Name: gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

这项工作得到了卫生研究院 MOP 142307 的支持 P.A.M. h.s.j. m 是加拿大卫生研究院再生医学研究培训项目的接受者。h.s.j. m、A.N.S.、K.H.K. 和方程都是伊丽莎白二世的科技研究生奖学金获得者。

1. 外源参考 RNA 的制备
注: 选择不存在于感兴趣的物种或模型中的外源参考 RNA。对于哺乳动物系统, 可以使用萤火虫荧光素酶 RNA。
<ol><li>
外源参考 RNA 质粒的线性化
	<ol>
<li>在预期 rna 提取前至少48小时准备外源参考 rna。获取或制造所选择的外源参考 RNA 的 cdna 克隆, 如萤火虫荧光素酶 cdna 克隆, 适合于体外转录的质粒载体 (见材料表)。</li>
		<li...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype.">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li><li>Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+disturbed+blood+flow+on+endothelial+cell+gene+expression:+a+role+for+changes+in+RNA+processing.">Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+patterning+by+STEEL,+an+endothelial-enriched+long+noncoding+RNA.">Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).</li><li>Won, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow.">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li><li>Baeyens, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+is+governed+by+a+VEGFR3-dependent+fluid+shear+stress+set+point.">Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point.</a> eLIFE. 4, 04645 (2015).</li><li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atherosusceptible+endothelium:+endothelial+phenotypes+in+complex+haemodynamic+shear+stress+regions+in+vivo.">The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo.</a> Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).</li><li>Gray, K. M., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+cell+mechanosensing:+New+insights+gained+from+biomimetic+microfluidic+models.">Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).</li><li>Resnick, N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+are+complex+regulators+of+endothelial+gene+expression.">Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression.</a> The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+shear+stress+on+iPSC-derived+human+brain+microvascular+endothelial+cells+(dhBMECs).">Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs).</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).</li><li>Thormar, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+efficiency+of+double-stranded+DNA+formation+in+cDNA+synthesis+for+the+imprecision+of+microarray+expression+analysis.">Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis.</a> Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).</li><li>Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+gene+normalization+for+real-time+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+analysis+under+dynamic+endogenous+transcription.">Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription.</a> Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).</li><li>Vaughan-Shaw, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+overcome+the+inhibitory+effect+of+heparin+on+DNA+amplification.">A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification.</a> Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+and+extracellular+matrix+cues+regulate+the+mechanical+phenotype+and+stiffness+of+aortic+endothelial+cells.">Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3984 (2014).</li><li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).</li><li>Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR.">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li><li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior.">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li></ol>

剪切应力是调节内皮功能的生理条件, 部分通过影响稳态基因表达2,5。各种剪切应力条件下的基因调控模型将有助于更深入地了解内皮功能。这一实用的工作流程包括一个使用平行板流腔的流动电路, 它适合车道等。9表示层流, 非脉动流。总体设置旨在促进需要多个流室的实验, 并将此设置中的实验变异性降至最低。
<p class="jo...

