Name: gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door CIHR MOP 142307 P.A.M. H.S.J.M. is een ontvanger van een Canadese instituten van gezondheid onderzoek trainingsprogramma in regeneratieve geneeskunde Fellowship. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. en M.K.D. zijn de ontvangers van de Queen Elizabeth II afgestudeerde beurzen in de wetenschap en technologie.

1. bereiding van exogene referentie RNA
Opmerking: Kies een exogene verwijzing RNA dat niet bestaat in de soort of het model van belang. Voor zoogdieren systemen, kan firefly luciferase RNA worden gebruikt.
<ol><li>
Linearisatie van exogene referentie RNA plasmide
	<ol>
<li>Bereiden van exogene referentie RNA ten minste 48 uur vóór de verwachte RNA extractie. Verkrijgen of vervaardiging van een cDNA-kloon van de gekozen exogene verwijzing RNA, zoals een firefly luciferase ...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype.">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li><li>Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+disturbed+blood+flow+on+endothelial+cell+gene+expression:+a+role+for+changes+in+RNA+processing.">Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+patterning+by+STEEL,+an+endothelial-enriched+long+noncoding+RNA.">Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).</li><li>Won, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow.">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li><li>Baeyens, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+is+governed+by+a+VEGFR3-dependent+fluid+shear+stress+set+point.">Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point.</a> eLIFE. 4, 04645 (2015).</li><li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atherosusceptible+endothelium:+endothelial+phenotypes+in+complex+haemodynamic+shear+stress+regions+in+vivo.">The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo.</a> Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).</li><li>Gray, K. M., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+cell+mechanosensing:+New+insights+gained+from+biomimetic+microfluidic+models.">Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).</li><li>Resnick, N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+are+complex+regulators+of+endothelial+gene+expression.">Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression.</a> The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+shear+stress+on+iPSC-derived+human+brain+microvascular+endothelial+cells+(dhBMECs).">Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs).</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).</li><li>Thormar, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+efficiency+of+double-stranded+DNA+formation+in+cDNA+synthesis+for+the+imprecision+of+microarray+expression+analysis.">Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis.</a> Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).</li><li>Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+gene+normalization+for+real-time+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+analysis+under+dynamic+endogenous+transcription.">Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription.</a> Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).</li><li>Vaughan-Shaw, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+overcome+the+inhibitory+effect+of+heparin+on+DNA+amplification.">A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification.</a> Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+and+extracellular+matrix+cues+regulate+the+mechanical+phenotype+and+stiffness+of+aortic+endothelial+cells.">Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3984 (2014).</li><li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).</li><li>Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR.">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li><li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior.">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li></ol>

Shear stress is een fysiologische toestand die de functie van het endotheel, gedeeltelijk moduleert door het beïnvloeden van de stationaire toestand gen expressie2,5. Modellen van genregulatie in verschillende shear stress omstandigheden zal bijdragen tot een beter begrip van endothelial functie. Deze pragmatische workflow omvat een circuit van de stroom met behulp van een kamer van de stroom van parallel-plaat aangepast van Lane et al. <sup class="xref...

