posición del TSVD. El propósito general del método descrito en este trabajo es estudiar los mecanismos de interacción entre las bacterias y los tejidos subyacentes de endovascular en condiciones de flujo, que están estrechamente relacionadas con el medio ambiente en vivo de los agentes patógenos de la sangre tales como S. aureus. Este nuevo enfoque se centra en la susceptibilidad de las superficies de tejido de injerto a la adherencia bacteriana para identificar posibles factores de riesgo para el desarrollo de la IE.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Pericardium (BP) patch, Supple Peri-Guard Pericardium</td>
			<td>Synovis Surgical Innovations, USA</td>
			<td>PC-0404SN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Jugular Vein conduits (BJV)</td>
			<td>Contegra conduit; Medtronic Inc, USA</td>
			<td>M333105D001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH cryopreserved homograft</td>
			<td>European Homograft Bank (EHB)</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acu-Punch</td>
			<td>Acuderm Inc, USA</td>
			<td>P850 (8 mm); P1050 (10 mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Albumin</td>
			<td>Flexbumin; Baxter, Belgium</td>
			<td>BE171464 
			LOT:16G12C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic soy broth (TSB)</td>
			<td>Fluka, Steinheim, Germany</td>
			<td>22092-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heart infusion broth (BHI)</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>53286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS).</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-Carboxyfluorescein N-hydroxysuccinimide ester (CF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>21878-100MG-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (MODEL ISM444B)</td>
			<td>Ismatec BVP-Z Standard; Cole Parmer, Wertheim, Germany</td>
			<td>631942-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonication bath</td>
			<td>VWR Ultrasonic Cleaner; VWR, Radnor, Pa</td>
			<td>142-6044</td>
			<td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen by ThermoFisher</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner)</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td>
			<td>29027886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Pro VF - ultrapure water - H2O MilliQ</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>87206462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6140.102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well on Lumox detachable</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>94.6150.101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel - surgical Blades</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Silicone Tubing, 1/8&#34;ID x 1/4&#34;OD</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-95702-06</td>
			<td>Temperature range: &#8211;80 to 200&#176;C 
			Sterilize: With ethylene oxide, gamma irradiation, or autoclave for 30 min, 15 psi of pressure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PharMed BPT Tubing</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>AY242012</td>
			<td>Autoclavable 30 min at 121&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon LMT-55 Tubing</td>
			<td>Saint Gobain Performance Plastics&#8482;</td>
			<td>15312022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostat</td>
			<td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td>
			<td>300-0042</td>
			<td>230V, 90VA, 50Hz</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model of a parallel-plate perfusion system to study bacterial adherence to graft tissues

Varios conductos de válvulas y válvulas montada en stent se utilizan para reemplazo de la válvula de salida de ventrículo derecho (TSVD) de la zona en pacientes con enfermedad cardíaca congénita. Al utilizar materiales protésicos sin embargo, estos injertos son susceptibles a infecciones bacterianas y varias respuestas de host.
Es la identificación de factores bacterianos y host que juegan un papel vital en endovascular adherencia de microorganismos de importancia para comprender mejor la fisiopatología de la aparición de infecciones como la endocarditis infecciosa (EI) y desarrollar la prevención estrategias. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de modelos competentes para investigar adherencia bacteriana bajo condiciones fisiológicas del esquileo. Aquí, describimos el uso de un nuevo diseño en vitro perfusión cámara basado en placas paralelas que permite que el estudio de la adherencia bacteriana a diferentes componentes de los tejidos del injerto expuso como matriz extracelular, las células endoteliales y áreas inertes . Este método combinado con la formación de Colonia unidad (UFC) de conteo es adecuada para evaluar la propensión de los materiales de injerto hacia adherencia bacteriana bajo flujo. Además, podría utilizarse el sistema de cámara de flujo para investigar el papel de los componentes de la sangre en la adhesión bacteriana bajo condiciones de corte. Hemos demostrado que el origen del tejido, su morfología superficial y la especificidad de especies bacterianas no son los principales factores determinantes en la adhesión bacteriana a tejidos de injerto utilizando nuestro modelo interno diseñado en vitro de la perfusión.

Para comprender mejor los mecanismos detrás de IE desarrollo, este modelo permite la evaluación de bacterias y factores asociado del tejido presentan en la situación en vivo del inicio de la infección.
En detalle, el enfoque novedoso en vitro permite para cuantificar la adherencia bacteriana en condiciones de flujo a los tejidos de injerto diferentes por perfundiendo fluorescencia etiquetada bacter...

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An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Describimos un interno diseñado en vitro cámara modelo de flujo, que permite la investigación de la adherencia bacteriana a los tejidos de injerto.

Un modelo In Vitro de un sistema de placas paralelas de la perfusión para el estudio de adherencia bacteriana a los tejidos de injerto

