Name: gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers
Uploaded: 2018-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי CIHR מגב 142307 P.A.M. H.S.J.M. הוא הנמען של קנדי מוסדות של הבריאות מחקר תוכנית אימונים במלגת רפואה רגנרטיבית. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. ו- M.K.D. הם הנמענים המלכה אליזבת השנייה לתואר שני מלגות המדע והטכנולוגיה.

1. הכנת אקסוגני עזר RNA
הערה: בחר הפניה אקסוגני RNA שאינו קיים מינים או מודל של עניין. עבור מערכות יונקים, גחלילית לוציפראז RNA עשוי לשמש.
<ol><li>
לינאריזציה של פלסמיד אקסוגני עזר RNA
	<ol>
<li>להכין הפניה אקסוגני RNA לפחות 48 שעות לפני החילוץ RNA הצפויה. להשיג או לייצר שיבוט cDNA של שב?...

<ol>
	<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+heterogeneity.">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), (2012).</li><li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease.">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li><li>Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+activation+of+vascular+endothelium+as+a+determinant+of+its+functional+phenotype.">Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).</li><li>Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+disturbed+blood+flow+on+endothelial+cell+gene+expression:+a+role+for+changes+in+RNA+processing.">Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).</li><li>Man, H. S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+patterning+by+STEEL,+an+endothelial-enriched+long+noncoding+RNA.">Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).</li><li>Won, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+reduction+of+endothelial+nitric-oxide+synthase+expression+and+transcription+in+atherosclerosis-prone+regions+of+the+mouse+aorta+and+in+an+in+vitro+model+of+disturbed+flow.">Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow.</a> The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).</li><li>Baeyens, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+is+governed+by+a+VEGFR3-dependent+fluid+shear+stress+set+point.">Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point.</a> eLIFE. 4, 04645 (2015).</li><li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atherosusceptible+endothelium:+endothelial+phenotypes+in+complex+haemodynamic+shear+stress+regions+in+vivo.">The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo.</a> Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).</li><li>Lane, W. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel-plate+flow+chamber+and+continuous+flow+circuit+to+evaluate+endothelial+progenitor+cells+under+laminar+flow+shear+stress.">Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).</li><li>Gray, K. M., Stroka, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+cell+mechanosensing:+New+insights+gained+from+biomimetic+microfluidic+models.">Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).</li><li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress.">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).</li><li>Resnick, N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+are+complex+regulators+of+endothelial+gene+expression.">Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression.</a> The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).</li><li>Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+shear+stress+and+its+role+in+atherosclerosis.">Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis.</a> The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).</li><li>DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+shear+stress+on+iPSC-derived+human+brain+microvascular+endothelial+cells+(dhBMECs).">Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs).</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).</li><li>Thormar, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+efficiency+of+double-stranded+DNA+formation+in+cDNA+synthesis+for+the+imprecision+of+microarray+expression+analysis.">Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis.</a> Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).</li><li>Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+gene+normalization+for+real-time+reverse+transcription-polymerase+chain+reaction+analysis+under+dynamic+endogenous+transcription.">Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription.</a> Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).</li><li>Vaughan-Shaw, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+overcome+the+inhibitory+effect+of+heparin+on+DNA+amplification.">A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification.</a> Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).</li><li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haemodynamic+and+extracellular+matrix+cues+regulate+the+mechanical+phenotype+and+stiffness+of+aortic+endothelial+cells.">Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells.</a> Nature Communications. 5, 3984 (2014).</li><li>Fichtlscherer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease.</a> Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).</li><li>Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+reference+RNA+for+normalization+of+real-time+quantitative+PCR.">Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR.</a> Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).</li><li>Kohn, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+effects+of+matrix+stiffness+and+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+behavior.">Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).</li></ol>

מאמץ גזירה הוא מצב הפיזיולוגיות ממיקרו הפונקציה אנדותל, בחלקו, על-ידי המשפיעים על מצב יציב ג'ין ביטוי2,5. מודלים של הכונה בתנאים שונים של גזירה יתרום להבנה גדולה יותר של פונקציית אנדותל. זרימת עבודה מעשית זו כוללת מעגל זרימה באמצעות תא הזרימה במקביל-plate מקורי ...

