Name: gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les IRSC MOP 142307 de p.a.M. H.S.J.M. est un bénéficiaire d’un programme en Regenerative Medicine Fellowship des instituts de recherche en santé du Canada formation. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. et M.K.D. sont destinataires de la Reine Elizabeth II bourses d’études supérieures dans les sciences et la technologie.

1. préparation d’ARN de référence exogène
Remarque : Choisissez une référence exogène d’ARN qui n’existe pas en l’espèce ou le modèle concerné. Pour les systèmes mammaliens, luciférase firefly RNA peut-être être utilisé.
<ol><li>
Linéarisation de plasmide exogène ARN de référence
	<ol>
<li>Préparer exogène référence RNA au moins 48 h avant l’extraction de l’ARN prévue. Obtenir ou fabriquer un clone cDNA de la référence choisie exogène ...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+patterning+by+STEEL,+an+endothelial-enriched+long+noncoding+RNA.">Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).</li><li>Won, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow.">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li><li>Baeyens, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+is+governed+by+a+VEGFR3-dependent+fluid+shear+stress+set+point.">Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point.</a> eLIFE. 4, 04645 (2015).</li><li>Davies, P. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+cell+mechanosensing:+New+insights+gained+from+biomimetic+microfluidic+models.">Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).</li><li>Resnick, N., Gimbrone, M. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+efficiency+of+double-stranded+DNA+formation+in+cDNA+synthesis+for+the+imprecision+of+microarray+expression+analysis.">Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis.</a> Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).</li><li>Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+gene+normalization+for+real-time+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+analysis+under+dynamic+endogenous+transcription.">Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription.</a> Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).</li><li>Vaughan-Shaw, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+overcome+the+inhibitory+effect+of+heparin+on+DNA+amplification.">A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification.</a> Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+and+extracellular+matrix+cues+regulate+the+mechanical+phenotype+and+stiffness+of+aortic+endothelial+cells.">Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3984 (2014).</li><li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).</li><li>Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR.">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li><li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior.">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li></ol>

Contrainte de cisaillement est un état physiologique qui module la fonction endothéliale, en partie, en affectant l’équilibre gene expression2,5. Modèles de régulation génique dans diverses conditions de contrainte de cisaillement contribuera à une meilleure compréhension de la fonction endothéliale. Ce flux de travail pragmatique inclut un circuit d’écoulement à l’aide d’une chambre à plaques parallèles flux adaptée de Lane et al. ...

