Name: gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af CIHR MOP 142307 til P.A.M. H.S.J.M. er en modtager af en canadisk institutter af sundhed forskning træningsprogram i regenerativ medicin Fellowship. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. og M.K.D. er modtagere af dronning Elizabeth II ph.d. stipendier inden for videnskab og teknologi.

1. forberedelse af eksogene Reference RNA
Bemærk: Vælg en eksogen reference RNA, der ikke findes i den art eller model af interesse. For pattedyr systemer, kan firefly luciferase RNA anvendes.
<ol><li>
Linearisering af eksogene reference RNA plasmid
	<ol>
<li>Forberede eksogene reference RNA mindst 48 timer før den forventede RNA udvinding. Opnå eller fremstille en cDNA klon af den valgte eksogene reference RNA, såsom en firefly luciferase cDNA klon i et plasmid vektor ...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype.">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li><li>Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+disturbed+blood+flow+on+endothelial+cell+gene+expression:+a+role+for+changes+in+RNA+processing.">Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+patterning+by+STEEL,+an+endothelial-enriched+long+noncoding+RNA.">Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).</li><li>Won, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow.">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li><li>Baeyens, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+is+governed+by+a+VEGFR3-dependent+fluid+shear+stress+set+point.">Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point.</a> eLIFE. 4, 04645 (2015).</li><li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atherosusceptible+endothelium:+endothelial+phenotypes+in+complex+haemodynamic+shear+stress+regions+in+vivo.">The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo.</a> Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).</li><li>Gray, K. M., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+cell+mechanosensing:+New+insights+gained+from+biomimetic+microfluidic+models.">Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).</li><li>Resnick, N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+are+complex+regulators+of+endothelial+gene+expression.">Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression.</a> The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+shear+stress+on+iPSC-derived+human+brain+microvascular+endothelial+cells+(dhBMECs).">Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs).</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).</li><li>Thormar, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+efficiency+of+double-stranded+DNA+formation+in+cDNA+synthesis+for+the+imprecision+of+microarray+expression+analysis.">Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis.</a> Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).</li><li>Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+gene+normalization+for+real-time+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+analysis+under+dynamic+endogenous+transcription.">Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription.</a> Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).</li><li>Vaughan-Shaw, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+overcome+the+inhibitory+effect+of+heparin+on+DNA+amplification.">A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification.</a> Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+and+extracellular+matrix+cues+regulate+the+mechanical+phenotype+and+stiffness+of+aortic+endothelial+cells.">Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3984 (2014).</li><li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).</li><li>Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR.">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li><li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior.">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li></ol>

Shear stress er en fysiologisk tilstand, der modulerer endotelfunktion, dels ved at påvirke steady-state gen expression2,5. Modeller af RIBOREGULATION i forskellige shear stress betingelser vil bidrage til en større forståelse af endotelfunktion. Denne pragmatiske arbejdsproces indeholder et flow kredsløb ved hjælp af en parallel-plade flow kammer tilpasset fra Lane et al. 9 og repræsenterer laminar, ikke-pulsatile flow. Den...