תאי אנדותל כלי הדם בצורת תאי הציפוי הפנימי של כלי הדם במערכת הלב וכלי הדם הסגורה של מינים גבוה יותר. הם יוצרים את הממשק בין הדם לבין רקמות, מאופיינים luminal ומשטחים abluminal. אנדותל היא מערכת מגוונת, פעיל, והוא מסתגלת המווסת את זרימת הדם מזין סחר, חסינות, הצמיחה של כלי דם חדשים1. בגוף, תאי אנדותל קיימים בדרך כלל בסביבה שבה הם נחשפים לכוח חיכוך של מחזור הדם, גזירה2. גזירה הרגולטור חשוב של ביטוי גנים תא אנדותל3, תאי אנדותל לנסות לשמור על גזירה בתוך2,בטווח נתון4. תאי אנדותל מדגימים האנגיוגנזה תכנים בהעדר מאמץ גזירה5 שיכולות לשפר רקמות זלוף. דפוסים אזוריים של זרימה מופרעת, גזירה שינו משויכות הביטוי של גנים דלקתיים6 לבין התפתחות טרשת עורקים7,8. כך, דגמים הכוללים מאמץ גזירה הם מרכיב מרכזי להבנת הכונה אנדותל.
נתאר שיטת לימוד של הכונה בתאי אנדותל כלי הדם תחת גזירה. מערכת זו משתמשת זרימה פועמת ואת מחקה רמות הנוזלים גזירה, ריכוז חמצן את התנאים מודל עבור תאי אנדותל עורקי. פרוטוקול זה כולל פרטים על שיטות נוקאאוט גנטי באמצעות התערבות ב RNA (RNAi), הסידור של יישום באמצעות מכשירים במקביל-plate זרימה, שיטות ספייק-אין של אקסוגני הפניה RNA לפני הניתוח על ידי מאמץ גזירה תגובת שרשרת של פולימראז כמותית-טרנסקריפטאז (RT-qPCR). צינור זה משמש עבור הלומדים הכונה בתאי האנדותל הנוכחות ואת היעדר למינריות גזירה, כולל עיבוד של המנגנון הזרימה במקביל-plate מתוארת על ידי ליין. et al. 9. הגדרת המסוים הזה נועד לקדם את ההערכה בו זמנית של מספר תנאים ניסיוני המאפשר השוואה ישירה של תנאים גזירה, כמו גם את הנורמליזציה של RNA ניתוח. יחידה גדולה מחוממת עם מבוקרת לחות מנוצל כדי לאפשר זרימה נפרדת צ'יימברס מרובים, משאבות לנהל בו זמנית עם זרימה המחירים פיקוח להרכבה הקאמרית לכל הזרימה בזמן אמת. היישום של זה משמש נוקאאוט גנטי באמצעות RNAi בסביבה של זרימה שכבתית/גזירה, אך ניתן ליישם היבטים של פרוטוקול זה כל הערכה של RNA ביטוי.
גישות נפוצות היישום של גזירה עבור תאי אנדותל כוללים מערכות microfluidic10, עם מד צמיגות חרוט ופלייט-11קאמרית הזרימה במקביל-plate12. Microfluidic מערכות מיצרנים שונים היו שימושיים בלימוד mechanobiology ו- mechanotransduction תא מרובים, סוגי רקמות ואת מגוון רחב של גירויים ביופיזיקלי. עבור תאי אנדותל, הם שימשו ללמוד תאי אנדותל בידוד, כמו גם את האינטראקציה של תאי אנדותל וסחר של תאי החיסון או גידול10. עם זאת, מערכות אלו מתאימים פחות ההתאוששות של מספר גדול של תאים9. מד צמיגות קונוס-ו-plate והן במקביל-plate זרימה צ'יימברס לאפשר ההתאוששות של מספר גדול של תאים confluent monolayers12. מערכות אלה ניתן להפיק מגוון של הכוחות ודפוסי הטיה12. במקביל-plate זרימה קאמרית הרכבה9 יש את היתרון הזה הדמיה בזמן אמת יכול להתבצע דרך חלון זכוכית להערכת המורפולוגיה הסלולר בכל נקודת זמן. יתר על כן, ניתן לאסוף את perfusate בתנאים סטריליים. עבור מערכת המספרים המובאים כאן, הזרם ניתן גם לנטר בזמן אמת, מלכודת קאמרית מרובה, המאפשרת קיום התנאים הטיה בין צ'יימברס.
לניסויים נציג, הוא יפתור אנדותל תאים (HUVEC), אשר מייצגים סוג תאי אנדותל macrovascular, משמשים, ונשתמש התנאים גזירה (1 הרשות הפלסטינית) משקפים מצבים עורקי (0.1 - 0.7 הרשות הפלסטינית). עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם סוגי תאים אנדותל אחרים, התנאים גזירה יכול להיות מותאם על פי השאלה ניסיוני. לדוגמה, ההערכה של תאי אנדותל אדם תנאים בהם מודל מחזור ורידים ידרוש רמות נמוכות יותר של גזירה (Pa 1-6), מחקרים כי מודל זרימת microvascular נעזרו גזירה רמות של 0.4 - הרשות הפלסטינית 1.213 , 14. בנוסף, גזירה יכול להשתנות אפילו בין תאי אנדותל בתוך כלי דם באותו6. הסידור הנוכחי, מערכת מעקב יחיד משמש זה יכול לעקוב אחר בו זמנית ארבע לולאות זרם נפרד. עבור מעבדות צריכה לולאות זרם נוסף, יש שטח בסביבה ייעודית למערכת ניטור נוספים.
RT-qPCR משמש את כימות מוחלטת של ביטוי גנים בהגדרה של גזירה. הביטוי היחסי של הגנים יעד משמש לעתים קרובות כדי להשוות RNA הביטוי על-פני תנאים. מינים מסוימים RNA יכול להתקיים כמויות נמוכות מאוד או להיעדר, ובכך שמסבך מידות יחסית. לדוגמה, זמן noncoding RNAs בתאי האנדותל שיכולים להפעיל אפקטים חזק במספרים עותק נמוך יחסית לכל תא5. בנוסף, הבדלי יעילות פריימר יכול להוביל פרשנות שגויה של ניצול שיטת הסף (Ct) של מחזור דלתא-delta לנתח את הנתונים. כדי לטפל חשש זה, אנו מבצעים כימות מוחלטת על ידי יצירת עיקול רגיל באמצעות כמות ידועה של פלסמיד ה-DNA. יתר על כן, משלימים לסינתזת DNA (cDNA) הוא תהליך לא יעיל, הבדלים cDNA יעילות יכול להסביר הבדלים בביטוי RNA בין בתנאים ובין דגימות15. היישום של גזירה ו/או תרביות תאים ריאגנטים יכול להשפיע על התפשטות תאים אפופטוזיס, הכדאיות, או להוסיף רכיבים עלולים להפריע סינתזה RNA בידוד ו/או cDNA. להביא בחשבון האפשרות של הטיה מן הבידוד רנ א cDNA סינתזה, אנו משתמשים בספייק RNA פקד מסונתז במעבדה, הוסיף בזמנו של החילוץ-RNA, נמדד עם כל cDNA סינתזה ויה RT-qPCR. פעולה זו מאפשרת לא רק את ההתאמה טכני הבדלי סינתזה RNA חילוץ ו- cDNA אך גם מאפשר חישוב כמויות מוחלטת בכל תא, כאשר ספירת ידוע.