Les cellules endothéliales vasculaires forment la paroi cellulaire interne des vaisseaux sanguins dans le système cardiovasculaire fermé des espèces supérieures. Ils forment l’interface entre le sang et les tissus et sont caractérisés par luminale et abluminal surfaces. L’endothélium est un système diversifié et actif adaptatif qui régule la circulation sanguine, traite des éléments nutritifs, l’immunité et la croissance du sang neuf navires1. Dans le corps, les cellules endothéliales présentent normalement dans un environnement où ils sont exposés à la force de frottement de la circulation, la contrainte de cisaillement2. Contrainte de cisaillement est un régulateur important de cellules endothéliales gene expression3, et les cellules endothéliales essaient de conserver la contrainte de cisaillement dans une plage donnée2,4. Les cellules endothéliales démontrent angiogénique patterning en l’absence de contrainte de cisaillement5 qui peuvent améliorer la perfusion tissulaire. Les modèles régionaux de flux perturbé et altéré la contrainte de cisaillement sont associées à l’expression des gènes inflammatoires6 et le développement de l’athérosclérose7,8. Ainsi, les modèles qui incluent la contrainte de cisaillement sont une composante majeure de la compréhension de la régulation génique endothéliale.
Nous décrivons une méthode pour étudier la régulation des gènes dans les cellules endothéliales vasculaires sous la contrainte de cisaillement. Ce système utilise des flux non pulsatile et imite fluide des contraintes de cisaillement et de la concentration d’oxygène cela État de modèle pour les cellules endothéliales artérielles. Ce protocole comprend les détails des méthodes pour la précipitation de gène à l’aide de l’interférence ARN (ARNi), la mise en place pour l’application de la contrainte de cisaillement à l’aide de l’appareil à plaques parallèles flux et méthodes pour la pointe d’une référence exogène RNA avant l’analyse par réaction en chaîne polymérase quantitative de transcriptase inverse (RT-qPCR). Cet oléoduc est utilisé pour l’étude de la régulation génique dans les cellules endothéliales en présence et en absence de contraintes de cisaillement laminaires et comprend une adaptation de l’appareil à plaques parallèles flux décrit par Lane et al. 9. cette configuration particulière a été conçue pour faciliter l’évaluation simultanée de multiples conditions expérimentales qui permet une comparaison directe des conditions de la contrainte de cisaillement, ainsi que la normalisation de l’analyse de la RNA. Une grande unité chauffée avec humidité contrôlée est utilisée pour permettre à plusieurs chambres de flux séparé et pompes s’exécute simultanément avec des débits surveillés pour chaque ensemble de chambre de flux en temps réel. L’application de cette mise en place est utilisée pour la précipitation de gène à l’aide d’Arni dans le cadre du flux laminaire/cisaillement, mais aspects du présent protocole peuvent être appliquées à toute évaluation de l’expression des RNA.
Des approches communes pour l’application de la contrainte de cisaillement pour les cellules endothéliales incluent de systèmes microfluidiques10un viscosimètre cône et plaque11et un flux de plaques parallèles chambre12. Les systèmes microfluidiques provenant de divers fabricants ont été utiles dans l’étude mécanobiologie et mécanotransduction dans plusieurs cellules et types de tissus et une variété de stimuli biophysiques. Pour les cellules endothéliales, ils ont été utilisés pour étudier les cellules endothéliales en isolement, ainsi que l’interaction des cellules endothéliales et le trafic d’immunitaire ou tumeur de cellules10. Toutefois, ces systèmes sont moins appropriés pour la récupération d’un grand nombre de cellules9. Le viscosimètre cône-et-plaque et chambres à plaques parallèles débit permettent la récupération d’un grand nombre de cellules en monocouches confluentes12. Ces systèmes peuvent générer une chaîne de cisaillement forces et tendances12. L’écoulement de plaques parallèles chambre Assemblée9 a l’avantage de cette imagerie en temps réel peuvent être effectuées par le biais de la fenêtre de verre afin d’évaluer la morphologie cellulaire à tout moment. En outre, le perfusat peut être recueilli dans des conditions stériles. Pour le système présenté ici, le flux peut être également surveillée en temps réel et dans une structure multichambre, qui facilite le maintien des conditions de cisaillement entre les chambres.
Pour des expériences représentatives, cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC), qui représentent un type de cellules endothéliales macrovasculaires, sont utilisés, et les conditions de contrainte de cisaillement que nous utilisons (1 Pa) reflètent des conditions artérielles (0,1 - 0,7 Pa). Toutefois, ce protocole peut être utilisé avec d’autres types de cellules endothéliales et les conditions de contrainte de cisaillement peuvent être ajustées selon la question expérimentale. Par exemple, l’évaluation des cellules endothéliales humaines dans des conditions qui modélisent la circulation veineuse nécessiterait des niveaux inférieurs de la contrainte de cisaillement (1-6 Pa) et des études qui modélisent la circulation microvasculaire ont utilisé des niveaux de contrainte de cisaillement de 0,4 - 1,2 Pa13 , 14. en outre, la contrainte de cisaillement peut varier même entre les cellules endothéliales dans les vaisseaux sanguins idem6. Dans la configuration actuelle, on utilise un système de surveillance unique qui peut surveiller simultanément les quatre boucles de flux séparé. Pour les laboratoires qui ont besoin de plusieurs boucles de flux, il y a l’espace dans l’environnement dédié pour un système de surveillance supplémentaire.
RT-qPCR est utilisé pour la quantification absolue d’expression des gènes dans le cadre de la contrainte de cisaillement. L’expression relative des gènes de cible est souvent utilisée pour comparer l’expression RNA dans l’ensemble des conditions. Certaines espèces d’ARN peut exister à très faibles quantités ou être absent, ce qui complique les mesures relatives. Par exemple, ARN long non codantes dans les cellules endothéliales peut exercer des effets puissants au nombre relativement faibles copies par cellule5. En outre, des différences dans l’efficacité de l’apprêt peuvent conduire à une interprétation erronée d’utiliser la méthode delta-delta de seuil (Ct) cycle pour analyser les données. Pour apaiser cette inquiétude, nous effectuons une quantification absolue en générant une courbe d’étalonnage à l’aide d’une quantité connue d’ADN plasmidique. En outre, synthèse de l’ADN (cDNA) complémentaire est un processus inefficace, et différences dans l’efficacité de l’ADNc peuvent tenir compte des différences dans l’expression de RNA entre conditions et entre échantillons15. L’application de la contrainte de cisaillement et/ou réactifs de transfection peut influer sur la viabilité, la prolifération cellulaire et l’apoptose, ou ajouter des composants qui peuvent interférer avec la synthèse de l’ARN l’isolation et/ou l’ADNc. Pour tenir compte de la possibilité de partialité de l’isolement et la synthèse de cDNA, nous utilisons un épi RNA contrôle synthétisés dans le laboratoire, a ajouté au moment de l’extraction de l’ARN et mesuré avec chaque cDNA synthèse via RT-qPCR. Cela permet non seulement de l’ajustement technique des différences dans la synthèse de l’ARN extraction et ARNC, mais permet aussi le calcul des quantités absolues par cellule, lorsque le nombre d’éléments est connu.
Ce système utilise des étapes supplémentaires pour maintenir la similitude ou de tenir compte des différences techniques entre les conditions. Nous insistons particulièrement sur ces étapes en raison de la nature complexe de ces expériences, qui impliquent de multiples configurations physiques et des conditions expérimentales qui peuvent conduire à la variabilité expérimentale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm2 Culture Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Way Stopcocks</td>
			<td>Discofix</td>
			<td>D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEACH</td>
			<td>Darwin Chambers Company</td>
			<td>MN: HO85, SN: 4947549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Meter</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: P120, SN: 0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: C700, SN: 52852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) -/-</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (pure)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.20 um)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Dampener and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Console</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>T402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Tubing</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Reservoir and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensor</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>ME4PXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 737F Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FI-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J cloth</td>
			<td>J cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sterilization pouch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>92713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump (Masterflex L/S Economy Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7554-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head (Masterflex L/S Easy Load)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4 Well Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-08</td>
			<td>For #25 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-08</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockdown reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12252-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSP-luc+</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercoiled DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>N0472S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers

Nous décrivons un flux de travail pour l’analyse de l’expression des gènes des cellules endothéliales sous réserve d’un flux laminaire régulier à l’aide de plusieurs chambres à flux surveillés de plaques parallèles. Les cellules endothéliales forment la paroi cellulaire interne des vaisseaux sanguins et sont exposés de façon chronique à la force de frottement de la circulation sanguine appelée contrainte de cisaillement. Dans des conditions physiologiques, la fonction de cellules endothéliales en présence de diverses conditions de contrainte de cisaillement. Ainsi, l’application des conditions de la contrainte de cisaillement dans des modèles in vitro peut fournir une meilleure compréhension de réponses endothéliales in vivo. La chambre à plaques parallèles flow précédemment publiée par Lane et al. 9 est adapté pour étudier la régulation génique endothéliale en présence et en absence de stable à flux laminaire (non pulsatile). Principales adaptations dans la mise en place pour un écoulement laminaire tel que présenté ici incluent un grand environnement dédié aux circuits de flux simultanés de maison, la surveillance des débits en temps réel et l’inclusion d’une référence exogène RNA pour la normalisation de données quantitatives de PCR en temps réel. Afin d’évaluer plusieurs traitements/conditions de l’application de la contrainte de cisaillement, plusieurs circuits de circulation et les pompes sont utilisées simultanément dans le même incubateur chauffé et humidifié. Le débit de chaque circuit d’écoulement est mesuré en continu en temps réel pour normaliser les conditions de la contrainte de cisaillement au cours des expériences. Parce que ces expériences ont plusieurs conditions, nous utilisons également un ARN exogène de référence qui est dopé au moment de l’extraction de l’ARN pour la normalisation de l’extraction de l’ARN et l’efficacité de la synthèse de cDNA de premier-brin. Ces mesures réduire la variabilité entre les échantillons. Cette stratégie est employée dans notre pipeline pour l’analyse de l’expression génique avec des expériences de la contrainte de cisaillement à l’aide de la chambre à plaques parallèles flow, mais certaines parties de cette stratégie, tels que l’exogène référencent RNA spike-dans, peuvent facilement et économiquement être utilisés pour autres applications.

Linéarisation réussie du plasmide luciférase à l’aide d’enzymes de restriction a été confirmée par les produits digérés en cours d’exécution sur un gel d’agarose (Figure 1). La taille du produit linéarisé a été confirmée à l’aide d’échelles d’ADN et par comparaison avec plasmide non circonci.
Nous nous sommes adaptés à l’installation de chambre de flux de plaques p...

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Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Analyse de l’Expression génique des cellules endothéliales exposées au Stress à l’aide de plusieurs chambres à plaques parallèles flux de cisaillement

Ici, un "workflow" pour la culture et la gène analyse de l’expression des cellules endothéliales sous la contrainte de cisaillement fluide est présenté. Inclus est un arrangement physique pour simultanément du logement et la surveillance des chambres de flux multiples dans un environnement contrôlé et l’utilisation d’un ARN exogène référence pour PCR quantitative.