Vaskulære endotel celler danner den indvendige cellulære foring af blodkar i det lukkede kardiovaskulære system af større arter. De udgør grænsefladen mellem blod og væv og er karakteriseret ved luminale og abluminal overflader. Endotelet er et mangfoldigt, aktive og adaptive system, der regulerer blodgennemstrømning, næringsstof handel, immunitet, og væksten af nyt blod fartøjer1. I kroppen findes endotelceller normalt i et miljø, hvor de er udsat for omsætning, shear stress2friktion kraft. Shear stress er en vigtig regulator i endothelial celle gen expression3, og endotelceller forsøger at opretholde shear stress inden for et givet område2,4. Endotelceller demonstrere angiogene mønster i mangel af shear stress5 , der kan forbedre væv perfusion. Regionale mønstre forstyrret strømmen og ændrede shear stress er tilknyttet udtryk for inflammatoriske gener6 og udviklingen af åreforkalkning7,8. Således er modeller, der omfatter shear stress en vigtig del i forståelsen af endotel genregulering.
Vi beskriver en metode til at studere genregulering i vaskulære endotel celler under shear stress. Dette system bruger ikke-pulsatile flow og efterligner væske shear stress niveauer og koncentration af ilt at model betingelser for arteriel endotelceller. Denne protokol indeholder oplysninger om metoder til gen knockdown ved hjælp af RNA-interferens (RNAi), set-up for anvendelsen af shear stress ved hjælp af parallel-plade flow apparater og metoder til spike-in af en udefrakommende reference RNA inden analyse af reverse transkriptase kvantitative polymerase kædereaktion (RT-qPCR). Denne rørledning er brugt til at studere RIBOREGULATION i endothelial celler i tilstedeværelse og fravær af laminar shear stress og omfatter en tilpasning af parallel-plade flow apparatet beskrevet af Lane et al. 9. denne særlige set-up var designet til at lette den samtidige vurdering af flere forsøgsbetingelser, der giver mulighed for direkte sammenligning af shear stress tilstande, samt normalisering af RNA analyse. En stor opvarmet enhed med kontrolleret fugtighed er udnyttet til at tillade flere separate flow kamre og pumper skal køre samtidig med strømningshastigheder overvåges for hver flow kammer forsamling i realtid. Anvendelsen af dette set-up bruges til gen knockdown ved hjælp af RNAi i fastsættelsen af laminar flow/shear stress, men aspekter af denne protokol kan anvendes på enhver vurdering af RNA udtryk.
Fælles tilgange til anvendelsen af shear stress i endothelial celler omfatter mikrofluid systemer10, en kegle og plade viskosimeter11og en parallel-plade flow afdeling12. Mikrofluid systemer fra forskellige producenter har været nyttige i at studere mechanobiology og mechanotransduction i flere celler og vævstyper og en bred vifte af biofysiske stimuli. I endothelial celler, har de været brugt til at studere endotelceller i isolation, samt interaktion i endothelial celler og handel med immun eller tumor celler10. Men disse systemer er mindre egnet til genopretning af et stort antal celler9. Både kegle og plade viskosimeter og parallel-plade flow kamre tillader inddrivelse af stort antal celler i Konfluerende monolag12. Disse systemer kan generere en række shear styrker og mønstre12. Parallel-plade flow kammer forsamling9 har fordelen at real-time imaging kan udføres gennem glasrude at evaluere cellulære morfologi på ethvert tidspunkt. Derudover kan perfusate indsamles under sterile forhold. For det system, der præsenteres her, kan strømmen også overvåges i realtid og i en multi kammer set-up, som letter vedligeholdelsen af shear forhold mellem afdelingerne.
Repræsentative eksperimenter, menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVEC), som repræsenterer en makrovaskulære endotel celletype, der anvendes, og shear stress betingelser vi bruger (1 Pa) afspejler arteriel betingelser (0,1 - 0,7 Pa). Men denne protokol kan bruges med andre endotel celletyper, og shear stress betingelser kan reguleres efter de eksperimentelle spørgsmål. For eksempel, vurderingen af menneskelige endotelceller i betingelser, som model venøs cirkulation ville kræve lavere niveauer af shear stress (1-6 Pa) og undersøgelser, at model mikrovaskulære omsætning har udnyttet shear stress niveauer af 0,4 - 1,2 Pa13 , 14. Derudover shear stress kan variere selv mellem endotelceller inden for den samme blodkar6. I den nuværende struktur, en enkelt overvågningssystem anvendes der kan samtidig overvåge fire separate flow sløjfer. For laboratorier, der har brug for mere flow sløjfer, er der plads i den dedikerede miljø for en yderligere overvågningssystem.
RT-qPCR bruges til den absolutte kvantitering af genekspression i indstillingen af shear stress. Den relative udtryk for target gener er ofte bruges til at sammenligne RNA udtryk på tværs af betingelser. Nogle RNA arter kan findes i meget små mængder eller være fraværende og således komplicere relative målinger. For eksempel, kan længe noncoding RNA'er i endothelial celler udøve potent virkninger på relativt lav copy numre pr. celle5. Desuden kan forskelle i primer effektivitet føre til en unøjagtig fortolkning fra udnytte delta-delta cycle tærskel (Ct) metode til at analysere dataene. For at imødegå denne bekymring, udføre vi absolutte kvantitering ved at generere en standardkurve ved hjælp af en kendt mængde af plasmid DNA. Desuden supplerer DNA (cDNA) syntese er en ineffektiv proces, og forskelle i cDNA effektivitet kan redegøre for forskelle i RNA udtryk mellem betingelser og prøver15. Anvendelsen af shear stress og/eller Transfektion reagenser kan påvirke celleproliferation, apoptose og levedygtighed eller tilføje komponenter, der kan forstyrre RNA isolering og/eller cDNA syntese. For at tage hensyn til muligheden for bias fra RNA isolering og cDNA syntese, bruger vi en spike-RNA objektet syntetiseret i laboratoriet, tilføjet på tidspunktet for RNA udvinding og målt med hver cDNA syntese via RT-qPCR. Dette giver ikke kun en justering for tekniske forskelle i RNA udvinding og cDNA syntese, men også tillader beregning af absolutte mængder pr. celle, når celletal er kendt.
Dette system bruger yderligere skridt til at opretholde lighed eller redegøre for tekniske forskelle mellem betingelser. Vi understrege især disse trin på grund af den komplekse karakter af disse eksperimenter, der involverer flere fysiske set-ups og forsøgsbetingelser, som kan føre til eksperimentel variation.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm2 Culture Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Way Stopcocks</td>
			<td>Discofix</td>
			<td>D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEACH</td>
			<td>Darwin Chambers Company</td>
			<td>MN: HO85, SN: 4947549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Meter</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: P120, SN: 0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: C700, SN: 52852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) -/-</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (pure)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.20 um)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Dampener and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Console</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>T402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Tubing</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Reservoir and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensor</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>ME4PXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 737F Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FI-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J cloth</td>
			<td>J cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sterilization pouch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>92713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump (Masterflex L/S Economy Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7554-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head (Masterflex L/S Easy Load)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4 Well Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-08</td>
			<td>For #25 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-08</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockdown reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12252-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSP-luc+</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercoiled DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>N0472S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers

Vi beskriver en arbejdsgang til analyse af genekspression fra endotelceller underlagt en stabil laminar flow ved hjælp af flere overvågede parallel-plade flow kamre. Endotelceller danne indre cellulære foring af blodkar og kronisk er udsat for den friktion kraft af blodgennemstrømningen kaldet shear stress. Under fysiologiske tilstande, endotelceller funktion i forskellige shear stress betingelser. Anvendelse af shear stress betingelser i in vitro- modeller giver således, kan større indsigt i endothelial svar in vivo. Parallel-plade flow salen tidligere udgivet af Lane et al. 9 er tilpasset til at studere endotel RIBOREGULATION i tilstedeværelse og fravær af stabil (ikke-pulsatile) laminar flow. Centrale tilpasninger i set-up for laminar flow som præsenteres her omfatter en stor, dedikeret miljø til hus samtidige flow kredsløb, overvågning af strømningshastigheder i realtid, og medtagelsen af en udefrakommende henvisning RNA for en normalisering af kvantitative real-time PCR data. For at vurdere flere behandlinger/betingelser med anvendelse af shear stress, bruges flere flow kredsløb og pumper samtidig inden for den samme opvarmet og befugtet inkubator. Strømningshastigheden af hver flow kredsløb måles kontinuerligt i realtid at standardisere shear stress betingelser i hele eksperimenterne. Fordi disse eksperimenter har flere betingelser, bruge vi også en eksogen reference RNA, der er tilsat i på tidspunktet for RNA udvinding til normalisering af RNA udvinding og første-streng cDNA syntese effektivitetsgevinster. Disse trin minimerer variabiliteten mellem prøver. Denne strategi er beskæftiget i vores pipeline for gen expression analyse med shear stress eksperimenter ved hjælp af parallel-plade flow kammer, men dele af denne strategi, som de eksogene reference RNA spike-in, kan nemt og omkostningseffektivt bruges til andre programmer.

Vellykket linearisering af luciferase plasmid ved hjælp af restriktionsenzymer blev bekræftet af kører fordøjet produkter på en agarosegel (figur 1). Størrelsen af den lineariseret produkt blev bekræftet ved hjælp af DNA stiger og forhold til uncut plasmid.
Vi har tilpasset parallel-plade flow kammer set-up fra Lane et al. 9 for eksperimenter, der kræver fle...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Gen Expression analyse i Endothelial celler udsat for Shear Stress ved hjælp af flere Parallel-plade Flow kamre

Her præsenteres en arbejdsproces for kultur og gen expression analysen i endothelial celler under væske shear stress. Inkluderet er en fysisk arrangement for samtidig boliger og overvågning flere flow kamre i et kontrolleret miljø og brugen af en udefrakommende reference RNA til kvantitativ PCR.

