Name: gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch CIHR MOP 142307, P.A.M. H.S.J.M. ist ein Empfänger einer kanadischen Institute der Gesundheit Forschung Ausbildung in der regenerativen Medizin Gemeinschaft. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. und M.K.D. sind Empfänger von Königin Elizabeth II Graduate Stipendien in der Wissenschaft und Technik.

1. Vorbereitung des exogenen Referenz RNA
Hinweis: Wählen Sie eine exogene Referenz RNA, die nicht vorhanden ist in der Art oder des Modells von Interesse. Bei Säugetieren-Systemen kann Firefly Luciferase RNA verwendet werden.
<ol><li>
Linearisierung von exogenen Referenz RNA plasmid
	<ol>
<li>Bereiten Sie exogene Referenz RNA mindestens 48 Stunden vor der erwarteten RNA-Extraktion. Zu erhalten oder herstellen einen cDNA Klon der gewählten exogene Referenz RNA, wie ein Gl...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. 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D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR.">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li><li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior.">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li></ol>

Scherspannung ist eine physiologische Bedingung, die endotheliale Funktion teilweise moduliert durch Einwirkung auf stationären Gen Ausdruck2,5. Modelle der Genregulation in verschiedenen Schubspannung Bedingungen tragen zu einem besseren Verständnis der Endothelfunktion. Diese pragmatische Workflow umfasst eine Fluss-Schaltung mit einem Parallel-Platte Strömungsraum adaptiert von Lane Et al. 9 und stellt laminar, nicht pulsier...