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie endothéliale, comme pourquoi les vaisseaux sanguins ont-ils des différences régionales dans le développement de l’athérosclérose? Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étude simultanée de plusieurs conditions dans des conditions de cisaillement ou de multiples conditions de stress de cisaillement. Les implications de cette technique s’étendent vers la compréhension de la régulation des gènes endothéliales dans les systèmes artériel et veineux parce que divers taux et modèles de débit peuvent être utilisés.Eh bien ici, nous démontrons un système qui utilise un flux laminaire régulier. La configuration peut être adaptée à d’autres modèles d’écoulement, y compris le débit perturbé. En général, les personnes nouvelles à cette méthode auront du mal à maintenir un monocouche continu de cellules tout au long de la durée de l’expérience et d’obtenir des résultats cohérents entre les expériences.24 heures avant l’analyse, compter les cellules endothéliales humaines à un passage précoce et semer environ une fois 10 à la sixième cellule dans un millilitre de milieu sur une glissière de verre enduit de fibronectine par puits d’une plaque de culture cellulaire à quatre puits. Laissez les cellules adhérer à la lame pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Couvrez ensuite chaque toboggan de trois millilitres de milieu et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire de 37 degrés Celsius et de 5 % de CO2 pendant 24 heures.Le jour de l’expérience, remplissez le plateau d’eau d’un grand environnement chauffé et intégré de CO2 réglable et de chaleur, ou incubateur de plage, avec plusieurs étagères, accès à l’électricité interne et portes vitrées, et confirmez qu’un dioxyde de carbone adéquat est disponible pour l’expérience, et que le moniteur de CO2 est fonctionnel. Pour installer la chambre d’écoulement, insérez un leurre femelle de 1/8 pouce dans une extrémité d’un tube mou numéro 16, et fixez un robinet d’arrêt à quatre sens au leurre. Fixez l’extrémité libre du tube sur le côté d’entrée de la plaque supérieure et insérez un leurre mâle de 1/8e pouce dans une extrémité d’un deuxième tube mou numéro 16.Fixez un robinet d’arrêt à quatre sens au leurre masculin et fixez l’extrémité libre du tube au côté sortant de la plaque supérieure. Insérez un leurre mâle de 1/8e pouce et un leurre femelle de 1/8e pouce dans chaque extrémité d’un troisième tube mou numéro 16, et attachez le tube à un piège à bulles par l’intermédiaire du leurre mâle de 1/8e pouce. Attachez ensuite un robinet d’arrêt à quatre à l’autre extrémité du tube par l’intermédiaire du leurre femelle.À l’aide d’une pince stérile, transférer une glissière en verre ensemencé à cellule à l’évidement sur la plaque inférieure, côté cellulaire ensemencé vers le haut. Utilisez une seringue de 10 millilitres pour ajouter 10 millilitres de milieu chaud à la plaque inférieure dans la ligne de joint rouge autour de la plaque. Permettant au milieu de circuler à travers la lame et de couvrir les cellules.Placez délicatement la plaque supérieure sur la plaque inférieure en prenant soin d’aligner les côtés et visser les plaques ensemble étroitement. Pour éliminer les bulles d’air du piège à bulles, ouvrez d’abord les robinets d’arrêt de l’entrée et du piège à bulles et fermez le robinet d’arrêt sortant. Ensuite, utilisez une seringue de 30 millilitres pour rincer doucement 20 millilitres de milieu chaud à travers la plaque.Pour enlever les bulles de la chambre, fermez le robinet d’arrêt du piège à bulles et ouvrez le robinet d’arrêt sortant. Élever le côté sortant de la chambre à un angle de 45 degrés et utiliser la seringue de 30 millilitres pour rincer doucement 20 millilitres de milieu chaud du côté de l’afflux de la chambre. Il est important de rincer à un rythme approprié dans le sens du flux et d’utiliser le microscope pour confirmer qu’un monocouche confluent de cellules reste avant d’exposer les cellules au flux laminaire.Fermez ensuite les robinets d’arrêt des deux côtés de la chambre et du capuchon et confirmez que les cellules sont toujours fixées à la glissière sous un microscope léger. Placez la chambre d’écoulement et un système de boucle d’écoulement précédemment assemblé dans la plage et diminuez lentement la vitesse de la pompe de l’assemblage de la boucle d’écoulement avant de suspendre complètement la pompe. Fermez les robinets d’arrêt sur le système de boucle d’écoulement pour éviter les fuites et reliez le système de chambre et de boucle ensemble via des robinets d’arrêt.Lorsque toutes les boucles ont été raccordées, rouvrir tous les robinets d’arrêt et augmenter lentement la vitesse de la pompe tout en surveillant la configuration pour toute fuite ou blocage. Placez le capteur d’écoulement sur le tube de pont de chambre du côté d’entrée de la chambre avec le capteur orienté dans la direction du flux