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for endotelbiologi, såsom hvorfor blodkar har regionale forskelle i udviklingen af åreforkalkning? Den største fordel ved denne teknik er det giver mulighed for samtidig undersøgelse af flere betingelser under forskydning stress eller flere forskydning stress betingelser. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod forståelse endotel gen regulering i både arteriel og venøse systemer, fordi forskellige strømningshastigheder og mønstre kan anvendes.Nå her, vi viser et system, der bruger stabil laminar flow. Opsætningen kan tilpasses til andre flowmønstre, herunder forstyrret flow. Generelt vil personer, der er nye på denne metode, have svært ved at opretholde et kontinuerligt monolag af celler under hele forsøgets varighed og opnå ensartede resultater mellem eksperimenterne.24 timer før analysen tælles de humane endotelceller ved en tidlig passage og frø ca. en gang 10 til de sjette celler i en milliliter medium på en fibronectinbelagt glasdias pr. brønd af en fire-brøndcellekulturplade. Lad cellerne holde sig til diaset i 15 minutter ved 37 grader Celsius. Derefter dække hvert dias med tre milliliter medium og placere pladen i cellekultur inkubator på 37 grader Celsius og 5% CO2 i 24 timer.På eksperimentets dag fyldes vandbakken i et stort, opvarmet, indbygget miljø med justerbar CO2 og varme eller strandkubvøse med flere hylder, intern eladgang og glasdøre, og bekræfter, at der er tilstrækkelig kuldioxid til rådighed til eksperimentet, og at CO2-monitoren er funktionel. For at oprette flow kammer, indsætte en 1 / 8 tommer kvindelig lokke i den ene ende af en række 16 bløde rør, og vedhæfte en fire-vejs stophane til lokke. Fastgør den frie ende af røret til indstrømningssiden af toppladen og indsæt en 1/8th inch mandlig lokke i den ene ende af et andet nummer 16 blødt rør.Fastgør en fire-vejs stophane til den mandlige lokke, og fastgør den frie ende af røret til udstrømning side af toppladen. Indsæt en 1/8th tommer mandlige lokke og en 1/8th tommer kvindelige lokke i hver ende af et tredje nummer 16 bløde rør, og fastgør slangen til en boble fælde via 1/8th tommer mandlige lokke. Derefter vedhæfte en fire-vejs stophane til den anden ende af slangen via den kvindelige lokke.Brug sterile pincet, overføre en celle seedet glas dias til fordybning på den nederste plade, celle seedet side op. Brug en 10 milliliter sprøjte til at tilføje 10 milliliter varmt medium til bundpladen i den røde pakning linje omkring pladen. Tillade medium at flyde gennem diaset og dække cellerne.Anlæste forsigtigt toppladen på bundpladen, idet du skal justere siderne og skrue pladerne tæt sammen. For at fjerne luftbobler fra boblefælden skal du først åbne ind- og boblefældestophanerne og lukke udstrømningsstophanen. Brug derefter en 30 milliliter sprøjte til forsigtigt at skylle 20 milliliter varmt medium gennem pladen.For at fjerne bobler fra kammeret skal du lukke boblefældens stophane og åbne udstrømningsstophanen. Løft udstrømningssiden af kammeret til en vinkel på 45 grader, og brug 30 millilitersprøjten til forsigtigt at skylle 20 milliliter varmt medium fra indstrømningssiden af kammeret. Det er vigtigt at skylle med en passende hastighed i retning af flowet og at bruge mikroskop for at bekræfte, at et sammenløb monolag af celler forbliver, før de udsættes cellerne for laminar flow.Luk derefter stophanerne på begge sider af kammeret og hætten og bekræft, at cellerne stadig er fastgjort til diaset under et lysmikroskop. Placer flowkammeret og et tidligere samlet flowsløjfesystem ind på stranden, og formindsk langsomt pumpehastigheden for flowsløjfen, før pumpen sættes helt på pause. Luk stophanerne på flowsløjfesystemet for at forhindre lækage og forbinde kammeret og sløjfesystemet sammen via stophaner.Når alle løkkerne er tilsluttet, skal du genåbne alle stophanerne og langsomt øge pumpehastigheden, mens opsætningen overvåges for enhver lækage eller blokering. Anlækningssensoren skal placeres på kammerbroslangen på indstrømningssiden af kammeret med sensoren orienteret i strømningsretningen, og pumpens hastighed justeres for at opnå strømningshastigheden for forskydningsstressraten for rente. Tænd derefter for CO2-tanken for at opnå en 5%C02 koncentration.Når den eksperimentelle flowperiode er færdig, langsomt