Vaskuläre endotheliale Zellen bilden das zelluläre Innenfutter der Blutgefäße im geschlossenen Kreislauf der höheren Arten. Sie bilden die Schnittstelle zwischen Blut und Gewebe und zeichnen sich durch luminalen und abluminalen Oberflächen. Das Endothel ist eine vielfältige, aktive und adaptive System, die Durchblutung, Nährstoff Menschenhandel, Immunität und das Wachstum neuer Blutgefäße Schiffe1reguliert. Im Körper gibt es endotheliale Zellen normalerweise in einem Umfeld, wo sie die Reibungskraft der Zirkulation, Schubspannung2ausgesetzt sind. Scherspannung ist ein wichtiger Regulator der Endothelzellen Gen Ausdruck3, und Endothelzellen versuchen weiterhin Schubspannung innerhalb eines gegebenen Bereichs2,4. Endothelzellen zeigen angiogenen Musterung in Ermangelung der Schubspannung5 , die Gewebedurchblutung verbessern können. Regionale Muster der gestörten Strömung und veränderten Schubspannung sind der Ausdruck der entzündlichen Gene6 und die Entwicklung von Atherosklerose7,8zugeordnet. So sind Modelle, die Scherspannung enthalten ein Hauptbestandteil der endothelialen Genregulation zu verstehen.
Wir beschreiben eine Methode zur Untersuchung der Genregulation im vaskulären endothelialen Zellen unter Scherbelastung. Dieses System nutzt nicht pulsierende Strömung und imitiert Fluid Schubspannung Ebenen und Sauerstoffkonzentration, Modell Bedingungen für arterielle Endothelzellen. Dieses Protokoll enthält detaillierte Informationen zu Methoden für die Verwendung von RNA-Interferenz (RNAi), die Einstellung für die Anwendung der Schubspannung mit dem Parallel-Platte Fluss Apparate und Methoden für das Spike-in einer exogenen Referenz RNA vor der Analyse von Gen-knockdown Reverse-Transkriptase quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Diese Pipeline dient zur Genregulation in Endothelzellen in an- und Abwesenheit von laminar Schubspannung zu studieren und beinhaltet eine Anpassung des Parallel-Platte Fluss Apparates von Lane Et Al. beschrieben 9. dieses bestimmten Set-up wurde entwickelt, um die gleichzeitige Bewertung von mehreren experimentellen Bedingungen zu ermöglichen, die Scherspannung Bedingungen im direkten Vergleich sowie die Normalisierung der RNA Analyse ermöglicht. Eine große beheizte Einheit mit kontrollierter Luftfeuchtigkeit wird genutzt, um mehrere separate Strömung Kammern und Pumpen mit Flussraten für jede Kammer fließmontage in Echtzeit überwacht gleichzeitig ausgeführt werden können. Die Anwendung dieses Set-up ist für gen-Knockdown mit RNAi in der Umgebung von Laminar-Flow/Scherbeanspruchung verwendet, sondern Aspekte dieses Protokolls auf die Beurteilung der RNA Ausdruck angewendet werden können.
Gemeinsame Konzepte für die Anwendung der Schubspannung für Endothelzellen gehören mikrofluidischen Systemen10, ein Kegel-Platte-Viskosimeter11und eine Parallel-Platte Fluss Kammer12. Mikrofluidischen Systemen verschiedener Hersteller wurden nützlich beim Studium von Mechanobiology und mechanotransduktion in mehrere Zell- und Gewebetypen und eine Vielzahl von biophysikalischen reizen. Für Endothelzellen wurden sie zur Endothelzellen in Isolierung sowie das Zusammenspiel von Endothelzellen und des Menschenhandels immun oder Tumor Zellen10zu studieren. Diese Systeme eignen sich jedoch weniger für die Wiederherstellung einer großen Zahl von Zellen9. Die Kegel-Platte-Viskosimeter und Parallel-Platte Fluss Kammern ermöglichen die Wiederherstellung einer großen Anzahl von Zellen in konfluierende Monolagen12. Diese Systeme können eine Reihe von scher Kräfte und Muster12erzeugen. Die Parallel-Platte Fluss Kammer Versammlung9 hat den Vorteil, dass Echtzeit-Bildgebung durch die Glasscheibe auszuwertende zellulären Morphologie zu jedem Zeitpunkt durchgeführt werden kann. Darüber hinaus kann die Perfusat unter sterilen Bedingungen gesammelt werden. Für das hier vorgestellte System kann die Strömung auch überwacht werden, in Echtzeit und in ein Mehrkammer-Setup, das erleichtert die Wartung der Scherung Bedingungen zwischen den Kammern.
Für repräsentative Experimente dienen der menschlichen nabelader Endothelzellen (HUVECS), die eine vaskuläre Endothelzellen Art darstellen, und die Schubspannung Bedingungen, die wir verwenden (1 Pa) arterielle Bedingungen zu reflektieren (0,1 - 0,7 Pa). Jedoch dieses Protokolls kann andere Endothelzellen verwendet werden, und die Schubspannung Bedingungen eingestellt werden, nach experimentellen Frage. Beispielsweise die Bewertung der menschlichen Endothelzellen unter Bedingungen, die venösen Kreislauf Modell müssten geringere Scherbeanspruchung (1-6 Pa) und Studien, die mikrovaskuläre Zirkulation Modell verwendet haben Schubspannung Ebenen von 0,4 - 1,2 Pa13 , 14. Darüber hinaus Scherspannung kann sogar zwischen endothelial Zellen innerhalb der gleichen Blutgefäß6variieren. In der aktuellen Konstellation wird ein einzelnes monitoring-System verwendet, das kann vier separate Strömung Schleifen gleichzeitig überwachen. Für Labors, die mehr Strömung Schleifen benötigen, gibt es Raum in den dedizierten Umgebung für eine zusätzliche monitoring-System.