מערכת זו משתמשת צעדים נוספים כדי לשמור על דמיון או בחשבון הבדלים טכניים בין תנאי. שלבים אלה מודגשת במיוחד בגלל האופי המורכב של ניסויים אלה, בהם מעורבים מספר set-ups פיזי ותנאים ניסיוני זה יכול להוביל השתנות ניסיוני.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>gibco</td>
			<td>25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mm2 Culture Dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Way Stopcocks</td>
			<td>Discofix</td>
			<td>D500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEACH</td>
			<td>Darwin Chambers Company</td>
			<td>MN: HO85, SN: 4947549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Meter</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: P120, SN: 0342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>MN: C700, SN: 52852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15230-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS) -/-</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-22011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix</td>
			<td>Promo Cell</td>
			<td>C-39216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin (pure)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11051407001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.20 um)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Dampener and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Console</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>T402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Meter: 400 Series Tubing</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>TS410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Reservoir and Cap</td>
			<td>U of T glass blowing shop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensor</td>
			<td>Transonic Scisense Inc.</td>
			<td>ME4PXL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp 737F Oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FI-737F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J cloth</td>
			<td>J cloth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm)</td>
			<td>Fisherfinest</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper sterilization pouch</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>92713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump (Masterflex L/S Economy Drive)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7554-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head (Masterflex L/S Easy Load)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular 4 Well Dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06424-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06508-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-08</td>
			<td>For #25 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-24</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/8&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>30800-08</td>
			<td>For #16 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Male Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45518-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; Female Luer</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>45508-00</td>
			<td>For #14 tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knockdown reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligofectamine Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12252-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In vitro transcription </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Generuler 1kb+ DNA ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAclear Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSP-luc+</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E4471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supercoiled DNA Ladder</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>N0472S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Ethidium Bromide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England BioLabs Inc.</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene expression analysis of endothelial cells exposed to shear stress using multiple parallel-plate flow chambers