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la patogénesis de la endocarditis infecciosa y los patobiogramas a través de campos como la interacción entre bacterias, células sanguíneas y células endoteliales que recubren la musculatura. La principal ventaja de esta técnica es que los injertos de tejido podrían estar expuestos directamente a interacciones mutuas con varios objetivos, como bacterias, plaquetas y proteínas en condiciones de flujo estandarizadas. La implicación de esta técnica se extiende a nuestra terapia de endocarditis infecciosa, ya que puede desentrañar importantes interacciones moleculares y factores que impulsan la alta infecciosidad de ciertos tejidos.Este método proporciona información sobre la patogénesis de la formación de la vegetación. También puede ser aplicable en estudios que investigan la permeabilidad vascular, la movilidad celular y la expresión de células génicas. Para comenzar el protocolo, coloque una biopsia de tejido previamente preparada de 10 milímetros de diámetro, y el mismo grosor entre un portaobjetos del microscopio y una perforación circular de ocho milímetros, y una junta de goma con la superficie interior hacia arriba, para entrar en contacto con la suspensión bacteriana.Concéntrese en la orientación del injerto de tejido mientras se coloca en el soporte. Asegúrese de que la superficie interna del tejido ya esté expuesta a las caras del torrente sanguíneo hasta ponerse en contacto con el medio experimental. A continuación, inserte el soporte con el tejido en la hoja de la junta que está incrustada en el marco metálico inferior de la cámara.Fije el marco de metal superior con la hoja de junta correspondiente en la parte inferior de la cámara con el soporte de tejido insertado previamente. A continuación, monte toda la cámara con ocho tornillos y tuercas de tornillo. Asegúrese de que la altura de la cámara es siempre la misma en todos los injertos mediante el uso de una pinza o regla.A continuación, conecte la cámara de flujo con una bomba peristáltica. A continuación, conecte el depósito de líquido de 400 mililitros con los tubos. Perfunda los tejidos con suspensiones de 100 mililitros de diez a las siete unidades formadoras de colonias con etiqueta fluorescente en solución salina tamponada con fosfato con el estrés total de tres cenas por centímetro cuadrado y el caudal correspondiente de cuatro mililitros por minuto durante una hora utilizando la bomba peristáltica y el depósito bacteriano.Recircule continuamente la suspensión bacteriana de 100 mililitros utilizando el mismo depósito de recogida. Después de la perfusión, desmonte la cámara para liberar el injerto. Lave la pieza de tejido dos veces con cuatro mililitros de PBS en una placa de 12 pozos usando un agitador orbital durante tres minutos.Luego corte la parte interna del injerto usando un punzón de biopsia de piel con un diámetro más pequeño. Coloque cada biopsia de tejido en un tubo separado de 14 mililitros que contenga un mililitro de cloruro de sodio estéril al 0,9%. Separe las bacterias del tejido usando un baño de sonicación durante 10 minutos.Preparar un solo tubo de 14 mililitros con 10 mililitros de cloruro de sodio estéril al 0,9% para hacer diluciones en serie de la suspensión bacteriana obtenida después de la sonicación. Etiquete el tubo número dos. Preparar tres tubos de 14 mililitros con 10 mililitros de cloruro de sodio estéril al 0,9% para diluciones en serie de la suspensión bacteriana inicial llevada al experimento de profusión.Etiquete los tubos número tres, número cuatro y número cinco. A continuación, asegure tres placas de agar, una para la perfusión bacteriana, otra para la perfusión de control de PBS, y la tercera para la suspensión bacteriana inicial utilizada para las perfusiones. Etiquete tres sectores por placa para el experimento de tejido de la siguiente manera: 10-1, 10-3 y 10-4.Para contar el número de unidades formadoras de colonias en la perfusión bacteriana, etiquete la placa de la siguiente manera:10-1, 10-3, 10-5 y 10-7. Vórtice los tubos que contienen la biopsia de tejido durante 15 segundos cada uno, para hacer diluciones en serie. Para preparar las diluciones en serie, transfiera 100 microlitros del tubo número uno al tubo número dos, y vórtice el tubo para mezclar a fondo la solución.Extienda 100 microlitros del contenido del tubo número uno y el número dos en los sectores correspondientes, 10-1 y 10-3 de la placa de agar. A continuación, esparza 10 microlitros del tubo número dos en el sector 10 cuatro. Repita este paso cuatro veces para obtener cuatro crecimientos separados de cada volumen de 10 microlitros.Para preparar las diluciones en serie del cultivo inicial, primero vórtice la dilución durante 15 segundos y transfiera 100 microlitros de suspensión bacteriana al tubo número tres, y mezcle vigorosamente por vórtice. Agregue 100 microlitros del tubo número tres al tubo número cuatro y mezcle de nuevo. Repita el procedimiento para el tubo número cinco del tubo número cuatro.Extienda 100 microlitros del contenido de los tubos número tres, el número cuatro, el número cinco, y el cultivo inicial etiquetado respectivamente en los sectores 10-3, 10-5, 10-7 y 10-1 de la placa de agar de sangre. Deje que las placas de agar de sangre debajo de la capucha laminar sequen al aire las propagaciones bacterianas, por lo general durante 10 minutos. Después, coloque las placas a 37 grados centígrados para la incubación durante la noche.Después de la incubación durante la noche, cuente las colonias bacterianas para obtener el número de UFC. En condiciones de estrés total, se observó un apego bacteriano similar a través de los diversos tejidos del injerto para la infección por estafilococo aureus y estafiloco epidermidis. Siguiendo los procedimientos, el estreptococo sanguinis mostró una reducción significativa de la adherencia a la pared de la vena yugular bovina, en comparación con el parche de pericardio bovino.Al comparar las tres especies de bacterias, streptococcus sanguinis presenta una adhesión significativamente menor a la pared de la vena yugular bovina en relación con staphylococcus aureus y staphylococcus epidermidis. Al intentar este procedimiento, es importante recordar haber preparado los tejidos correctos de la misma cabeza. Garantizará condiciones similares en todas las muestras de experimentos y minimizará la variabilidad de los datos entre diferentes series de experimentos.Después de su desarrollo, esta técnica permite a los investigadores explorar los complejos sistemas de trastornos de una manera paso a paso mediante el enriquecimiento de sus enfoques modelo in vitro con diferentes elementos para construir una complejidad completa cerca del estado médico.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

Una novela<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banda Técnica para alterar intracardiaca Hemodinámica en un sistema embrionario de pollo

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Investigación

Biología del Desarrollo

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