Vasculaire endotheliale cellen vormen de cellulaire binnenbekleding van bloedvaten in de gesloten cardiovasculaire systeem hogere soorten. Zij vormen de interface tussen het bloed en de weefsels en wordt gekenmerkt door luminal en abluminal oppervlakken. Het endotheel is een divers, actieve en adaptieve systeem dat regelt de bloedstroom, nutriënten mensenhandel, immuniteit en de groei van nieuw bloed schepen1. In het lichaam bestaan endotheliale cellen normaliter in een omgeving waar ze worden blootgesteld aan de wrijvingskracht van verkeer, shear stress2. Shear stress is een belangrijke regulator van endothelial cel gene expression3en endotheliale cellen poging om de schuifspanning binnen een bepaald bereik2,4. Endotheliale cellen tonen angiogenic patronen in de afwezigheid van shear stress5 die perfusie van het weefsel kunt verbeteren. Regionale patronen van verstoorde stroom en veranderde shear stress worden geassocieerd met de expressie van genen van inflammatoire6 en de ontwikkeling van atherosclerose7,8. Modellen met shear stress zijn dus een belangrijk onderdeel van het endotheel genregulatie begrip.
Beschrijven we een methode voor het bestuderen van de genregulatie in vasculaire endotheliale cellen onder de schuifspanning. Dit systeem maakt gebruik van niet-Pulsatiele stroom en bootst vloeistof shear stress niveaus en gehalte aan zuurstof dat model voorwaarden voor arteriële endotheliale cellen. Dit protocol bevat details van methoden voor de gene knockdown met behulp van RNA-interferentie (RNAi), de set-up voor de toepassing van shear stress met parallel-plaat stroom apparatuur en methoden voor de piek van een exogene reference RNA vóór de analyse door reverse-transcriptase kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR). Deze pijpleiding wordt gebruikt voor het bestuderen van genregulatie in endotheliale cellen in de aanwezigheid en de afwezigheid van laminaire schuifspanning en omvat een aanpassing van het apparaat van de stroom van parallel-plaat beschreven door Lane et al. 9. deze bijzondere set-up was bedoeld om de gelijktijdige evaluatie van meerdere experimentele omstandigheden waarmee directe vergelijking van shear stress voorwaarden, alsmede de normalisatie van RNA analyse. Een grote verwarmde eenheid met gecontroleerde luchtvochtigheid wordt gebruikt om meerdere afzonderlijke stroom chambers en pompen gelijktijdig worden uitgevoerd met een spuitsnelheid gecontroleerd voor elke vergadering van de kamer stroom in real time. De toepassing van deze set-up wordt gebruikt voor gene knockdown met behulp van RNAi in de omgeving van laminaire flow/schuifspanning, maar aspecten van dit protocol kunnen worden toegepast op elke beoordeling van RNA expressie.
Gemeenschappelijke aanpak van de toepassing van shear stress voor endotheliale cellen omvatten microfluidic systemen10, een kegel-en-plate viscosimeter11, en een parallel-plaat flow kamer12. Microfluidic systemen van verschillende fabrikanten zijn nuttig bij het bestuderen van mechanobiology en mechanotransduction in meerdere cel en weefseltypes (HLA) en een verscheidenheid van biofysische stimuli geweest. Voor endotheliale cellen, zijn zij gebruikt om te studeren endotheliale cellen in isolatie, evenals de interactie van endotheliale cellen en de handel in immuun of tumor cellen10. Deze systemen zijn echter minder geschikt voor het herstel van grote aantallen cellen9. Zowel de kegel-en-plate viscosimeter en parallel-plaat stroom chambers toestaan dat het herstel van grote aantallen cellen in confluente monolayers12. Deze systemen kunnen allerlei schuintrekken krachten en patronen12genereren. De parallel-plaat flow kamer vergadering9 heeft het voordeel dat real-time beeldvorming door het glazen raam te evalueren van de cellulaire morfologie op elk tijdstip kan worden uitgevoerd. Bovendien kan het perfusaat onder steriele omstandigheden worden verzameld. Voor het systeem hier gepresenteerd, kan de stroom ook worden gevolgd in real time en in een multi-kamer set-up, dat het onderhoud van shear voorwaarden tussen kamers vergemakkelijkt.
Voor representatieve experimenten, menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVEC), die een macrovascular endothelial celtype vertegenwoordigt, worden gebruikt, en de shear stress voorwaarden die we gebruiken (1 Pa) arteriële omstandigheden (0,1 - 0,7 Pa). Echter dit protocol kan worden gebruikt met andere endothelial celtypes, en de voorwaarden van de afschuifweerstand kunnen worden aangepast volgens de experimentele vraag. Bijvoorbeeld, de evaluatie van menselijke endotheliale cellen in omstandigheden die model veneuze circulatie zou vereisen lagere niveaus van shear stress (1-6 Pa) en studies die model microvasculaire verkeer hebben gebruikt shear stress niveaus van 0.4 - 1.2 Pa13 , 14. Bovendien schuifspanning zelfs tussen endotheliale cellen binnen de dezelfde bloedvat6kan variëren. In de huidige opzet, een enkele controlesysteem wordt gebruikt dat tegelijkertijd vier afzonderlijke stroom lussen kunt controleren. Voor labs moeten meer stroom lussen, is er ruimte in de speciale omgeving voor een extra systeem van toezicht.