אנו מתארים זרימת עבודה עבור הניתוח של ביטוי גנים מתאי אנדותל בכפוף זרימה שכבתית קבועה באמצעות תאי זרימה במקביל-plate בפיקוח מרובים. תאי אנדותל ליצור תאי הציפוי הפנימי של כלי הדם, באופן כרוני חשופים לכוח חיכוך של זרימת הדם הנקרא גזירה. בתנאים פיזיולוגיים, תאי אנדותל פונקציה בנוכחות גזירה לתנאים שונים. לפיכך, היישום של גזירה תנאים במבחנה במודלים יכול לספק תובנות רבות יותר על תגובות אנדותל vivo בתוך. תא הזרימה במקביל-plate שפורסמו קודם לכן על ידי ליין. et al. 9 הוא מותאם ללמוד הכונה אנדותל הנוכחות ואת היעדר זרימה שכבתית (שאינם פועמת) קבוע. עיבודים מפתח בקביעת עבור זרימה שכבתית כפי שהוצג כאן כוללים סביבה גדול, ייעודי הבית זרימה בו-זמניות מעגלים, הפיקוח על המחירים זרימה ב בזמן אמת, והכללה של אקסוגני הפניה RNA על נירמול של נתונים כמותיים PCR בזמן אמת. כדי להעריך טיפולים/תנאים מרובים עם היישום של גזירה, זרימת החשמל מרובים, משאבות משמשים בו זמנית בתוך החממה מחוממת, humidified אותו. קצב הזרימה של כל מעגל זרימה נמדד באופן רציף בזמן אמת לתקנן את התנאים גזירה לאורך כל הניסויים. כי ניסויים אלה יש תנאים מרובים, אנו משתמשים גם של RNA אקסוגני עזר זה עלה בבזמנו של RNA חילוץ עבור נירמול של החילוץ-RNA, הראשון-strand cDNA סינתזה היעילות. השלבים למזער את השונות בין הדגימות. אסטרטגיה זו מועסק בצבר שלנו לניתוח ביטוי גנים עם גזירה ניסויים באמצעות תא הזרימה במקביל-צלחת, אבל חלקים של אסטרטגיה זו, כגון אקסוגני הפניה ספייק-ב-RNA, יכול בקלות, באופן חסכוני לשמש יישומים אחרים.