血管内皮细胞形成的血管内细胞衬里在封闭心血管系统的较高物种。它们形成血液和组织之间的接口, 并具有管腔和 abluminal 表面的特征。内皮是一个多样化的, 活跃的和适应的系统, 调节血液流动, 养分的贩运, 免疫力和新血管的生长1。在体内, 内皮细胞通常存在于暴露于循环摩擦力的环境中, 剪切应力2。剪切应力是内皮细胞基因表达3的重要调节因子, 内皮细胞试图在给定范围内保持剪切应力2,4。内皮细胞在缺乏剪切应力5的情况下显示血管生成模式, 可改善组织灌注。扰动流和改变的剪切应力的区域模式与炎症基因6的表达和动脉粥样硬化7,8的发展有关。因此, 包括剪切应力的模型是了解内皮基因调控的主要组成部分。
本文介绍了一种在剪切应力作用下研究血管内皮细胞基因调控的方法。该系统使用非脉动流和模拟流体剪切应力水平和氧浓度, 模型条件的动脉内皮细胞。本协议包括使用 RNA 干扰 (RNAi) 进行基因敲除的方法的详细信息、使用平行板流仪进行剪切应力的设置以及在分析前对外源参考 RNA 进行尖峰的方法。逆转录定量聚合酶链反应 (rt-pcr)。该管道用于研究内皮细胞在层流剪切应力存在和无时的基因调控, 包括由车道等描述的平行板流动装置的适应。9. 这种特殊的设置旨在促进同时评估多种实验条件, 从而直接比较剪切应力条件, 以及 RNA 分析的规范化。采用控制湿度的大型加热装置, 可使多个独立的流室和泵同时运行, 并实时监控每个流室总成的流速。这种设置用于在层流/剪切应力的设置中使用 RNAi 进行基因敲除, 但该协议的各个方面可用于 RNA 表达的任何评估。
在内皮细胞中应用剪切应力的常用方法包括微流控系统10、锥板粘度计11和平行板流室12。来自不同制造商的微流控系统在研究多种细胞和组织类型的力学生物学和路狸以及各种生物物理刺激方面都非常有用。对于内皮细胞, 它们被用来研究内皮细胞的隔离, 以及内皮细胞的相互作用和免疫或肿瘤细胞的贩运10。然而, 这些系统不太适合回收大量的细胞9。圆锥和平板粘度计和平行板流室允许在汇合单分子12中回收大量细胞。这些系统可以产生一系列的剪切力和模式12。平行板流腔总成9具有可通过玻璃窗口进行实时成像, 在任何时间点评估细胞形态学的优点。此外, 灌流液可在无菌条件下收集。对于此处介绍的系统, 还可以实时监控流量, 并在多室设置中进行监测, 这有利于维护腔室之间的剪切条件。
对于有代表性的实验, 使用了代表大血管内皮细胞类型的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC), 而我们使用的剪切应力条件 (1 pa) 反映动脉条件 (0.1-0.7 pa)。然而, 该协议可与其他内皮细胞类型一起使用, 并可根据实验问题调整剪切应力条件。例如, 对人体内皮细胞进行模型静脉循环的评估需要较低的剪切应力水平 (1-6 pa), 并研究模型微血管循环利用了 0.4-1.2 Pa13的剪切应力水平,14. 此外, 在同一血管6内的内皮细胞之间, 剪切应力也可能发生变化。在当前设置中, 使用单个监控系统, 可同时监控四个独立的流量环路。对于需要更多流量环路的实验室, 在专用环境中有空间用于额外的监控系统。
在剪切应力的设定中, 采用 rt-pcr 法进行基因表达的绝对定量。目标基因的相对表达通常用于比较不同条件下的 RNA 表达。某些 RNA 种类可以存在于非常低的数量或缺乏, 从而复杂化相对测量。例如, 内皮细胞中的长非编码 rna 可以在相对较低的每个细胞5的拷贝数上发挥有效的作用。此外, 在引物效率上的差异可能导致不准确的解释利用三角洲-三角洲周期阈值 (Ct) 方法来分析数据。为了解决这一问题, 我们通过使用已知数量的质粒 DNA 生成标准曲线来进行绝对定量。此外, 互补 DNA (cDNA) 合成是一个低效的过程, 而 cDNA 效率的差异可以解释不同条件之间的 RNA 表达和样本15之间的差异。剪切应力和/或转染试剂的应用会影响细胞增殖、凋亡和活性, 或者添加可能干扰 RNA 分离和/或 cDNA 合成的成分。为了考虑 rna 分离和 cDNA 合成的偏倚的可能性, 我们使用实验室合成的尖峰 rna 控制, 在 rna 提取时添加, 并通过rt-pcr 对每个 cDNA 合成进行测量。这不仅可以调整 RNA 提取和 cDNA 合成的技术差异, 还可以在已知细胞计数时计算每个细胞的绝对数量。
此系统使用其他步骤来保持相似性或说明条件之间的技术差异。我们特别强调这些步骤, 因为这些实验的复杂性质, 涉及多个物理设置和实验条件, 可以导致实验的变异性。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm2 Culture Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Way Stopcocks</td>
			<td>Discofix</td>
			<td>D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEACH</td>
			<td>Darwin Chambers Company</td>
			<td>MN: HO85, SN: 4947549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Meter</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: P120, SN: 0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: C700, SN: 52852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) -/-</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (pure)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.20 um)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Dampener and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Console</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>T402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Tubing</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Reservoir and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensor</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>ME4PXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 737F Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FI-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J cloth</td>
			<td>J cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sterilization pouch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>92713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump (Masterflex L/S Economy Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7554-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head (Masterflex L/S Easy Load)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4 Well Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-08</td>
			<td>For #25 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-08</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockdown reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12252-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSP-luc+</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercoiled DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>N0472S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers

我们描述了一个工作流程, 用于分析受稳定层流流的内皮细胞的基因表达, 使用多个监控的平行板流室。内皮细胞形成血管内细胞衬里, 长期暴露于血流的摩擦力, 称为剪切应力。在生理条件下, 内皮细胞在不同的剪切应力条件下发挥作用。因此, 在体外模型中应用剪切应力条件可以更深入地了解体内的内皮反应。平行板流室以前由车道等出版。9是适应研究内皮基因调控在存在和缺乏稳定 (非脉动) 层流。此处介绍的层流流设置的关键调整包括一个大的、专用的环境来容纳并发流电路、实时监控流速和包含外源参考 RNA 以实现标准化定量的实时 PCR 数据。为了评估多重处理/条件与应用的剪切应力, 多流电路和泵在同一加热和加湿孵化器中同时使用。在整个实验过程中, 实时测量每个流量回路的流速, 以实现剪切应力条件的标准化。由于这些实验有多个条件, 我们还使用在 rna 提取时被刺入的外源参考 rna, 用于 rna 提取和第一链 cDNA 合成效率的正常化。这些步骤可将样本之间的变异性降至最低。该策略在我们的管道中使用平行板流室进行了剪切应力实验的基因表达分析, 但该策略的一些部分, 如外源参考 RNA 尖峰, 可以很容易且经济有效地用于其他应用程序。

通过在琼脂糖凝胶上运行消化产物, 证实了荧光素酶质粒的成功线性化 (图 1)。使用 DNA 梯子和未切割质粒进行比较, 确定线性化产品的尺寸。
我们已经适应了平行板流室设置从车道等。9用于需要多个条件/处理剪切应力或多重剪应力条件的实验。我们使用一个专用的环境, 海滩, 可...

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Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

多平行板流室对剪切应力暴露的内皮细胞基因表达分析

本文介绍了流体剪切应力作用下内皮细胞培养和基因表达分析的工作流程。包括一个物理安排, 可同时在受控环境中同时外壳和监测多个流室, 并使用外源参考 RNA 进行定量 PCR。