RT-qPCR wordt gebruikt voor de absolute kwantificatie van genexpressie in de omgeving van shear stress. De relatieve uitdrukking van doelgenen wordt vaak gebruikt om RNA expressie van voorwaarden met elkaar vergelijken. Sommige soorten RNA kan bestaan in zeer lage hoeveelheden of afwezig, dus complicerende relatieve metingen. Bijvoorbeeld, kunnen lang noncoding RNAs in endotheliale cellen krachtige effecten op relatief lage moleculen per cel5uitoefenen. Bovendien kunnen verschillen in de efficiëntie van de primer leiden tot een onjuiste interpretatie met behulp van de delta-delta cyclus drempel (Ct) methode om de gegevens te analyseren. Om aan deze bezorgdheid, voeren wij absolute kwantificatie door het genereren van een standaard curve met behulp van een bekende hoeveelheid van plasmide DNA. Anderzijds complementaire DNA (cDNA)-synthese is een inefficiënt proces, en verschillen in cDNA efficiëntie kunnen goed zijn voor verschillen in RNA expressie tussen voorwaarden en monsters15. De toepassing van shear stress en/of transfectie reagentia kan beïnvloeden celproliferatie, apoptosis en levensvatbaarheid, of toevoegen van onderdelen die met isolatie en/of cDNA synthese van RNA interfereren kunnen. Om de mogelijkheid van bias van RNA isolatie en cDNA synthese te verklaren, gebruiken we een spike-in RNA besturingselement gesynthetiseerd in het lab, toegevoegd op het moment van RNA extractie en gemeten met elke cDNA synthese via RT-qPCR. Dit maakt niet alleen de aanpassing voor technische in RNA extractie en cDNA synthese verschillen, maar maakt het ook mogelijk de berekening van de absolute hoeveelheden per cel, wanneer het aantal cellen is bekend.
Dit systeem maakt gebruik van aanvullende stappen te handhaven gelijkenis of verantwoordelijk voor de technische verschillen tussen voorwaarden. Wij benadrukken bijzonder volgt vanwege de complexe aard van deze experimenten, waarbij meerdere fysieke set-ups en experimentele omstandigheden die tot experimentele variabiliteit leiden kunnen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm2 Culture Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Way Stopcocks</td>
			<td>Discofix</td>
			<td>D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEACH</td>
			<td>Darwin Chambers Company</td>
			<td>MN: HO85, SN: 4947549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Meter</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: P120, SN: 0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: C700, SN: 52852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) -/-</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (pure)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.20 um)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Dampener and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Console</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>T402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Tubing</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Reservoir and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensor</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>ME4PXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 737F Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FI-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J cloth</td>
			<td>J cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sterilization pouch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>92713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump (Masterflex L/S Economy Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7554-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head (Masterflex L/S Easy Load)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4 Well Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-08</td>
			<td>For #25 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-08</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockdown reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12252-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSP-luc+</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercoiled DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>N0472S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers

We beschrijven een workflow voor de analyse van genexpressie uit endotheliale cellen onder voorbehoud van een gestage laminaire stroom met behulp van meerdere gecontroleerde parallel-plaat stroom kamers. Endotheliale cellen vormen de cellulaire binnenbekleding van bloedvaten en chronisch worden blootgesteld aan de wrijvingskracht van de bloedstroom schuifspanning genoemd. Onder fysiologische omstandigheden, endotheliale cellen functie in aanwezigheid van verschillende shear stress omstandigheden. Dus, de toepassing van shear stress voorwaarden in in vitro modellen kan meer inzicht geven in endotheel reacties- in vivo. De zaal van de parallel-plaat stroom eerder gepubliceerd door Lane et al. 9 is aangepast aan het studeren endothelial genregulatie in de aanwezigheid en de afwezigheid van gestage (niet-Pulsatiele) laminaire flow. Belangrijke aanpassingen in de set-up voor laminaire flow zoals hier gepresenteerd omvatten een grote en toegewijde omgeving aan huis gelijktijdige stroom circuits, de monitoring van de stroomsnelheid in real-time, en het opnemen van een exogene referentie RNA voor de normalisatie van kwantitatieve real-time PCR-gegevens. Om te beoordelen meerdere behandelingen/voorwaarden met de toepassing van shear stress, worden meerdere stroom circuits en pompen gebruikt gelijktijdig binnen de dezelfde verwarmd en bevochtigde incubator. Het debiet van elk circuit van de stroom wordt gemeten voortdurend in real time op de standaardisering van shear stress voorwaarden tijdens de experimenten. Omdat deze experimenten meerdere voorwaarden hebben, gebruiken we ook een exogene referentie-RNA dat spiked-in op het moment van RNA extractie voor de normalisatie van RNA extractie en eerste-strand cDNA synthese efficiëntie. Volgt minimaliseren de variabiliteit tussen de monsters. Deze strategie is werkzaam in onze pijplijn voor de analyse van gen expressie met schuifspanning experimenten met behulp van de zaal parallel-plaat stroom, maar delen van deze strategie, zoals de exogene verwijst naar RNA spike-in, kunnen gemakkelijk en kosteneffectief worden gebruikt voor andere toepassingen.