RT-qPCR dient die absolute Quantifizierung der Genexpression in der Einstellung der Schubspannung. Der relativen Ausdruck Zielgene dient oft RNA Ausdruck über Bedingungen zu vergleichen. Einige RNA-Spezies können bei sehr geringen Mengen vorhanden sind oder fehlen, so komplizieren relative Messungen. Zum Beispiel können lange Forensisches RNAs in Endothelzellen potente Effekte bei relativ geringen Kopienzahl pro Zelle5ausüben. Darüber hinaus können Unterschiede in der Effizienz der Grundierung zu eine ungenaue Interpretation führen von der Verwendung der Delta-Delta Zyklus Schwelle (Ct) Methode zum Analysieren der Daten. Um dieses Problem zu beheben, führen wir absolute Quantifizierung durch die Erzeugung einer Standardkurve mit einer bekannten Menge von Plasmid DNA. Darüber hinaus ergänzende DNA (cDNA)-Synthese ist ein ineffizienter Prozess, und Unterschiede in der Effizienz der cDNA können Unterschiede in RNA Ausdruck zwischen Bedingungen und Proben15entfallen. Die Anwendung der Schubspannung und/oder Transfektion Reagenzien kann beeinflussen, Zellproliferation, Apoptose und Lebensfähigkeit oder Hinzufügen von Komponenten, die RNA-Isolierung und/oder cDNA Synthese stören können. Um die Möglichkeit der Voreingenommenheit von RNA Isolation und cDNA Synthese berücksichtigen, verwenden wir ein Spike RNA Eingabesteuerelement im Labor synthetisiert, zum Zeitpunkt der RNA-Extraktion hinzugefügt und mit jeder cDNA Synthese über RT-qPCR gemessen. Dies ermöglicht nicht nur die Anpassung technische Unterschiede in RNA-Extraktion und cDNA Synthese, sondern ermöglicht auch die Berechnung der absoluten Mengen pro Zelle, wenn die Zellzahl bekannt ist.
Dieses System nutzt zusätzliche Schritte zur Aufrechterhaltung der Ähnlichkeit oder technische Unterschiede zwischen Bedingungen entfallen. Wir betonen vor allem diese Schritte aufgrund der Komplexität dieser Experimente, die beinhalten mehrere physische Set-ups und experimentellen Bedingungen, die experimentelle Variabilität führen kann.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm2 Culture Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Way Stopcocks</td>
			<td>Discofix</td>
			<td>D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEACH</td>
			<td>Darwin Chambers Company</td>
			<td>MN: HO85, SN: 4947549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Meter</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: P120, SN: 0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: C700, SN: 52852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) -/-</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (pure)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.20 um)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Dampener and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Console</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>T402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Tubing</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Reservoir and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensor</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>ME4PXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 737F Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FI-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J cloth</td>
			<td>J cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sterilization pouch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>92713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump (Masterflex L/S Economy Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7554-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head (Masterflex L/S Easy Load)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4 Well Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-08</td>
			<td>For #25 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-08</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockdown reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12252-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSP-luc+</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercoiled DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>N0472S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers

Wir beschreiben einen Workflow für die Analyse der Genexpression von Endothelzellen unterliegen einem stetigen Laminar-Flow mit mehreren Kammern überwachten Parallel-Platte Fluss. Endothelzellen bilden die innere zelluläre Auskleidung der Blutgefäße und die Reibungskraft des Blutflusses genannt Schubspannung chronisch ausgesetzt sind. Unter physiologischen Bedingungen, Endothelzellen Funktion in Anwesenheit von verschiedenen Schubspannung Bedingungen. So kann die Anwendung der Schubspannung in in-vitro- Modelle einen tieferen Einblick in Endothelzellen Antworten in Vivobieten. Die Parallel-Platte Strömungsraum zuvor von Lane Et Al. veröffentlicht 9 ist an Endothelzellen Genregulation in an- und Abwesenheit des stetigen (nicht pulsierender) Laminar-Flow zu studieren. Wichtige Anpassungen im Setup für laminare Strömung wie hier dargestellt sind eine große, engagierte Umgebung Haus gleichzeitige Fluss Schaltungen, die Überwachung der Fördermengen in Echtzeit, und die Aufnahme einer exogenen Referenz RNA für die Normalisierung der quantitative Echtzeit-PCR-Daten. Um mehrere Behandlungen/Bedingungen mit der Anwendung der Schubspannung zu beurteilen, werden mehrere Flow Schaltungen und Pumpen gleichzeitig innerhalb der gleichen beheizt und befeuchteten Inkubator verwendet. Die Durchflussmenge des jede Strömung Schaltung misst kontinuierlich in Echtzeit Schubspannung Bedingungen während der Experimente zu standardisieren. Da diese Experimente mehrere Bedingungen haben, verwenden wir auch eine exogene Referenz-RNA, die versetzt-in zur Zeit der RNA-Extraktion für die Normalisierung der RNA-Extraktion und erste Strang cDNA Synthese Effizienz ist. Diese Schritte minimieren die Variabilität zwischen den Proben. Diese Strategie ist in unserer Pipeline für die Gen-Expression-Analyse mit Schubspannung Experimente mit Parallel-Platte Strömungsraum eingesetzt, aber Teile dieser Strategie, wie die exogene RNA-Spike-in verweisen, können einfach und kostengünstig für verwendet werden andere Anwendungen.