et ajustez la vitesse de pompe pour obtenir le taux d’écoulement pour le taux d’intérêt de stress de cisaillement. Ensuite, allumez le réservoir de CO2 pour atteindre une concentration de 5%C02.Une fois la période d’écoulement expérimentale terminée, diminuez lentement la vitesse de la pompe périssaltique à zéro et éteignez la puissance. Fermez rapidement tous les robinets d’arrêt ouverts et transférez la chambre et le tube attaché avec un robinet d’arrêt de chaque côté à un dessus propre de banc. Dévissez soigneusement toutes les vis pour enlever la plaque supérieure et utilisez des pinces à épiler pour transférer la glissière de verre de la plaque inférieure à un plat de 100 millimètres de diamètre.Lavez la lame en 10 millilitres de PBS froid et vérifiez les cellules au microscope pour confirmer l’adhérence et l’alignement cellulaires dans le sens de l’écoulement. Après avoir aspiré le PBS, transférer la diapositive dans un plat propre de 100 millimètres de diamètre et ajouter 350 microlitres de tampon de lyse complétés par 1/100e de bêta-mercaptoéthanol à partir d’un kit d’extraction d’ARN à la diapositive. Utilisez un grattoir à cellules à lame de polyéthylène pour gratter les cellules de la lame et incliner le plat de culture tissulaire pour permettre au tampon de se mettre en commun au fond.Utilisez des forceps pour enlever la glissière et pipette la cellule lysate dans un tube de 1,5 millilitre sur la glace. Ajoutez ensuite 10 microlitres d’ARN de luciferase dilué au lysate cellulaire pour l’isolement et l’analyse de l’ARN en aval selon les protocoles standard. Une linéarisation réussie du plasmide de luciferase utilisant des enzymes de restriction peut être confirmée en exécutant les produits digérés sur un gel d’agarose et la taille du produit linéarisé peut être confirmée avec des échelles d’ADN et par rapport à un plasmide non coupé.Les procédés de fabrication peuvent entraîner de petites variations de la hauteur de la chambre, de même que le débit doit être calculé pour chaque chambre afin d’atteindre le même stress de cisaillement. Pour des expériences incorporant le stress laminaire de cisaillement dans les cellules endothéliales mammifères, l’ARN luciferase de luciferase de lucifère de firefly peut être employé comme arrne exogène spike-in. La normalisation du gène de référence endogène, du gène de référence exogène et des gènes de référence endogènes et exogènes donne ensemble des résultats similaires.Fait à noter, dans ces expériences représentatives utilisant deux chambres d’écoulement simultanément en cours d’exécution avec un stress de cisaillement à un Pascal pour chaque expérience, Kruppel comme facteur deux knockdown via SI-ARN a donné une efficacité knockdown similaire entre les échantillons biologiques testés. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’établir un monocouche même des cellules sur la diapositive et de profuser le système de boucle d’écoulement avant d’attacher la chambre d’écoulement. Après cette procédure, d’autres méthodes, comme le séquençage de l’ARN, peuvent être utilisées pour évaluer l’expression de l’ARN à l’échelle du génome et d’autres réédages, tels que l’ADN et les protéines, peuvent être utilisés pour une analyse moléculaire plus poussée.Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie endothéliale pour explorer la relation entre le stress de cisaillement et le potentiel angiogénique dans les cellules endothéliales humaines.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Chambre de circulation à plaques parallèles et de circuit d&#39;écoulement continu pour évaluer les cellules progénitrices endothéliales en cisaillement du flux laminaire

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Recherche

Bio-ingénierie

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d&#39;analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

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Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

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Génération de cisaillement d&#39;adhésion Carte Utilisation SynVivo réseaux microvasculaires synthétique

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidique flux Chambers Utilisation de sang Reconstitué au modèle Hémostase et Platelet Transfusion<em&gt; In vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

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Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour capturer des Images 4-dimensionnelle des effets de modulation de la contrainte de cisaillement sur le coeur de poisson-zèbre en développement

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Cellule analyse de contrainte de cisaillement en direct sur Pseudomonas aeruginosa en utilisant un système automatisé de microfluidique de débit supérieur

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Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...