Succesvolle linearisatie van luciferase plasmide met behulp van restrictie-enzymen werd bevestigd door lopende verteerd producten op een agarose gel (Figuur 1). De grootte van het gelineariseerde product werd bevestigd met behulp van DNA ladders en vergelijking met Onbesneden plasmide.
We hebben de parallel-plaat flow kamer set-up van Lane et al. aangepast 9 voor exp...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Gen expressie analyse van endotheliale cellen blootgesteld als u wilt schuintrekken Stress met behulp van meerdere parallelle-plaat Flow Chambers

Hier, wordt een workflow voor de cultuur en gen expressie analyse van endotheliale cellen onder vloeistof schuifspanning gepresenteerd. Inbegrepen is een fysieke schikking voor gelijktijdig huisvesting en bewaking van meerdere stroom kamers in een gecontroleerde omgeving en het gebruik van een exogene referentie RNA voor kwantitatieve PCR.

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van endotheelbiologie, zoals waarom bloedvaten regionale verschillen hebben in de ontwikkeling van atherosclerose? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het mogelijk maakt de gelijktijdige studie van meerdere aandoeningen onder schuifspanning of meerdere afschuifspanning voorwaarden. De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot het begrijpen van endotheel genregulatie in zowel de arteriële als veneuze systemen, omdat verschillende stroomsnelheden en patronen kunnen worden gebruikt.Hier tonen we een systeem dat gebruik maakt van een gestage laminaire stroming. De opstelling kan worden aangepast voor andere stroompatronen, waaronder verstoorde stroom. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn bij deze methode moeite hebben om een continue monolaag van cellen gedurende de duur van het experiment te behouden en consistente resultaten tussen experimenten te verkrijgen.24 uur voor de analyse, tel de menselijke endotheelcellen bij een vroege passage en zaad ongeveer één keer 10 tot de zesde cellen in één milliliter van middel op één fibronectin gecoate glasdia per put van een vier-goed celkweekplaat. Laat de cellen zich 15 minuten hechten aan de dia bij 37 graden Celsius. Bedek vervolgens elke dia met drie milliliter medium en plaats de plaat in de celcultuur incubator van 37 graden Celsius en 5% CO2 gedurende 24 uur.Vul op de dag van het experiment de waterbak van een grote, verwarmde, ingebouwde omgeving met verstelbare CO2 en warmte, of strandincubator, met meerdere planken, interne toegang tot elektriciteit en glazen deuren, en bevestig dat er voldoende kooldioxide beschikbaar is voor het experiment en dat de CO2-monitor functioneel is. Om het opzetten van de flow kamer, steek een 1/8 inch vrouwelijke lokken in een uiteinde van een nummer 16 zachte buis, en bevestig een vier-weg stopcock aan het aas. Bevestig het vrije uiteinde van de buis aan de instroomzijde van de bovenste plaat en steek een 1/8e inch mannelijke lokken in een uiteinde van een tweede nummer 16 zachte buis.Bevestig een vier-weg stopcock aan de mannelijke lokken, en bevestig het vrije uiteinde van de buis aan de uitstroom kant van de bovenste plaat. Steek een 1/8e inch mannelijke lokken en een 1/8e inch vrouwelijke lokken in elk uiteinde van een derde nummer 16 zachte buis, en bevestig de slang aan een bubble trap via de 1/8e inch mannelijke lokken. Bevestig vervolgens een vier-weg stopcock aan de andere kant van de slang via de vrouwelijke lokken.Met behulp van steriele pincet, breng een cel gezaaid glas dia naar de uitsparing op de bodemplaat, cel gezaaid kant omhoog. Gebruik een spuit van 10 milliliter om 10 milliliter warm medium toe te voegen aan de bodemplaat binnen de rode pakkingslijn rond de plaat. Waardoor medium door de dia kan stromen en de cellen kan bedekken.Plaats de bovenste plaat voorzichtig op de bodemplaat en zorg ervoor dat de zijkanten worden uitgelijnd en de platen stevig aan elkaar worden geschroefd. Om luchtbellen uit de bubbelval te verwijderen, open je eerst de instroom en bubble trap stopcocks en sluit je de uitstroomstopcock. Gebruik vervolgens een spuit van 30 milliliter om voorzichtig 20 milliliter warm medium door de plaat te spoelen.Als u bellen uit de kamer wilt verwijderen, sluit u de stopcock van de bellenval en opent u de uitstroomstopcock. Verhoog de uitstroomzijde van de kamer tot een hoek van 45 graden en gebruik de 30 milliliter spuit om voorzichtig 20 milliliter warm medium uit de instroomzijde van de kamer te spoelen. Het is belangrijk om met een passend tempo in de richting van de stroom te spoelen en microscoop te gebruiken om te bevestigen dat een confluent monolaag van cellen overblijft voordat de cellen worden blootgesteld aan de laminaire stroom.Sluit vervolgens de stopcocks aan beide zijden van de kamer en dop en bevestig dat de cellen nog steeds zijn bevestigd aan de dia onder een lichtmicroscoop. Plaats de stroomkamer en een eerder geassembleerde flow loop systeem in het strand en langzaam verminderen van de pomp snelheid van de flow lus