לינאריזציה מוצלחת של פלסמיד לוציפראז באמצעות אנזימי הגבלה אושר על-ידי מוצרי מתעכל פועל על ג'ל agarose (איור 1). הגודל של המוצר ליניארית אושר באמצעות סולמות DNA ו by comparison with פלסמיד נימולים.
לנו יש להתאים את הסידור קאמרית במקביל-plat...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers at JoVE.com

Gene Expression Analysis of Endothelial Cells Exposed to Shear Stress Using Multiple Parallel-plate Flow Chambers

ניתוח ביטוי גנטי של תאי אנדותל נחשף להטיית מתח באמצעות מרובות במקביל-plate זרימה צ'יימברס

כאן מוצג זרימת עבודה עבור ניתוח ביטוי תרבות, גנים של תאי אנדותל תחת גזירה נוזלים. כלול הוא סידור הפיזי בו זמנית דיור וניטור צ'יימברס מרובים זרימה בסביבה מבוקרת, את השימוש RNA אקסוגני עזר עבור ה-PCR כמותי.

We describe a workflow for the analysis of gene expression from endothelial cells subject to a steady laminar flow using multiple monitored parallel-plate ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ה אנדותל, כגון מדוע כלי הדם יש הבדלים אזוריים בהתפתחות טרשת עורקים? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת את המחקר בו זמנית של תנאים מרובים תחת לחץ גזים או תנאי מתח גזים מרובים. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת הבנת ויסות גנים אנדותל הן במערכות העורקים והן הווריד כי שיעורי זרימה ודפוסים שונים ניתן להשתמש.ובכן כאן, אנו מדגימים מערכת המשתמשת בזרימה למינארית יציבה. ניתן להתאים את ההתקנה לדפוסי זרימה אחרים, כולל זרימה מופרעת. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו לשמור על מונוליאר מתמשך של תאים לאורך כל הניסוי ולהשיג תוצאות עקביות בין ניסויים.24 שעות לפני הניתוח, לספור את התאים ה אנדותל האנושי במעבר מוקדם וזרע בערך פעם אחת 10 לתאים השישי במיליליטר אחד של מדיום על שקופית זכוכית מצופה fibronectin אחד לכל באר של צלחת תרבות תא ארבע באר. אפשר לתאים לדבוק בשקופית במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מכסים כל שקופית בשלושה מיליליטר של מדיום ומ מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא של 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 במשך 24 שעות.ביום הניסוי, מלאו את מגש המים של סביבה גדולה, מחוממת ומובנית עם CO2 וחום מתכווננים, או חממת חוף, עם מדפים מרובים, גישה פנימית לחשמל ודלתות זכוכית, ואשרו כי פחמן דו חמצני מתאים זמין לניסוי, ושהצג CO2 מתפקד. כדי להקים את תא הזרימה, הכנס פיתוי נשי בגודל 1/8 אינץ' לקצה אחד של צינור רך מספר 16, והצמד עצירה של ארבעה לפיתוי. חבר את הקצה החופשי של הצינור לצד הזרימה של הצלחת העליונה והכנס פיתוי גברי בגודל 1/8 אינץ ' לקצה אחד של צינור רך מספר 16 שני.חבר עצירה של ארבעה לפיתוי הגברי, והצמד את הקצה החופשי של הצינור לצד הזרימה של הצלחת העליונה. הכנס פיתוי זכר 1/8 אינץ ' ו 1/8 אינץ' נקבה לפתות לתוך כל קצה של צינור רך מספר שלישי 16, ולחבר את הצינורות למלכודת בועה באמצעות 1/8 אינץ ' פיתוי זכר. ואז לצרף stopcock ארבע דרך לקצה השני של הצינורות באמצעות הפיתוי הנשי.באמצעות פינצטה סטרילית, להעביר שקופית אחת זכוכית זרע תא להפסקה על הצלחת התחתונה, תא זרע צד למעלה. השתמש מזרק 10 מיליליטר להוסיף 10 מיליליטר של מדיום חם לצלחת התחתונה בתוך קו אטם אדום סביב הצלחת. מאפשר למדיום לזרום דרך השקופית ולכסות את התאים.מניחים בעדינות את הצלחת העליונה על הצלחת התחתונה דואגים ליישר את הצדדים ולבורג את הצלחות יחד בחוזקה. כדי להסיר בועות אוויר ממלכודת הבועה, פתח תחילה את עצירות הזרימה ומלכודת הבועות וסגור את עצירת הזרימה. לאחר מכן השתמש מזרק 30 מיליליטר כדי לשטוף בעדינות 20 מיליליטר של מדיום חם דרך הצלחת.