mindske peristaltiske pumpe hastighed til nul og slukke for strømmen. Hurtigt lukke alle de åbne stophaner og overføre kammeret og de vedhæftede slanger med en stophane på hver side til en ren bænk top. Skru forsigtigt alle skruerne for at fjerne toppladen og brug nålens næsetweezers til at overføre glasrutsjebanen fra bundpladen til en 100 millimeter diameterskål.Vask rutsjebanen i 10 milliliter kold PBS og kontroller cellerne under et mikroskop for at bekræfte celletilhold og justering i strømretningen. Efter indsugning af PBS, overføre diaset til en ren 100 millimeter diameter fad og tilsæt 350 mikroliter lysis buffer suppleret med 1/100th af Beta-Mercaptoethanol fra en RNA ekstraktion kit til diaset. Brug en polyethylenbladet celleskraber til at skrabe cellerne af diaset og vippe vævskulturskålen, så bufferen kan samle i bunden.Brug vicess til at fjerne rutsjebanen og pipette cellen lysere i et 1,5 milliliterrør på is. Derefter tilsættes 10 mikroliter fortyndet luciferase RNA til cellens lysat til downstream RNA-isolation og -analyse i henhold til standardprotokoller. En vellykket linearisering af luciferase plasmid ved hjælp af restriktionsenzymer kan bekræftes ved at køre de fordøjede produkter på en agarosegel, og størrelsen af det lineariserede produkt kan bekræftes med DNA-stiger og i sammenligning med en usleben plasmid.Fremstillingsprocesser kan føre til små variationer i kammerhøjden, og strømningshastigheden skal derfor beregnes for hvert kammer for at opnå den samme forskydningsstress. For eksperimenter, der indeholder laminar shear stress i pattedyr endotelceller, firefly luciferase RNA kan bruges som en eksogen RNA spike-in. Normalisering af det endogene referencegen, det eksogene referencegen og både endogene og udefrakommende referencegener giver tilsammen lignende resultater.Bemærk, at i disse repræsentative eksperimenter med to samtidig kørende flowkamre med forskydningsstress ved en Pascal for hvert eksperiment gav Kruppel lignende faktor to knockdown via SI-RNA en lignende knockdown-effektivitet mellem de testede biologiske prøver. Under forsøg på denne procedure er det vigtigt at huske at etablere en endnu monolayer af celler på diaset og at voldsomt flow loop system før fastgørelse af flow kammer. Efter denne procedure kan andre metoder, såsom RNA-sekventering, bruges til at vurdere genomdækkende RNA-ekspression og andre udlæsninger, såsom DNA og protein, til yderligere molekylær analyse.Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for endotelbiologi til at udforske forholdet mellem forskydningsstress og angiogenisk potentiale i humane endotelceller.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Parallel-plade Flow Afdeling og Continuous Flow Circuit at evaluere endoteliale stamceller under Laminar Flow forskydningsspænding

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering af Polymeric Gene Delivery nanopartikler ved Nanopartikel Tracking Analyse og Højkapacitetsforskning Flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation af induceret pluripotente stamcelle-afledt Mesoangioblast-lignende Myogenic Stamfadere i Mouse Modeller af muskel regenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generering af Shear Vedhæftning kort Brug SynVivo Syntetisk Mikrovaskulære Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikrofluid Flow Chambers Brug Rekonstitueret Blood til Model Hæmostase og trombocytinfusion<em&gt; In vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Design mikrofluidenheder for at studere cellulære reaktioner under ét eller samtidig eksisterende Chemical / El / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

En protokol til multipel gen-knockout i mus-små tarmorganoider ved anvendelse af en CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Lys-ark Fluorescens mikroskopi til fange 4-dimensionelle billeder af virkningerne af modulerende Shear Stress på udvikle zebrafisk hjertet

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live celle analyse af Shear Stress på Pseudomonas aeruginosa ved hjælp af en automatiseret højere overførselshastighed mikrofluid System

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Karakterisering single-molekyle konformationændringer under forskydning flow med fluorescens mikroskopi

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...