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

这种方法可以帮助回答内皮生物学领域的关键问题，例如为什么血管在动脉硬化的发展中存在区域差异？该技术的主要优点是允许在剪切应力或多个剪切应力条件下同时研究多个条件。这种技术的含义延伸到了解动脉和静脉系统中的内皮基因调控，因为可以使用各种流速和模式。在这里，我们演示了一个使用稳定层流的系统。该设置可适应其他流动模式，包括扰动流。一般来说，在实验期间，新采用这种方法的个体将难以维持连续的单层细胞，并在实验之间获得一致的结果。在分析前24小时，在早期通道中计算人体内皮细胞，将大约10倍至第六细胞在一毫升的介质中播种到四井细胞培养板每个井的一个纤维素涂层玻璃滑梯上。让细胞在37摄氏度下粘附在幻灯片上15分钟。然后用三毫升的介质覆盖每张幻灯片，将板放在37摄氏度和5%CO2的细胞培养箱中24小时。在实验当天，在大型加热内置环境中的水箱中加满可调 CO2 和热，或海滩孵化器，并配有多个搁板、内部电源和玻璃门，并确认实验有足够的二氧化碳，并且 CO2 监控器是否正常工作。要设置流室，请将 1/8 英寸的母引诱插入 16 号软管的一端，并将四向插子连接到诱饵上。将管的自由端连接到顶板的流入侧，并将 1/8 英寸的公饵插入第二个数字 16 软管的一端。将四向止损器连接到男性诱惑，将管的自由端连接到顶部板的流出侧。插入1/8英寸男性诱惑和1/8英寸女性诱惑到第三个数字16软管的每一端，并附加管到泡沫陷阱通过1/8英寸男性诱惑。然后通过女性诱惑将四向止损到管子的另一端。使用无菌钳子，将一个细胞种子玻璃幻灯片转移到底板上的凹槽，细胞种子侧向上。使用 10 毫升注射器在板周围的红色垫片线内向底板添加 10 毫升热介质。允许介质流过幻灯片并覆盖细胞。轻轻地将顶板放在底板上，小心地对齐两侧，将板拧紧。要清除气泡陷阱中的气泡，请首先打开流入和气泡止风阀止损器并关闭流出止波器。然后使用 30 毫升注射器通过板轻轻冲洗 20 毫升的暖介质。要清除腔室中的气泡，请关闭气泡陷阱止片并打开流出止波。将腔室的流出侧提升至 45 度角，并使用 30 毫升注射器从腔室的流入侧轻轻冲洗 20 毫升加热介质。重要的是在流动方向以适当的速率冲洗，并使用显微镜确认细胞的汇合单层仍然存在，然后再将细胞暴露在层流中。然后关闭腔室两侧的止损器，并确认细胞仍附着在光学显微镜下。将流量室和以前组装的流量回路系统放入海滩，然后缓慢降低流量回路总成的泵速，然后完全暂停泵。关闭流环系统上的止口器，防止泄漏，通过止速器将腔室和回路系统连接在一起。连接所有回路后，重新打开所有止速器并缓慢提高泵速，同时监控设置是否有任何泄漏或堵塞。将流量传感器放在腔室流入侧的腔架上，传感器朝向流动方向，并调整泵速，以获得剪切应力速率。然后打开 CO2 油箱，达到 5%C02 浓度。实验流量期完成后，缓慢地将近位泵速度降至零并关闭电源。快速关闭所有打开的止损器，将室和附加的管子，每侧都有一个止损管，并连接到干净的工作台顶。小心拧开所有螺钉以拆下顶板，并使用针鼻钳将玻璃滑轨从底板转移到直径为 100 毫米的盘。在 10 毫升冷 PBS 中清洗幻灯片，并在显微镜下检查细胞，以确认细胞在流动方向的粘附和对齐。吸气 PBS 后，将幻灯片转移到直径为 100 毫米的清洁盘中，并添加 350 微升的解液缓冲液，并辅以 1/100 的 1-100 分之一的 100 Beta-Mercaptoethanol 从 RNA 提取套件到幻灯片。使用聚乙烯刀片式细胞刮刀将电池从幻灯片上刮下来，然后倾斜组织培养盘，使缓冲液在底部池。使用钳子取出滑梯，将细胞切成1.5毫升的冰管。然后将10微升稀释的荧光素酶RNA加入细胞中，根据标准方案进行下游RNA分离和分析。使用限制性酶成功线性化的荧光酶质粒可以通过在 agarose 凝胶上运行消化的产品来确认，线性化产品的大小可以通过 DNA 梯和未切割质粒进行比较来确认。制造过程可导致腔室高度变化小，因此必须计算每个腔室的流速，以实现相同的剪切应力。对于在哺乳动物内皮细胞中结合层压的实验中，萤火虫荧光素酶RNA可用作外源RNA尖峰。内源参考基因、外源参考基因和内源性参考基因的正常化共同产生相似的结果。值得注意的是，在这些具有代表性的实验中，每次实验使用两个同时运行流室，剪切应力为一个 Pascal，Kruppel 就像通过 SI-RNA 敲击因子二一样，在测试的生物样本之间产生了类似的敲击效率。在尝试此过程时，必须记住在幻灯片上建立一个均匀的单层细胞，并在连接流室之前大量使用流环系统。按照这个程序，其他方法，如RNA测序，可用于评估全基因组RNA表达和其他读数，如DNA和蛋白质，可用于进一步的分子分析。该技术开发后，为内皮生物学领域的研究人员探索剪切应力与人类内皮细胞血管生成潜力之间的关系铺平了道路。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

平行板流动腔和评估内皮祖细胞层流剪应力下连续流电路

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

科研

生物工程

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

高分子基因传递纳米粒子的纳米粒子跟踪分析和高通量流式细胞仪评价

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

在肌肉再生的老鼠模型中移植诱导多能干细胞衍生的中生代细胞样肌原体

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

的剪切粘合地图使用SynVivo合成微血管网络代

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

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微流体流钱伯斯再造使用血止血建模和血小板输注<em&gt;体外</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

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Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

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A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

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