כדי להסיר בועות מהתא, סגור את עצירת מלכודת הבועה ופתח את עצירת הזרימה. להעלות את צד הזרימה של התא לזווית של 45 מעלות ולהשתמש מזרק 30 מיליליטר כדי לשטוף בעדינות 20 מיליליטר של מדיום חם מהצד הזרימה של התא. חשוב לשטוף בקצב המתאים לכיוון הזרימה ולהשתמש במיקרוסקופ כדי לאשר שמונולר תאים קונפלנטי נשאר לפני חשיפת התאים לזרימת למינאר.לאחר מכן סגרו את העצורים משני צידי התא והכובע ותאשרו שהתאים עדיין מחוברים לשקופית תחת מיקרוסקופ אור. מניחים את תא הזרימה ואת מערכת לולאת זרימה שהורכבה בעבר לתוך החוף לאט להקטין את מהירות המשאבה של הרכבת לולאת הזרימה לפני השהיית המשאבה לגמרי. סגור את stopcocks על מערכת לולאת זרימה כדי למנוע דליפה ולחבר את התא ואת מערכת לולאה יחד באמצעות stopcocks.כאשר כל הלולאות היו מחוברות, לפתוח מחדש את כל stopcocks לאט להגדיל את מהירות המשאבה תוך ניטור ההתקנה עבור כל דליפה או חסימה. מניחים את חיישן הזרימה על צינורות גשר התא של צד הזרימה של התא עם החיישן מכוון לכיוון הזרימה ולהתאים את מהירות המשאבה כדי לקבל את קצב הזרימה עבור שיעור הלחץ הגזיר של ריבית. לאחר מכן הפעל את מיכל CO2 כדי להשיג ריכוז של 5%C02.לאחר השלמת תקופת הזרימה הניסיונית, הקטינו לאט את מהירות המשאבה ההיסטנטית לאפס וכבו את החשמל. סגור במהירות את כל stopcocks פתוח ולהעביר את התא ואת צינורות המצורפת עם stopcock מכל צד לראש ספסל נקי. בזהירות לפרוק את כל הברגים כדי להסיר את הצלחת העליונה ולהשתמש פינצטה האף מחט להעביר את החלקת הזכוכית מהצלחת התחתונה לצלחת בקוטר 100 מילימטר.לשטוף את השקופית ב 10 מיליליטר של PBS קר ולבדוק את התאים תחת מיקרוסקופ כדי לאשר דבקות התא ויישור בכיוון הזרימה. לאחר שאפת PBS, להעביר את השקופית לצלחת נקייה בקוטר 100 מילימטר ולהוסיף 350 microliters של מאגר תיזה בתוספת 1/100th של בטא-Mercaptoethanol מערכת מיצוי RNA לשקופית. השתמש מגרד תאים להב פוליאתילן כדי לגרד את התאים את השקופית להטות את צלחת תרבת הרקמות כדי לאפשר את המאגר בריכה בתחתית.השתמש במדפים כדי להסיר את השקופית ואת פיפטה התא lysate לתוך צינור 1.5 מיליליטר על קרח. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של RNA לוציפראז מדולל לתא lysate עבור בידוד RNA במורד הזרם וניתוח על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. ליניאריזציה מוצלחת של פלסמיד לוציפראז באמצעות אנזימי הגבלה ניתן לאשר על ידי הפעלת המוצרים המתעכלים על ג'ל אגרוז ואת גודל המוצר ליניארי ניתן לאשר עם סולמות DNA בהשוואה פלסמיד נימולים.תהליכי ייצור יכולים להוביל לשינויים קטנים בגובה התא, ולכן יש לחשב את קצב הזרימה עבור כל תא כדי להשיג את אותו מתח הגזלה. לניסויים המשלבים מתח גיזת למינאר בתאי אנדותל יונקים, RNA לוציפראז גחליל אש יכול לשמש ספייק-אין RNA אקסוגני. נורמליזציה של גן הייחוס האנדוגניים, גן הייחוס האקסוגני, וגם גנים התייחסות אנדוגניים ואאקסוגניים יחד מניבים תוצאות דומות.שימו לב, בניסויים ייצוגיים אלה באמצעות שני תאי זרימה הפועלים בו זמנית עם לחץ גזירה בפסקל אחד לכל ניסוי, קראפל כמו גורם שני נוקאאוט באמצעות SI-RNA הניב יעילות נוקאאוט דומה בין הדגימות הביולוגיות שנבדקו. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להקים אפילו monolayer של תאים על השקופית כדי שפע של מערכת לולאת זרימה לפני חיבור תא הזרימה. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות, כמו ריצוף RNA, ניתן להשתמש כדי להעריך ביטוי RNA רחב הגנום וקריאות אחרות, כגון DNA וחלבון, ניתן להשתמש עבור ניתוח מולקולרי נוסף.לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה האנדרותל לחקור את הקשר בין מתח גפיים לפוטנציאל אנגיוגני בתאי אנדותל אנושיים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