Erfolgreiche Linearisierung der Luciferase Plasmid mit Restriktionsenzymen verdaut Produkte auf einem Agarosegel (Abbildung 1) bestätigt. Die Größe des linearisierten Produktes bestätigte mit DNA-Leitern und durch Vergleich mit unbeschnittenen Plasmid.
Wir haben den Parallel-Platte Fluss Kammer Aufbau von Lane Et Al. angepasst. 9 für Experimente, die mehrere Bed...

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Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen ausgesetzt um Stress mit mehreren Parallel-Platte Fluss Kammern Scheren

Hier ist ein Workflow für die Kultur und Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen unter Fluid Schubspannung präsentiert. Enthalten ist eine räumliche Anordnung für die gleichzeitig Gehäuse und Überwachung mehrerer Fluss Kammern in einer kontrollierten Umgebung und die Verwendung einer exogenen Referenz-RNA für die quantitative PCR.

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselweisen Fragen auf dem Gebiet der Endothelbiologie zu beantworten, wie zum Beispiel, warum haben Blutgefäße regionale Unterschiede in der Entwicklung von Arteriosklerose? Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die gleichzeitige Untersuchung mehrerer Bedingungen unter Scherspannung oder mehrfachen Scherspannungsbedingungen ermöglicht. Die Implikationen dieser Technik reichen auf das Verständnis der endotheliaalen Genregulation sowohl in den arteriellen als auch in venösen Systemen, da verschiedene Durchflussraten und Muster verwendet werden können.Nun, hier zeigen wir ein System, das einen stetigen laminaren Fluss verwendet. Das Setup kann für andere Strömungsmuster, einschließlich gestörter Strömung, angepasst werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten haben, während der gesamten Dauer des Experiments eine kontinuierliche Monoschicht von Zellen aufrechtzuerhalten und konsistente Ergebnisse zwischen den Experimenten zu erzielen.24 Stunden vor der Analyse zählen Sie die menschlichen Endothelzellen in einem frühen Durchgang und säen etwa ein mal 10 zu den sechsten Zellen in einem Milliliter Medium auf einen fibronectin beschichteten Glasschlitten pro Brunnen einer Vier-Well-Zell-Kulturplatte. Lassen Sie die Zellen 15 Minuten bei 37 Grad Celsius an der Folie haften. Dann bedecken Sie jede Rutsche mit drei Millilitern Medium und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator von 37 Grad Celsius und 5% CO2 für 24 Stunden.Füllen Sie am Tag des Experiments die Wasserwanne einer großen, beheizten, eingebauten Umgebung mit einstellbarem CO2 und Wärme oder Strand-Inkubator mit mehreren Regalen, internem Stromanschluss und Glastüren und bestätigen Sie, dass ausreichend Kohlendioxid für das Experiment zur Verfügung steht und dass der CO2-Monitor funktionsfähig ist. Um die Strömungskammer einzurichten, legen Sie einen 1/8 Zoll weiblichen Köder in ein Ende eines Weichenrohres der Zahl 16 ein und befestigen Sie einen Vier-Wege-Stoppamchen am Köder. Befestigen Sie das freie Ende des Rohres an der Zuflussseite der oberen Platte und legen Sie einen 1/8 Zoll männlichen Köder in ein Ende einer zweiten Zahl 16 weichen Rohr.Befestigen Sie einen Vier-Wege-Stoppamchen am männlichen Köder, und befestigen Sie das freie Ende des Rohres an der Abflussseite der oberen Platte. Legen Sie einen 1/8 Zoll männlichen Köder und einen 1/8 Zoll weiblichen Köder in jedes Ende einer dritten Zahl 16 weiches Rohr, und befestigen Sie die Schläuche an einer Blasenfalle über die 1/8 Zoll männlichen Köder. Dann befestigen Sie einen Vier-Wege-Hahn am anderen Ende der Schläuche über den weiblichen Köder.Übertragen Sie mit steriler Pinzette eine Zelle gesäte Glasrutsche in die Aussparung auf der Bodenplatte, zellgesät eatiert nach oben. Verwenden Sie eine 10 Milliliter Spritze, um 10 Milliliter warmes Medium auf die untere Platte innerhalb der roten Dichtungslinie um die Platte hinzuzufügen. Das Medium kann durch das Dia fließen und die Zellen abdecken.Legen Sie die obere Platte vorsichtig auf die Bodenplatte, um die Seiten auszurichten und die Platten fest zusammenzuschrauben. Um Luftblasen aus der Blasenfalle zu entfernen, öffnen Sie zuerst den Zufluss und Blasenfalle Stoppcocks und schließen Sie den Abfluss-Stopphahn. Dann verwenden Sie eine 30-Milliliter-Spritze, um 20 Milliliter warmes Medium vorsichtig durch die Platte zu spülen.Um Blasen aus der Kammer zu entfernen, schließen Sie den Blasenfalle-Stopphahn und öffnen Sie den Abfluss-Stopphahn. Heben Sie die Abflussseite der Kammer auf einen 45-Grad-Winkel und verwenden Sie die 30-Milliliter-Spritze, um 20 Milliliter warmes Medium sanft von der Zuflussseite der Kammer zu spülen. Es ist wichtig, mit einer angemessenen Rate in Richtung des Flusses zu spülen und das Mikroskop zu verwenden, um zu bestätigen, dass eine konfluente Monoschicht von Zellen verbleibt, bevor die Zellen dem laminaren Fluss aussetzen.Schließen Sie dann die Hahnen auf beiden Seiten der Kammer und Kappe und bestätigen Sie, dass die Zellen noch unter einem Lichtmikroskop am Dia befestigt sind. Legen Sie die