assemblage voor het pauzeren van de pomp helemaal. Sluit de stopcocks op het flow loop systeem om lekkage te voorkomen en sluit het kamer- en lussysteem aan via stopcocks.Wanneer alle lussen zijn aangesloten, heropenen alle stopcocks en langzaam verhogen van de pomp snelheid tijdens het toezicht op de setup voor eventuele lekkage of blokkade. Plaats de stroomsensor op de buis van de kamerbrug van de instroomzijde van de kamer met de sensor in de richting van de stroom en pas de pompsnelheid aan om de stroomsnelheid voor de schuifspanningsrente te verkrijgen. Zet vervolgens de CO2-tank aan om een C02-concentratie van 5%te bereiken.Zodra de experimentele stroomperiode is voltooid, langzaam verminderen van de peristaltische pomp snelheid tot nul en zet het vermogen. Sluit snel alle open stopcocks en breng de kamer en de bijgevoegde slang met een stopcock aan elke kant naar een schone banktop. Maak voorzichtig alle schroeven los om de bovenste plaat te verwijderen en gebruik naaldneus pincet om de glazen schuif van de onderste plaat naar een schotel met een diameter van 100 millimeter over te brengen.Was de glijbaan in 10 milliliter koude PBS en controleer de cellen onder een microscoop om de hechting en uitlijning van cellen in de richting van de stroom te bevestigen. Breng na het animeren van de PBS de glijbaan over naar een schone schotel met een diameter van 100 millimeter en voeg 350 microliter lysebuffer toe, aangevuld met 1/100ste Beta-Mercaptoethanol van een RNA-extractiekit aan de glijbaan. Gebruik een polyethyleen bladed cel schraper om de cellen schraap van de dia en kantelen van de weefselkweek schotel om de buffer te poolen op de bodem.Gebruik tangen om de glijbaan te verwijderen en pipet de cel lysate in een 1,5 milliliter buis op ijs. Voeg vervolgens 10 microliter verdund luciferase RNA toe aan het cellysaat voor downstreamRNA-isolatie en -analyse volgens standaardprotocollen. Een succesvolle linearisatie van de luciferase plasmide met behulp van restrictieenzymen kan worden bevestigd door het uitvoeren van de verteerde producten op een agarose gel en de grootte van het line lineariseerde product kan worden bevestigd met DNA-ladders en in vergelijking met een onbesneden plasmid.Productieprocessen kunnen leiden tot kleine variaties in de kamerhoogte, dus het stroomsnelheid moet worden berekend voor elke kamer om dezelfde schuifspanning te bereiken. Voor experimenten met laminaire schuifstress in endotheelcellen van zoogdieren kan firefly luciferase RNA worden gebruikt als een exogene RNA-piek. Normalisatie van het endogene referentiegen, het exogene referentiegen en zowel endogene als exogene referentiegenen leveren samen vergelijkbare resultaten op.Van nota, in deze representatieve experimenten die twee gelijktijdig lopende stroomkamers met schuifspanning bij pascal bij één Pascal voor elk experiment gebruiken, leverde Kruppel als factor twee knockdown via SI-RNA een gelijkaardige knockdown efficiency tussen de geteste biologische steekproeven op. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden om een nog monolaag van cellen op de dia vast te stellen en om het stroomlussysteem te overvloedigen voordat de stroomkamer wordt bevestigd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals RNA-sequencing, worden gebruikt om genoombrede RNA-expressie te beoordelen en andere uitlezingen, zoals DNA en eiwit, kunnen worden gebruikt voor verdere moleculaire analyse.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van endotheelbiologie om de relatie tussen schuinspanning en angigeen potentieel in menselijke endotheelcellen te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Parallelle plaat flow kamer en Continuous Flow Circuit te endotheliale progenitorcellen Evalueer onder laminaire stroom Afschuifspanning

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Generatie afschuifhechting Kaart behulp SynVivo Synthetische Microvascular Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluïdische Flow Chambers behulp Gereconstitueerde Blood voor Model hemostase en bloedplaatjestransfusie<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Het ontwerpen van microfluïdische apparaten voor het bestuderen van cellulaire reacties Onder Single of bestaande chemische / Elektro / Shear Stress Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

Een protocol voor meerdere gene-knock-out in muizen, kleine darmorganen, met behulp van een CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Licht vel fluorescentie microscopie 4-dimensionale beelden van de gevolgen van het moduleren van Shear Stress op de ontwikkelingslanden Zebrafish hart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Cel analyse van Shear Stress voortleven Pseudomonas aeruginosa met behulp van een geautomatiseerde hoger-Throughput Microfluidic systeem

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Karakteriseren single-molecule conformatieveranderingen onder schuifstroom met fluorescentiemicroscopie

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...