במקביל, צלחת תזרים לשכת ואת מעגל זרימה רציפה להערכת ובתאים אנדותל תחת מתח זרימה למינרית שאר

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

דור של שאר הידבקות מפה באמצעות רשתות כלי הדם סינטטיים SynVivo

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic זרימה צ&#39;יימברס שימוש מחדש דם למודל המוסטאסיס ואת טסיות עירוי<em&gt; במבחנה</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Designing Microfluidic Devices for Studying Cellular Responses Under Single or Coexisting Chemical/Electrical/Shear Stress Stimuli

עיצוב מכשירי microfluidic ללימוד ותגובות ניידות תחת בית או להתאבדות כימית / חשמל / שאר מתח גירויים

Microfluidic devices are capable of creating a precise and controllable cellular micro-environment of pH, temperature, salt concentration, and other ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

פרוטוקול של נוקאוט גנים מרובים עכבר קטן Organoids באמצעות CISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

מיקרוסקופ אור גיליונות זריחה כדי ללכוד תמונות 4-מימדי של השפעות להתכוונן גזירה על הלב דג זברה המתפתח

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

Live Cell Analysis of Shear Stress on Pseudomonas aeruginosa Using an Automated Higher-Throughput Microfluidic System

חיים תא ניתוח של גזירה על Pseudomonas aeruginosa באמצעות מערכת אוטומטית Microfluidic תפוקה גבוהה

A higher-throughput microfluidic in vitro bioreactor coupled with fluorescence microscopy has been used to study bacterial biofilm growth and morphology, ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

אפיון מולקולה חד-מולקולות באמצעות זרימת הטיה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...