Durchflusskammer und ein zuvor montiertes Durchflussschleifensystem in den Strand und verringern Sie langsam die Pumpendrehzahl der Durchflussschleifenbaugruppe, bevor Sie die Pumpe vollständig pausieren. Schließen Sie die Stopphähne am Durchflussschleifensystem, um Leckagen zu verhindern, und verbinden Sie das Kammer- und Schleifensystem über Stoppcocks miteinander.Wenn alle Schleifen angeschlossen sind, öffnen Sie alle Stoppcocks wieder und erhöhen Sie langsam die Pumpengeschwindigkeit, während Sie das Setup auf Leckagen oder Blockaden überwachen. Platzieren Sie den Durchflusssensor auf den Kammerbrückenschlauch der Zuflussseite der Kammer mit dem sensorisch in Strömungsrichtung ausgerichteten Sensor und passen Sie die Pumpengeschwindigkeit an, um den Durchfluss für die Scherspannung von Interesse zu erhalten. Schalten Sie dann den CO2-Tank ein, um eine Konzentration von 5% C02 zu erreichen.Sobald die experimentelle Durchflussperiode abgeschlossen ist, verringern Sie langsam die peristaltische Pumpengeschwindigkeit auf Null und schalten Sie die Leistung aus. Schließen Sie schnell alle offenen Hahnen und übertragen Sie die Kammer und die angeschlossenen Schläuche mit einem Stopphahn auf jeder Seite auf eine saubere Bankplatte. Lösen Sie vorsichtig alle Schrauben, um die obere Platte zu entfernen und verwenden Sie NadelNase Pinzette, um die Glasrutsche von der Bodenplatte auf eine Schale mit 100 Millimeter Durchmesser zu übertragen.Waschen Sie den Schlitten in 10 Milliliter kaltes PBS und überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Zellhaftung und Ausrichtung in Strömungsrichtung zu bestätigen. Nach dem Anspirieren des PBS den Schlitten auf eine saubere Schale mit 100 MillimeterDurchmesser übertragen und 350 Mikroliter Lysepuffer hinzufügen, ergänzt durch 1/100. Beta-Mercaptoethanol aus einem RNA-Extraktionskit auf den Dia. Verwenden Sie einen Polyethylen-Blatt-Zellschaber, um die Zellen vom Schlitten abzukratzen und die Gewebekulturschale zu kippen, damit sich der Puffer am Boden bündeln kann.Verwenden Sie Zangen, um den Schlitten zu entfernen und pipette die Zelle lysiert in eine 1,5 Milliliter Rohr auf Eis. Dann fügen Sie 10 Mikroliter verdünnter Luziferase-RNA in das Zelllysat für die nachgeschaltete RNA-Isolierung und -Analyse nach Standardprotokollen ein. Eine erfolgreiche Linearisierung des Luziferase-Plasmids mit Restriktionsenzymen kann durch ausführen der verdauten Produkte auf einem Agarosegel bestätigt und die Größe des linearisierten Produkts kann mit DNA-Leitern und im Vergleich zu einem ungeschnittenen Plasmid bestätigt werden.Fertigungsprozesse können zu kleinen Schwankungen der Kammerhöhe führen, so dass die Durchflussmenge für jede Kammer berechnet werden muss, um die gleiche Scherspannung zu erreichen. Für Experimente mit laminarem Scherstress in Säugetieren-Endothelzellen kann Galle-Luziferase-RNA als exogene RNA-Spike-in verwendet werden. Die Normalisierung des endogenerischen Referenzgens, des exoogenen Referenzgens, sowie der endogene und der exogenen Referenzgene zusammen führt zu ähnlichen Ergebnissen.Bemerkenswert ist, dass Kruppel in diesen repräsentativen Experimenten mit zwei gleichzeitig laufenden Strömungskammern mit Scherspannung bei einem Pascal für jedes Experiment eine ähnliche Knockdown-Effizienz zwischen den getesteten biologischen Proben ergab. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, eine gleichmäßige Monoschicht von Zellen auf dem Dia zu etablieren und das Durchflussschleifensystem vor dem Anbringen der Durchflusskammer zu überziehen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, wie die RNA-Sequenzierung, verwendet werden, um die genomweite RNA-Expression zu bewerten, und andere Auslesungen, wie DNA und Protein, können für weitere molekulare Analysen verwendet werden.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Endothelbiologie, um den Zusammenhang zwischen Scherstress und angiogenem Potenzial in menschlichen Endothelzellen zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

Parallel-Platten-Flow-Kammer und Continuous Flow Circuit endothelialen Vorläuferzellen unter Laminar Flow Schubspannung Bewerten

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Forschung

Biotechnik

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Erzeugung von Scherhaft Karte Mit SynVivo Synthetische mikrovaskuläre Networks

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

Entwerfen Mikrofluidiksysteme für ein Studium zellulären Reaktionen Unter Einzel- oder Coexisting Chemie / Elektro / Schubspannung Stimuli

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

Ein Protokoll für mehrfache Gen-Knockout in Maus-Dünndarm-Organoiden mit einem CRISPR-Concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Pseudomonas Aeruginosa mit einem automatisierten höheren Durchsatz mikrofluidischen System Zelle Analyse der Schubspannung weiterleben

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationsänderungen unter Scherfluss mit Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...